Name: イムノフェノ タイプと大量のフローサイトメトリーによる末梢血中のサイトカイン産生の単一細胞解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: 学ぶ末梢血のサイトカイン産生をマスサイトメトリーで解析する方法。自己免疫疾患における免疫細胞の機能異常とサイトカイン産生の違いを単一細胞レベルで評価し、免疫制御異常の理解に貢献します。

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彼女の知的入力と有用なコメントがエイミー ピュー-ベルナールに感謝したいと思います。この作品は、生物医学研究賞のベッチャー財団ウェッブ waring 氏と番号 K23 1K23AR070897 NIH からエレナ大学院謝によって支えられました。彼女はまた子供の健康、スタンフォード CTSA UL1 TR001085 と子供の健康の研究のため受賞番号 K12 HD000850ユーニス · ケネディ · シュライバー国立研究所からの母子保健と人間開発とルシル Packard 財団によって支えられました。スタンフォード大学の研究所の大学。

ここで説明したすべてのメソッドで、コロラド州複数制度レビュー ボード (COMIRB) のコロラド州の大学を承認されています。フィルター処理されたピペット チップで、特記しない限り、滅菌のティッシュ文化フードの下すべての記載されている手順を実行すべき、すべて試薬フィルターします。
1. 末梢全血処理試薬の調製
<ol><li>準備 ruxolitinib ストック因数 (10-15 μ L/バイアルのシングルユース) 10 mM で製造元の指示に従って (-80 ° C で保存) DMSO で凍結乾燥試薬を希釈します。DMSO 濃度を 0.2% (巻/巻) 下処理コントロールを含むすべてのアッセイにおいて。</li>
	<li>R848 を準備 (resiquimod) 在庫因数 (10-15 μ L/バイアルのシングルユース) として滅菌水の凍結乾燥試薬を希釈して 1 μ g/μ L で、製造元の指示に従って。-80 ° C でストア</li>
	<li>製造元の指示に従って滅菌水の凍結乾燥試薬を希釈してリポ多糖 (LPS) ストック因数 (1 回のみ使用のバイアルあたり 5 μ L) 1 μ g/μ L でを準備します。-80 ° C でストア</li>
	<li>0.02% ナン30.5 %bsa、PBS を使用して細胞染色メディア (CSM) を準備します。</li>
	<li>取得し、タンパク質輸送阻害剤 (PTI) カクテル (資材表) を準備してください。</li>
	<li>解凍し、ruxolitinib ストック バイアル (10 mM) 1:10 滅菌 PBS (1 mM) で希釈します。ティッシュ文化フードの室温で置いておきます。</li>
	<li>解凍し、R848 株式バイアル (1 μ g/μ L) を 1:10 滅菌 PBS で希釈 (0.1 μ g/μ L)。ティッシュ文化フードの室温で置いておきます。</li>
	<li>解凍し、滅菌 PBS 中に組合ストック バイアル (1 μ g/μ L) の 1: 100 希釈 (0.01 μ g/μ L)。ティッシュ文化フードの室温で置いておきます。</li>
	<li>あらかじめ滅菌 RPMI (L-グルタミン) (少なくとも 10 分) の標準の 37 ° C の水浴中を温めます。</li>
	<li>1:5 でフィルター処理された ddH2O (作業濃度) (滅菌する必要はありません) または卓上 lyse/修正プログラム バッファーを希釈します。 注: 全血 1 mL 20 mL の溶解/修正プログラム バッファーの使用濃度が必要です。<ol>
<li>全血各 (少なくとも 100 mL) 1 mL の 5 条件の溶解/修正プログラム バッファーを作る。全血 (37 ° c まで必要な lyse/修正プログラム ソリューションを維持) の 1 ミリリットルあたり 50 mL の円錐管に lyse/修正プログラム バッファーの作業濃度の分注 20 mL。ラベルを次のように溶解/修正プログラム バッファーを含む円錐管の条件: T0 (時間 0) T6 + 5R (時間 6 h 5 uM ruxolitinib)、T6 + R848 (1 μ g/ml の R848 6 h を時間)、T6 + LP (0.1 μ g/mL lps 時間 6 h) T6 (時間 6 h)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ラベルの下部キャップ滅菌ポリスチレン管とステップは 1.10 と同じ名目で 1 mL 遠心チューブをラウンドします。</li>
</ol>2. 刺激し末梢全血 (図 1) の処理
<ol><li>ラウンド下ポリスチレン チューブ ステップ 1.11 から (T0、T6 + 5R、T6 + R848、T6 + LP、T6) ラックにラベルを配置します。 注: 次のすべての手順を行った管のこのタイプの指定がない限りティッシュ文化フードと無菌性を維持するためにインキュベータ間転送するときチューブをキャップします。</li>
	<li>チューブ (T0、T6 + 5R、T6 + R848、T6 + LP、T6) のそれぞれに 37 ° C RPMI (L-グルタミン) の 1 つの mL を追加します。数回、採血管を反転、各管に全血 1 mL を追加し、上下に数回 RPMI で徹底的にミックスするピペット、(RPMI で希釈は、6 時間の潜伏期間中に血液の凝集を防ぐ)。</li>
	<li>1:10 の 10 μ L を追加 T6 + 5R ruxolitinib。P1000 ピペットを徹底的にミックスします。37 ° C でインキュベーターでチューブのラックを置き、孵化のタイミングを開始 (T = 0)。</li>
	<li>T0 サンプルのように処理します。<ol>
<li>20 mL の 37 ° C 作業濃度溶解/修正プログラム バッファーを含むラベルの付いた円錐管にピペットの T0 管の全体の内容。細胞回復を最適化するためには、濃度溶解/修正プログラム バッファー管をすすいでください。円錐形の管を反転でミックスします。</li>
		<li>換散の固定できるように 15 分の 37 ° C で孵化させなさい。次の固定、ベンチトップでのすべての後続の手順を実行します。室温で 5 分間 500 x g で細胞を遠心します。</li>
		<li>上清をデカントします。1 mL の氷冷 PBS、ペレットを分割するのに細胞を再懸濁します、PBS で 15 mL のボリュームに円錐形を埋めます。</li>
