イムノフェノ タイプと大量のフローサイトメトリーによる末梢血中のサイトカイン産生の単一細胞解析

この方法は、細胞の頻度の異常の特定や、自己免疫疾患の状況における主要なサイトカインの産生などの機能の違いなど、自己免疫分野の質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、簡単に入手できる末梢血サンプルから、幅広いレパートリーまたは異なる細胞タイプと機能の違いをキャプチャできることです。一般的に、このプロセスに不慣れな人は、血液処理ステップのタイミング、抗体パネルの設計、バーコード化プロセス自体、および高次元のシングルセルデータの分析に苦労する可能性があります。

このシステム免疫学のアプローチは、免疫調節不全が蔓延し、末梢血中に明らかなSLEのような自己免疫疾患に特に適しています。この方法を視覚的にデモンストレーションすることは、ステップのタイミングを明確にし、マスサイトメトリー解析の前に複数のサンプルをバーコード化してプールする方法を示すためにも重要です。この手順を開始するには、全血処理のための5つの異なる条件のラベル付き丸底ポリスチレンチューブをラックに置きます。

次に、各チューブに摂氏37度のRPMIの1ミリリットルを追加します。次に、各チューブに1ミリリットルの全血を加え、数回ピペットで上下させてRPMIと完全に混合します。続いて、10マイクロリットルの希釈済みルキソリチニブをT 6 plus five Rとラベル付けされたチューブに加え、十分に混合します。

チューブのラックをインキュベーターに摂氏37度で置き、インキュベーションのタイミングを開始します。Tゼロサンプルを処理するには、Tゼロチューブの全内容物を、20ミリリットルの37°C溶解/固定バッファーを含む標識された円錐管にピペットで移します。細胞の回収を最適化するには、チューブを溶解/固定バッファーですすぎ、円錐形のチューブを反転させて混合します。

細胞を摂氏37度で15分間インキュベートし、溶解と固定を可能にします。次に、細胞をGの500倍で室温で5分間遠心分離します。その後、上清をデカントし、細胞を1ミリリットルの氷冷PBSに再懸濁してペレットを分解します。

次に、円錐形のチューブをPBSで15ミリリットルの容量に充填します。その後、細胞をGの500倍で室温で5分間遠心分離します。細胞を1ミリリットルのCSMに再懸濁して、ペレットを分解します。

次に、サンプルを標識された微量遠心チューブに移し、抗体染色を行います。自動セルカウンターを使用して、10マイクロリットルのサンプルで細胞をカウントします。次に、細胞をGの500倍で室温で5分間遠心分離します。

その後、上清を吸引し、ペレットを約60マイクロリットルの残留物に残します。他の条件からのサンプルの処理が完了するまで、このペレットを氷上に置いておきます。Tが30分に等しいとき、チューブラックを組織培養フードに移します。

TシックスプラスR848チューブに10マイクロリットルあたり0.1グラムのR848を加え、よく混ぜます。次に、10マイクロリットルのLPSを1マイクロリットルあたり0.01マイクログラムでT six plus LPSチューブに加え、完全に混合します。その後、T six、T six plus five R、およびT six plus LPSとラベル付けされたチューブに4マイクロリットルのタンパク質輸送阻害剤を加え、Tが6時間になるまでサンプルをインキュベーターに戻します。

2時間ごとにP1000ピペットでサンプルを完全に混合します。Tが2時間に相当する場合、4マイクロリットルのタンパク質輸送阻害剤カクテルをT 6 plus R848チューブに追加します。すべてのサンプルを混合し、Tが6時間になるまでラックをインキュベーターに戻します。

Tが4時間になったら、P1000ピペットでもう一度サンプルを混合します。T が 6 時間に等しい場合、T ゼロ サンプルについて説明したように、T 6、T 6 と LPS、T 6 と R848、および T 6 と 5 つの R 血液サンプルチューブを処理します。その後、ペレットをマイナス80°CのCSM残量で保存し、後で処理します。

溶解した固定細胞をバーコード化するには、マイナス80°Cの貯蔵からサンプルを氷上でゆっくりと解凍します。10X Barcoding PermバッファーをPBSで1〜10希釈し、サンプルあたり3ミリリットル分のバッファーを作成します。1つの非滅菌トラフにCSMを充填し、もう1つにXバーコードパーマバッファーを充填します。