		<li>室温で 5 分間 500 x g で細胞を遠心します。上清をデカントします。ペレットが赤い場合は、PBS 洗浄 (手順 2.4.3–2.4.4) を繰り返します。ペレットを分割し、抗体の汚損のためのラベル付き遠心管 (ステップ 1.11) に転送する CSM の 1 mL の細胞を再懸濁します。自動化された細胞カウンターまたは検定を使用してセルをカウントする 10 μ L のサンプルを取る。 注: すべてのセルがこの時点で固定されているため、性染色を含める必要はありません。</li>
		<li>室温で 5 分間 500 x g で細胞を遠心します。残気量の ~ 60 μ L のペレットを残して上清を吸引します。その他の条件からのサンプルは、処理が完了するまでは、このペレット氷の上を保ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>T = 30 分管ラック (ステップ 2.3) をティッシュ文化フードに移動し、以下を実行します。<ol>
<li>0.1 μ g/μ L の 10 μ L を追加 T6 + R848 R848。P1000 ピペットを徹底的にミックスします。</li>
		<li>T6 + LP に 0.01 μ g/μ LPS の 10 μ L を追加します。P1000 ピペットを徹底的にミックスします。</li>
		<li>T6、T6 と 5 r、T6 + (しかしないT6 + R848) LPS に蛋白質輸送阻害剤 (500 X の株式) の 4 μ L を追加し、インキュベーターに T までサンプルを返す = 6 h ミックス P1000 ピペットすべて 2 h で徹底的に。 注: R848 小 TLR アゴニストは、したがってその標的受容体へのアクセスを許可する蛋白質輸送阻害剤の添加で一時的な遅れが必要です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>T = 2 h タンパク質輸送阻害剤カクテル (500 X の株式) の 4 μ L を加える T6 + R848 チューブ。すべてのサンプルを混ぜて P1000 ピペットと T までインキュベーターにラックを返す = 6 h。</li>
	<li>T で 1 つのより多くの時間、P1000 でサンプルをミックス = 4 h。</li>
	<li>T = 6 h を T6、T6 + LP、T6 + R848、T6 処理 + 5R 血液サンプル チューブに記載手順 T0 サンプルの 2.4。</li>
	<li>細胞ペレットを将来の日付で処理する-80 ° C で残留の CSM のボリュームに格納します。また、バーコードと抗体染色を格納せずに進みます。</li>
</ol>3. バーコードの血液細胞の分離・固定
<ol><li>ゆっくりと氷上;-80 ° C のストレージから分離固定細胞サンプルを解凍します。最大 20 個のサンプルのユニークなバーコードでラベル付けできますが、このシステムを使用してプールします。1:10 と PBS; によって 10 の X barcoding パーマ バッファーを希釈します。サンプル 1 〜 3 mL の十分なバッファーを作る。</li>
	<li>CSM と 1 X barcoding パーマ バッファー 1 つ 1 つの非滅菌トラフを入力します。氷の 1 mL を追加し、新鮮なマスクのサンプルの冷たい CSM ピペット、徹底的に混ぜてし、それぞれ事前ラベルの付いたポリプロピレン クラスター チューブに転送。</li>
	<li>自動化された細胞カウンターまたは検定を使用してセルをカウントする 10 μ L のサンプルを取る。1.5-2 各クラスター チューブのサンプルあたり 10 の6セル × セル数を正規化: 削除し、余分な細胞は 2 x 10 の6セル上のボリュームを破棄します。</li>
	<li>室温で 5 分間 600 x g で細胞を遠心します。マルチ チャンネル ピペットと 600 x g で室温で 5 分間遠心 1 X barcoding パーマ バッファーの 1 mL の細胞を再懸濁します。上清を離れて吸い出しなさい。</li>
	<li>サンプルのバーコードと一致するようにバーコード キーに記載されている同じ順序でラックにクラスター チューブのラインアップします。マルチ チャンネル ピペットで 800 μ L 1 バーコード パーマ バッファー X を追加すると、セル損失を低減するピペット チップ (ない混合) と細胞ペレットに触れることがなくクラスター チューブのすべてのサンプル。クラスター チューブをラック置いておきます。</li>
	<li>-20 ° C と室温で融解から 20-プレックス Pd バーコード キット チューブ ストリップを削除します。1 X barcoding パーマ バッファーの 100 μ L を加えて混和、クラスター チューブ内の対応するセルのサンプル再懸濁バーコード ミックス 120 μ に転送。</li>
	<li>個別にバーコード サンプル間交差汚染がないように、マルチ チャンネル ピペットによって徹底的にミックスします。クラスター用セルのラベルにバーコードを許可する部屋の温度で 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>室温で 5 分間 600 × g で遠心分離機します。、上清を吸引し、CSM の 1 mL で再懸濁します。</li>
	<li>遠心分離機し、ステップ 3.8 のように再び CSM で再懸濁します。 注: 各サンプルに一意のバーコード ラベルが作成されました、サンプルはプールする準備ができています。</li>
	<li>室温で 5 分間 600 × g で遠心し、上清を吸引します。シングル ピペットと同じチップを使用して、転送 〜 70-80 のすべての細胞のペレット 1 ポリスチレン管 μ L 残気量。ピペットの先端をイジェクトしません。このヒントでシングル ピペット置いておきます。</li>
	<li>マルチ チャンネル ピペットと新しいヒント、細胞回復を最大化する各元のクラスター チューブに 〜 100 μ L CSM を追加します。脇に設定された先端の単一のピペットと同じポリスチレン管に 〜 100 μ L 残留量のすべての細胞のペレットを転送します。</li>
	<li>CSM をポリスチレン管 (〜 3 mL) を先頭に追加します。数とレコード プールされたバーコードのセルの数を設定します。室温で 5 分間 600 × g で遠心し、上清を吸引します。同じ日にバーコード サンプルを染色に進みます。 メモ: バーコード処理に 〜 20-30% のセル損失を期待することは正常です。</li>
</ol>4. バーコードの染色によって/血液細胞と分析のための準備に固定質量フローサイトメトリー装置
注: 各 1 X 抗体抗体の汚損 (1 μ L あたり 100 抗体の μ L 反応染色)、通常 3-4 x 10 の6セルを汚すことができます。したがって、すべてのバーコードのサンプルは 1 つの管にプールされるとき抗体の量をスケール アップする必要があります。バーコード サンプルがのみ、10 X 抗体価、各サンプルを個別に、染色ではなく抗体 (1 X あたりの 20 倍量を必要とするを必要がある場合は 30 x 106セル、および各 1 X 価 20 バーコード サンプル量は、3-4 x 10 の6セルを汚すことができる、個々 の管)。セル番号に抗体の濃度は、それぞれ個々 の抗体のカクテルの (ここでは説明しません) 慎重に滴定する必要があります。
<ol><li>表面の染色とサイトカイン誘導抗体 (資材表) を用いて細胞を染色します。<ol>
<li>カクテルを作る表面の汚損に追加と会計のピペッティング エラー量を計算することによって (すなわち、各サンプルの 2 x 10 の6セルの 20 のバーコード サンプルを汚す場合価染色 × 10 が必要です; 最終巻計算のため誤差を補正ピペッティング 10.5 X 最終的なソリューションを染色することによって)。</li>
		<li>バーコード細胞ペレットにボリュームを染色表面の価値がある 10 X を追加します。同じチップでのセル損失を減らすためにミックスし、表面の汚れと細胞ペレットの量を測定します。</li>
		<li>細胞と染色カクテルの量に基づいて、最終的な染色細胞サンプル (すなわち、20 サンプル、20 = 1 mL × 50 μ L のセットを実行している場合) 数あたり 50 μ L 量に CSM を追加します。4 ° C で 30 分間インキュベートします。染色を促進するサンプル 15 分毎を揺り動かしなさい。</li>
		<li>表面の汚れ、インキュベーション中に希釈 1:10 フィルター ddH2によって透過性、2 mL と 5 mL の洗浄のための o. 準備ボリューム パーマ/洗浄バッファー (材料表) を準備します。4 ° c または氷の上に保ちます。</li>
		<li>染色の CSM は、管表面の締めくくり、4 ° C で 600 x g で 5 分間遠心上清を吸引します。4 ° C、1:10 の 2 mL でバーコード サンプルを再懸濁します希釈パーマ/洗浄バッファー。完全にセルを permeabilize 20-30 分のための 4 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>4 ° C、5 分で 600 × g で遠心し、上清を吸引します。</li>
		<li>細胞内染色 (表面の汚損) に関しては同様の染色手順に従います。ただし、4 ° C、1:10 を使用して合計のセルの細胞内染色を通して permeabilizing の環境のまま、ボリュームを染色する CSM ではなく希釈パーマ/洗浄バッファー。</li>
		<li>細胞表面にカクテルの抗体染色と細胞ペレット (手順 4.1.2–4.1.17) グリセリンを追加します。携帯サンプル数あたり 50 μ L にボリュームを染色の合計をもたらします。4 ° C で 60 分間インキュベートします。染色できるようにサンプル 15 分毎を揺り動かしなさい。</li>
		<li>細胞内染色中インターカレーター ソリューションの準備: 900 μ L フィルター処理された PBS + フィルター 16% の 100 μ L の PFA (1.6% の最終的な集中 PFA) + 500 uM のインターカレーター色素 (材料表) の 0.2 μ L。</li>
		<li>パーマ/洗浄バッファー細胞ペレット + 細胞抗体カクテル冷たい 1:10 トップします。</li>
		<li>4 ° C、5 分で 600 × g で遠心し、上清を吸引します。CSM と染色したチューブの締めくくり。カウントし、細胞の数を記録します。4 ° C、5 分で 600 × g で遠心し、上清を吸引します。ステップ 4.9 からインターカレーター溶液 1 mL の細胞を再懸濁します。室温におけるインターカレーションで少なくとも 20 分間インキュベートまたは 4 ° C (インターカレーター ソリューションのサンプルが 4 ° C で最大 1 週間滞在質量フローサイトメトリー装置にそれらを実行する前に) で一晩します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>質量フローサイトメトリー装置のセルを準備します。<ol>
<li>フィルター処理された ddH2O、3 mL と 600 x g で 4 ° C で 5 分間遠心管の締めくくりこの懸濁液は破片や質量フローサイトメトリー装置を詰まらせる可能性があります可能性のある集計をすべて削除する 100 μ m フィルターを通過フィルター ddH2o. を渡す 3 mL のセルを再停止しなさい。</li>
		<li>カウントし、セルの番号後ろ過を記録します。600 x g で 4 ° C で 5 分間遠心</li>
	</ol>
</li>
	<li>1:10 フィルター ddH2o. でそれを希釈することによってビードのキャリブレーションソリューション (材料表) の準備します。</li>
	<li>ステンド グラス、再懸濁します 1:10 の必要なボリュームのセル希釈キャリブレーションソリューション ビーズ 〜 106セル/mL x 1 の細胞濃度を達成するために。 注: 45 μ L/分 CyTOF1、推奨される最適なは 5 x 10 の5セル/mL;30 μ L/分、7.5 x 105セル/mL でヘリオスの</li>
	<li>質量フローサイトメトリー装置9サンプルで実行に進みます。</li>
</ol>

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<li>Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMMUNOLOGY.+An+interactive+reference+framework+for+modeling+a+dynamic+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system.</a> Science. 349 (6244), 1259425(2015).</li>
<li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).</li>