次に、解凍したばかりのサンプルに1ミリリットルの氷冷したCSMを加え、十分に混合し、事前にラベル付けされたそれぞれのポリプロピレンクラスターチューブに移します。次に、10マイクロリットルのサンプルを採取し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。各クラスターチューブ内の細胞数を正規化するには、余分な細胞の量を取り除きます。

次に、細胞をGの600倍で室温で5分間遠心分離します。マルチチャンネルピペットで1 X Barcoding Permバッファー1ミリリットルに細胞を再懸濁し、室温で5分間Gの600倍で遠心分離します。その後、上清を吸引します。

バーコードキーに示されているのと同じ順序でクラスターチューブをラックに並べて、サンプルがバーコードと一致するようにします。800マイクロリットルのX Barcoding Permバッファーをマルチチャンネルピペットでクラスターチューブ内のすべてのサンプルに添加し、細胞ペレットに触れずに細胞損失を減らします。次に、クラスターチューブと一緒にラックを脇に置きます。

20-plexパラジウムバーコードキットのチューブストリップをマイナス20°Cから取り外し、室温で解凍します。100マイクロリットルの1つのXバーコードパーマバッファーを追加し、十分に混合し、再懸濁したバーコードミックスの120マイクロリットルをクラスターチューブ内の対応する細胞サンプルに移します。マルチチャンネルピペットで十分に混合し、個別にバーコード化されたサンプル間の相互汚染がないようにします。

クラスターチューブを室温で30分間インキュベートし、バーコードで細胞を標識します。30分後、サンプルをGの600倍で室温で5分間遠心分離します。上清を吸引し、1ミリリットルのCSMに再懸濁します。

その後、遠心分離機にかけ、再度CSMに懸濁します。その後、室温でGの600倍で5分間遠心分離し、上清を吸引します。1つのピペットで、同じチップを使用して、約70〜80マイクロリットルの残留容量のすべての細胞ペレットを1本のポリスチレンチューブに移します。

ピペットチップをイジェクトしないでください。このチップでシングルピペットを脇に置きます。マルチチャンネルピペットと新しいチップを使用して、各元のクラスターチューブに100マイクロリットルのCSMを追加し、細胞の回収を最大化します。

チップを脇に置いたシングルピペットを使用して、100マイクロリットルの残量内のすべての細胞ペレットを同じポリスチレンチューブに移します。CSMを追加して、ポリスチレンチューブを約3ミリリットルに補充します。プールされたバーコードセットのセル番号をカウントして記録します。

その後、室温で600倍Gで5分間遠心分離し、上清を吸引します。同日にバーコード付きサンプルの染色に進みます。この概略図は、血液サンプルのアリコートの割り当て、刺激剤の添加タイミング、タンパク質輸送阻害剤カクテル、赤血球の溶解と固定までのインキュベーション時間など、末梢血サンプルの刺激と処理のワークフローを示しています。

刺激剤の選択は、評価の対象となるシグナル伝達経路とサイトカイン経路によって異なります。固定およびRBC溶解後、健康なドナーからの個々の溶解および固定細胞サンプルをバーコード化し、表面マーカーに対する26の抗体で標識し、透過処理し、サイトカインに対する14の抗体で染色しました。CD14高単球の同定を表す限定ゲーティング戦略をここに示します。

左から右に、表される各 2D プロットは、すぐ左の 2D プロットからゲートされた親母集団の母集団サブセットです。CD14高単球を8つの免疫細胞サブセットの代表として使用して、健康なドナーからの末梢血サンプルに対して、刺激を受けていない時間ゼロで、TLRアゴニストLPSとR848、およびT細胞活性化因子PMAイオノマイシンによる刺激後に、マスサイトメトリー分析を行いました。CD14高単球におけるサイトカイン誘導の一例が示され、使用される刺激剤に特異性を持つ選択されたサイトカインが示されています。

R848は、CD14高単球でIL-12p40サブユニットとMCP1を選択的に誘導しますが、LPSは誘導しません。対照的に、PMAイオノマイシンはCD14高単球にサイトカインを誘導しません。一度マスターすれば、血液刺激は約7時間で完了し、バーコード化のステップは約1時間で完了します。

この手順を試みるときは、手順のタイミングに注意し、それに応じて事前に計画を立てることが重要です。この手順が整ったら、自分の研究目的に特異的な免疫細胞応答を評価するために、マスサイトメトリーパネルの血液刺激条件を変更することを検討できます。このビデオを見れば、全血サンプルからサイトカイン反応を引き出す方法や、複数のサンプルをバーコードセットにプールしてマスサイトメトリー解析を行う方法について、十分に理解できるはずです。