<li>Jansen, K., Blimkie, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polychromatic+flow+cytometric+high-throughput+assay+to+analyze+the+innate+immune+response+to+Toll-like+receptor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation.</a> Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).</li>
<li>Zunder, E. R., Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li>
<li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+%28CyTOF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry Part A. , (2015).</li>
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<li>Finck, R., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).</li>
<li>Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry+panel+optimization+through+the+designed+distribution+of+signal+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).</li>
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ここで小説、単一セル、種類の免疫細胞を同時に評価し、患者の固有の"病原性「末梢血中循環要因環境の中で、さまざまなサイトカインの摂動を検出するプロテオミクスの手法について述べる。このメソッドでは、分析の車両と免疫細胞の表現型および機能異常の評価のためのツールとして質量フローサイトメトリー末梢全血を採用しています。メソッドは、人間およびマウス研究21、適用が容易ですし、シグナル伝達異常14の検出など、他の免疫機能解析と互換性が。
ユーザーは、このプロシージャの成功に影響を与えることができる変数の数を認識する必要があります。我々 の経験に基づいて、細胞内サイトカイン (データは示されていない) のベースライン誘導を避けるためにコレクションの 2 時間以内の血液サンプルに処理されます。採血する必要がありますまま室温 (25 ° C) で待っている間処理。血液を採取することができますいずれかのナトリウム ヘパリンまたは EDTA 管、説明アッセイに干渉することがなく。住んでいるし、死んだ細胞の差別...

自己免疫疾患は、罹患率と死亡率が人口の 3-8% に影響を与える主要な原因です。自己免疫疾患は若年・中年層の女性の間で死の主要な原因の中で、アメリカ合衆国 (年齢 < 65 歳)1,2。自己免疫疾患は、異機種混在の臨床プレゼンテーションと多様な基になる免疫学プロセスによって特徴付けられます。不均一性のスペクトルも共同参画慢性関節リウマチ (RA) と神経疾患多発性硬化症 (MS) などの別の疾患の間で表されます。ただし、このレベルの不均一性の全身性エリテマトーデス (SLE) など、単一の障害内例でも: 何人かの患者は腎病理呈することがある血液や共同関与3他の人苦しむ間。
自己免疫疾患の基になる回は自動とハイパー-アクティブ化の複数の自然免疫と適応免疫細胞サブセットおよびサイトカイン産生調節不全の合併を含む、臨床不均質をミラー化します。サイトカインは、自己免疫疾患の発症に重要な役割を果たす、間は病気のメカニズムでの特定の役割を理解することに挑戦すると証明しました。サイトカインの発現によって特徴付けられる (1 つのサイトカインは、異なる種類の細胞に複数の効果を持つことができます)、(多数のサイトカインが同じ効果を持つことができます) の冗長性、二元性 (1 つのサイトカインは、異なる条件の下でプロや抗炎症効果を持つことができます)、可塑性 (サイトカインはその「オリジナル」の 1 つは、環境に応じて異なる役割に成形することができます)4,5,6。その結果、人口レベルのメソッドは、同じ「サイトカイン ・ ミリュー」レスポンスの異種細胞を区別できません。同様に、免疫システム (単一の細胞型またはサイトカイン) の 1 つの特定の側面に焦点を当てる研究デザインは、複雑な自己免疫疾患に関連するすべての要素のグローバル アセスメントを提供していません。患者血清を用いた研究では、自己免疫に重要な洞察を与えている、間、調節不全サイトカインの検出の特定の細胞源は提供しません。
最近では、同時に複数の免疫細胞の種類を評価し、患者の固有の"病原性「末梢血中循環要因環境の中で、さまざまなサイトカインの摂動を検出する単一細胞プロテオミクス手法を開発しました。ここで説明したワークフローは、孤立した末梢血単核球 (PBMCs) ではなく、そのまま末梢全血サンプルの使用が特徴です。末梢全血を表します (すなわち、好中球、血小板)、自己免疫疾患および 2) 血漿中しばしば関与 1) 非単核白血球細胞を含む、全身性の免疫疾患を勉強する最も生理学的関連車両核酸、免疫複合体、サイトカインなどの要因を循環免疫活性化の役割があります。キャプチャする、"本質的な病原性「サイトカイン産生調節不全、末梢血サンプル処理直後に血液 (T0、時間ゼロ) とタンパク質輸送の 37 ° c (生理的体温) 6 時間後「本質的な」病気の状態 (図 1) を反映するサイトカイン産生 (蓄積、T6 T0) を検出する外因性刺激条件 (T6、時間 6 h)、不在の阻害剤。外因性物質と扱われる (タンパク質輸送阻害剤と 37 ° C で 6 時間培養) を上反映調節不全プロセスやシグナル伝達経路、病気に関連する免疫応答に関与する末梢血サンプルの下活性化研究サイトカイン産生核酸への応答を反映するを検出する (T6 + R848、時間 6 h 1 μ g/ml の R848)、SLE の場合フリー ダイヤル様受容体 (TLR) アゴニストなどの病気の発症を反映する条件を刺激 (対 T0、T6 T6 対の比較 +R848、図 1)。特定の患者のための免疫調節不全の正確なプロセスに関連する利用できる治療前のヴィヴォの免疫調節効果を勉強するには、末梢血サンプルは治療に関連する JAK 阻害で扱われています。濃度 (ここでは、5 uM ruxolitinib;T6 + 5R、時間 6 h 5 uM ruxolitinib)、(対 T0、T6 T6 対 + 5R、図 1) 薬物への応答で「本質的な」病気の状態の変化を検出します。JAK 阻害剤がラーなど自己免疫疾患の治療に成功するために示されているために、この研究のため選ばれたの JAK 阻害剤
同時に複数の免疫細胞のサブセットは、sle 患者末梢血サンプルで説明した調節不全のプロセスを評価するには、患者と健常者だった前述の処理し、質量フローサイトメトリーで分析します。として知られているフローサイトメトリー-飛行時間型の質量フローサイトメトリーはスペクトルの問題7,8,9の重複なし 40 を超えるパラメーターの単一細胞解析を提供しています。この手法は、行きの抗体の同時10の代わりにタグとして水溶性の金属イオンの形で希土類金属の同位体を利用しています。リチャードライポルトらとマッカーシーらの (すなわち、チューニングし校正、サンプルの収集) 質量フローサイトメトリーの技術プラットフォームに関する詳細を見つけることができます。11,12質量フローサイトメトリーの高次元単一セルの粒度 (材料表) と自然免疫と適応免疫の細胞のサブセットの中で複数のサイトカインの同時測定が可能。 にします。
従来の臨床的および検査パラメーターを現在は多くの場合機密情報や継続的な疾患活動性または特定免疫13より根本的な免疫を線引きする必要性を反映する応答を検出するために十分に特定再燃をドライブの変更。自己免疫疾患におけるサイトカイン調節不全の普及を考えると、抗体または小分子阻害剤サイトカインをターゲットやサイトカイン産生の調節に関与するタンパク質のシグナルを使用する処置のアプローチの茄多があります。最近浮上しました。その基本的な形式では、ここで説明した末梢血分析アプローチは、患者固有の調節不全の細胞のサブセットと全身症状と自己免疫疾患での異常なサイトカイン生産を識別するためのプラットフォームを提供します。この方法により治療法の選択の個人用設定を特定の調節不全サイトカインを識別できるとオプションは、特定の治療法をテスト immunomodulate する能力を評価するためにex vivo患者特定疾患プロセス。

<table><tbody><tr><td>ルキソリチニブ</td><td>サンタ クルス</td><td>SC-364729A</td><td>ストック濃度: 10 mM;ファイナルコンク:5 &mu;M</td></tr><tr><td>R848</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-r848-5</td><td>ストック濃度: 1 &mu;g/&mu;L;最終濃度: 1 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>LPS-EK</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-eklps</td><td>ストック濃度: 1 &mu;g/&mu;L;最終濃度: 0.1 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>滅菌 PBS</td><td>ロンザ</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Lyse/Fix バッファー</td><td>BD biosciences</td><td>558049</td><td>Stock Conc: 5X;最終濃度: 1X (ddH2O で希釈)</td></tr> <tr><td>BD Phosflow perm/wash buffer I</td><td>BD biosciences</td><td>557885</td><td>Stock Conc: 10X;最終濃度: 1:10 (ddH2O で希釈)</td></tr> <tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8032</td><td>ストック濃度: >99.9%;最終濃度:0.0002</td></tr><tr><td>タンパク質輸送阻害剤(PTI)</td><td>eBiosciences</td><td>00-4980-93</td>ストック<td>濃度:500X;最終濃度: 1X</td></tr><tr><td>DNA Intercalator</td><td>Fluidigm</td><td>201192B</td><td>ストック濃度: 500 &mu;M;最終濃度: 0.1 &mu;M</td></tr><tr><td>細胞染色培地 (CSM)</td><td></td><td></td><td>PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3</td></tr><tr><td>MaxPar バーコード パーマバッファー</td><td>Fluidigm</td><td>201057</td><td>Stock Conc: 10X;最終濃度: 1X</td></tr><tr><td>20-plex PD バーコード セット</td><td>Fluidigm</td><td>S0014</td><td>ストック濃度: N/A;最終濃度: n/a</td></tr><tr><td>EQ TM 4 要素キャリブレーション ビーズ</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td>ストック濃度: 10X;最終濃度:1X</td></tr><tr><td>16%MeOHフリーホルムアルデヒド溶液</td><td>Thermo</td><td>28908</td><td>ストック濃度:16%(w / v);最終濃度:1.6%(w / v)</td></tr><tr><td>滅菌丸底ポリスチレンチューブVWR</td><td></td><td>60818-496</td><td>ストック濃度:なし / a;最終濃度: 該当なし</td></tr><tr><td>ポリプロピレン クラスター チューブ</td><td>ライト ラボ</td><td>A-9001</td><td>ストック濃度: 該当なし;最終濃度: n/a</td></tr><tr><td>Helios CyTOF装置</td><td>Fluidigm</td><td>Helios</td><td>CyTOF分析で使用するすべての溶液は、金属汚染がない必要があります。ddH2Oは、溶液の調製に使用されるものはすべて、少なくとも18.0 M&Omega;の抵抗率を持つ必要があります。ddH2Oおよび自己調製溶液は、オートクレーブ滅菌されていない新しいプラスチックまたはガラス瓶に保管する必要があります。</td></tr><tr><td>Name</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Mass Cytometryに使用される抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surface markers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1c</td><td>Biolegend</td><td>L161</td><td>Mass: 161</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD</td><td>UCHT1</td><td>質量:144</td></tr><tr><td>CD4</td><td>Biolegend</td><td>SK3</td><td>質量:174</td></tr><tr><td>CD7</td><td>BD</td><td>M-T701</td><td>質量:149</td></tr><tr><td>CD8</td><td>Biolegend</td><td>SK1</td><td>質量:142</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Fluidigm</td><td>ICRF44</td><td>質量:209</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BD</td><td>B-ly6</td><td>質量:152</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD</td><td>HI98</td><td>質量:115</td></tr><tr><td>CD14</td><td>Biolegend</td><td>M5E2</td><td>質量:154</td></tr><tr><td>CD16</td><td>eBioscience/Thermo</td><td>B73.1</td><td>質量:165</td></tr><tr><td>CD19</td><td>Santa Cruz</td><td>SJ25C1</td><td>質量:163</td></tr><tr><td>CD21</td><td>Biolegend</td><td>Bu32</td><td>質量:141</td></tr><tr><td>CD27</td><td>BD</td><td>L128</td><td>質量:155</td></tr><tr><td>CD38</td><td>Fluidigm</td><td>HIT2</td><td>質量:172</td></tr><tr><td>CD45 total</td><td>Biolegend</td><td>HI30</td><td>質量:89</td></tr><tr><td>CD45RA</td><td>Biolegend</td><td>HI100</td><td>質量:153</td></tr><tr><td>CD56</td><td>Miltenyi</td><td>REA196</td><td>質量:168</td></tr><tr><td>CD66</td><td>BD</td><td>B1.1/CD66</td><td>質量:113</td></tr><tr><td>CD86</td><td>Fluidigm</td><td>IT2.2</td><td>質量:150</td></tr><tr><td>CD123</td><td>Fluidigm</td><td>6H6</td><td>質量:143</td></tr><tr><td>CD278/ICOS</td><td>Biolegend</td><td>C398.4A</td><td>質量: 156</td></tr><tr><td>CD179/PD1</td><td>Biolegend</td><td>EH12.2H7</td><td>質量: 162</td></tr><tr><td>IgD</td><td>Biolegend</td><td>IA6-2</td><td>質量: 146</td></tr><tr><td>IgM</td><td>Biolegend</td><td>MHM-88</td><td>質量: 151</td></tr><tr><td>CXCR5</td><td>BD</td><td>RF8B2</td><td>質量: 173</td></tr><tr><td>HLADR</td><td>Biolegend</td><td>L243</td><td>質量: 167</td></tr><tr><td>Cytokines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-1&alpha;</td><td>バイオレジェンド</td><td>364-3B3-14</td><td>質量:147</td></tr><tr><td>IL-1&ベータ;</td><td>バイオレジェンド&nbsp;</td><td>H1B-98</td><td>質量:169</td></tr><tr><td>IL-1RA</td><td>サンタクルス&nbsp;</td><td>AS17</td><td>質量: 157</td></tr><tr><td>IL-6</td><td>バイオレジェンド</td><td>MQ2-13A5</td><td>質量: 164</td></tr><tr><td>IL-8</td><td>BD</td><td>E8N1</td><td>質量: 160</td></tr><tr><td>IL-12/IL-23p40</td><td>バイオレジェンド&nbsp;</td><td>C8.6</td><td>質量:171</td></tr><tr><td>IL-17A</td><td>バイオレジェンド&nbsp;</td><td>BL168</td><td>質量: 148</td></tr><tr><td>IL23p19</td><td>eBioscience/Thermo</td><td>23dcdp</td><td>質量: 176</td></tr><tr><td>MIP1&beta;</td><td>BD</td><td>D21-1351</td><td>質量:158</td></tr><tr><td>MCP1</td><td>BD</td><td>5D3-F7</td><td>質量:170</td></tr><tr><td>IFN&alpha;</td><td>ミルテニー&nbsp;</td><td>LT27:295</td><td>質量:175</td></tr><tr><td>IFN&γ;</td><td>バイオレジェンド</td><td>4S。B3</td><td>質量:165</td></tr><tr><td>PTEN</td><td>BD</td><td>A2B1</td><td>質量:159</td></tr><tr><td>TNF&alpha;</td><td>Biolegend</td><td>Mab11</td><td>Mass: 166</td></tr><tr><td>注: メーカーがFluidigmと記載されている場合、この抗体はFluidigm社から金属をプレコンジュゲートして購入しました。メーカーがFluidigm以外と記載されている場合、この抗体はMaxPar Multi-Metal Labeling&nbsp;を使用して自己標識されています。キット (Fluidigm Cat: 201300) 製造元のプロトコルに準拠。&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

イムノフェノ タイプと大量のフローサイトメトリーによる末梢血中のサイトカイン産生の単一細胞解析

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

サイトカインは、自己免疫疾患の発症に重要な役割を果たします。したがって、サイトカインの測定以降自己免疫自己寛容の崩壊へとつながる正確なメカニズムを理解する試みの複数の研究の焦点となっています。アプローチはこれまで免疫システム (単一または少数細胞の種類またはサイトカイン) の 1 つの特定の側面に関する研究に基づいているし、複雑な自己免疫疾患の世界的な評価を提供していません。患者血清を用いた研究では、自己免疫に重要な洞察を与えている、間、調節不全サイトカインの検出の特定の細胞源は提供しません。循環要因、「本質的な」患者固有のプラズマのコンテキスト内で、複数の免疫細胞サブセットにおけるサイトカイン産生を評価する包括的な単一セルのアプローチを紹介します。このアプローチにより、患者固有の免疫表現型 (表面マーカー) の監視といずれかのネイティブ関数 (サイトカイン)"組み込み病原性」病状態、または治療薬 (in vivoまたは前のヴィヴォ) の存在。

図 1を示して刺激のためのワークフローと血液サンプル因数の配分などを含めた末梢血サンプルの処理刺激剤、タンパク質の添加のタイミング輸送阻害剤カクテル、およびインキュベーション赤血球 (RBC) 換散および固定までの時間。刺激的なエージェントの選択は、評価の対象となるシグナルとサイトカイン経路によって異なります。たとえば、ここで説明したプロトコルでは TLR アゴニストは複数の細胞のタイプ間で生得免疫検出メカニズムを評価するためにされます。代表的な細胞外 (LP、TLR4 アゴニスト) と小 (R848、TLR7/8 アゴニスト) アゴニストが選ばれました。ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) およびイオノマイシン (PMAIONO) は、T 細胞の活性剤として機能することができます、他の刺激的なエージェントが含まれます。として、特定のサイトカインがまた使える刺激剤、その他の特定の B および T 細胞の抗原と共に。
<p class="jove_content" fo:keep-t...

免疫表現型と機能 (細胞内サイトカイン誘導) を評価する単一細胞プロテオミクスの手法をここで述べる末梢全血サンプル、大量のフローサイトメトリーによる分析の変化。

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

この方法は、細胞の頻度の異常の特定や、自己免疫疾患の状況における主要なサイトカインの産生などの機能の違いなど、自己免疫分野の質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、簡単に入手できる末梢血サンプルから、幅広いレパートリーまたは異なる細胞タイプと機能の違いをキャプチャできることです。一般的に、このプロセスに不慣れな人は、血液処理ステップのタイミング、抗体パネルの設計、バーコード化プロセス自体、および高次元のシングルセルデータの分析に苦労する可能性があります。このシステム免疫学のアプローチは、免疫調節不全が蔓延し、末梢血中に明らかなSLEのような自己免疫疾患に特に適しています。この方法を視覚的にデモンストレーションすることは、ステップのタイミングを明確にし、マスサイトメトリー解析の前に複数のサンプルをバーコード化してプールする方法を示すためにも重要です。この手順を開始するには、全血処理のための5つの異なる条件のラベル付き丸底ポリスチレンチューブをラックに置きます。次に、各チューブに摂氏37度のRPMIの1ミリリットルを追加します。次に、各チューブに1ミリリットルの全血を加え、数回ピペットで上下させてRPMIと完全に混合します。続いて、10マイクロリットルの希釈済みルキソリチニブをT 6 plus five Rとラベル付けされたチューブに加え、十分に混合します。チューブのラックをインキュベーターに摂氏37度で置き、インキュベーションのタイミングを開始します。Tゼロサンプルを処理するには、Tゼロチューブの全内容物を、20ミリリットルの37°C溶解/固定バッファーを含む標識された円錐管にピペットで移します。細胞の回収を最適化するには、チューブを溶解/固定バッファーですすぎ、円錐形のチューブを反転させて混合します。細胞を摂氏37度で15分間インキュベートし、溶解と固定を可能にします。次に、細胞をGの500倍で室温で5分間遠心分離します。その後、上清をデカントし、細胞を1ミリリットルの氷冷PBSに再懸濁してペレットを分解します。次に、円錐形のチューブをPBSで15ミリリットルの容量に充填します。その後、細胞をGの500倍で室温で5分間遠心分離します。細胞を1ミリリットルのCSMに再懸濁して、ペレットを分解します。次に、サンプルを標識された微量遠心チューブに移し、抗体染色を行います。自動セルカウンターを使用して、10マイクロリットルのサンプルで細胞をカウントします。次に、細胞をGの500倍で室温で5分間遠心分離します。その後、上清を吸引し、ペレットを約60マイクロリットルの残留物に残します。他の条件からのサンプルの処理が完了するまで、このペレットを氷上に置いておきます。Tが30分に等しいとき、チューブラックを組織培養フードに移します。TシックスプラスR848チューブに10マイクロリットルあたり0.1グラムのR848を加え、よく混ぜます。次に、10マイクロリットルのLPSを1マイクロリットルあたり0.01マイクログラムでT six plus LPSチューブに加え、完全に混合します。その後、T six、T six plus five R、およびT six plus LPSとラベル付けされたチューブに4マイクロリットルのタンパク質輸送阻害剤を加え、Tが6時間になるまでサンプルをインキュベーターに戻します。2時間ごとにP1000ピペットでサンプルを完全に混合します。Tが2時間に相当する場合、4マイクロリットルのタンパク質輸送阻害剤カクテルをT 6 plus R848チューブに追加します。すべてのサンプルを混合し、Tが6時間になるまでラックをインキュベーターに戻します。Tが4時間になったら、P1000ピペットでもう一度サンプルを混合します。T が 6 時間に等しい場合、T ゼロ サンプルについて説明したように、T 6、T 6 と LPS、T 6 と R848、および T 6 と 5 つの R 血液サンプルチューブを処理します。その後、ペレットをマイナス80°CのCSM残量で保存し、後で処理します。溶解した固定細胞をバーコード化するには、マイナス80°Cの貯蔵からサンプルを氷上でゆっくりと解凍します。10X Barcoding PermバッファーをPBSで1〜10希釈し、サンプルあたり3ミリリットル分のバッファーを作成します。1つの非滅菌トラフにCSMを充填し、もう1つにXバーコードパーマバッファーを充填します。次に、解凍したばかりのサンプルに1ミリリットルの氷冷したCSMを加え、十分に混合し、事前にラベル付けされたそれぞれのポリプロピレンクラスターチューブに移します。次に、10マイクロリットルのサンプルを採取し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。各クラスターチューブ内の細胞数を正規化するには、余分な細胞の量を取り除きます。次に、細胞をGの600倍で室温で5分間遠心分離します。マルチチャンネルピペットで1 X Barcoding Permバッファー1ミリリットルに細胞を再懸濁し、室温で5分間Gの600倍で遠心分離します。その後、上清を吸引します。バーコードキーに示されているのと同じ順序でクラスターチューブをラックに並べて、サンプルがバーコードと一致するようにします。800マイクロリットルのX Barcoding Permバッファーをマルチチャンネルピペットでクラスターチューブ内のすべてのサンプルに添加し、細胞ペレットに触れずに細胞損失を減らします。次に、クラスターチューブと一緒にラックを脇に置きます。20-plexパラジウムバーコードキットのチューブストリップをマイナス20°Cから取り外し、室温で解凍します。100マイクロリットルの1つのXバーコードパーマバッファーを追加し、十分に混合し、再懸濁したバーコードミックスの120マイクロリットルをクラスターチューブ内の対応する細胞サンプルに移します。マルチチャンネルピペットで十分に混合し、個別にバーコード化されたサンプル間の相互汚染がないようにします。クラスターチューブを室温で30分間インキュベートし、バーコードで細胞を標識します。30分後、サンプルをGの600倍で室温で5分間遠心分離します。上清を吸引し、1ミリリットルのCSMに再懸濁します。その後、遠心分離機にかけ、再度CSMに懸濁します。その後、室温でGの600倍で5分間遠心分離し、上清を吸引します。1つのピペットで、同じチップを使用して、約70〜80マイクロリットルの残留容量のすべての細胞ペレットを1本のポリスチレンチューブに移します。ピペットチップをイジェクトしないでください。このチップでシングルピペットを脇に置きます。マルチチャンネルピペットと新しいチップを使用して、各元のクラスターチューブに100マイクロリットルのCSMを追加し、細胞の回収を最大化します。チップを脇に置いたシングルピペットを使用して、100マイクロリットルの残量内のすべての細胞ペレットを同じポリスチレンチューブに移します。CSMを追加して、ポリスチレンチューブを約3ミリリットルに補充します。プールされたバーコードセットのセル番号をカウントして記録します。その後、室温で600倍Gで5分間遠心分離し、上清を吸引します。同日にバーコード付きサンプルの染色に進みます。この概略図は、血液サンプルのアリコートの割り当て、刺激剤の添加タイミング、タンパク質輸送阻害剤カクテル、赤血球の溶解と固定までのインキュベーション時間など、末梢血サンプルの刺激と処理のワークフローを示しています。刺激剤の選択は、評価の対象となるシグナル伝達経路とサイトカイン経路によって異なります。固定およびRBC溶解後、健康なドナーからの個々の溶解および固定細胞サンプルをバーコード化し、表面マーカーに対する26の抗体で標識し、透過処理し、サイトカインに対する14の抗体で染色しました。CD14高単球の同定を表す限定ゲーティング戦略をここに示します。左から右に、表される各 2D プロットは、すぐ左の 2D プロットからゲートされた親母集団の母集団サブセットです。CD14高単球を8つの免疫細胞サブセットの代表として使用して、健康なドナーからの末梢血サンプルに対して、刺激を受けていない時間ゼロで、TLRアゴニストLPSとR848、およびT細胞活性化因子PMAイオノマイシンによる刺激後に、マスサイトメトリー分析を行いました。CD14高単球におけるサイトカイン誘導の一例が示され、使用される刺激剤に特異性を持つ選択されたサイトカインが示されています。R848は、CD14高単球でIL-12p40サブユニットとMCP1を選択的に誘導しますが、LPSは誘導しません。対照的に、PMAイオノマイシンはCD14高単球にサイトカインを誘導しません。一度マスターすれば、血液刺激は約7時間で完了し、バーコード化のステップは約1時間で完了します。この手順を試みるときは、手順のタイミングに注意し、それに応じて事前に計画を立てることが重要です。この手順が整ったら、自分の研究目的に特異的な免疫細胞応答を評価するために、マスサイトメトリーパネルの血液刺激条件を変更することを検討できます。このビデオを見れば、全血サンプルからサイトカイン反応を引き出す方法や、複数のサンプルをバーコードセットにプールしてマスサイトメトリー解析を行う方法について、十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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イムノフェノタイプと大量のフローサイトメトリーによる末梢血中のサイトカイン産生の単一細胞解析

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