白血球増殖に対する単球の免疫調節影響を評価するためのIn vitroアッセイ

接着間葉系幹細胞(MSC)培養物を含むマルチウェルプレートを取ります。

末梢血単核球(PBMC)を加えてインキュベートします。

MSCは肝細胞増殖因子を分泌し、単球に免疫調節表現型を獲得するように誘導し、インターロイキン-10またはIL-10を産生します。

PBMC含有上清をチューブに移します。

単球表面マーカーCD14に結合する抗体でコーティングされた磁気ビーズを追加します。

磁気分離器を使用してCD14+単球を単離し、濃度を上げてマルチウェルプレートウェルに添加します。

蛍光色素CFSE標識エフェクターCD4 + T細胞を導入します。

T細胞表面マーカーCD3およびCD28に特異的に結合する抗体結合マイクロビーズを添加し、細胞を活性化します。

球が十分に欠損している対照では、活性化されたT細胞が増殖し、細胞分裂ごとに娘細胞のCFSE蛍光強度が低下します。

しかし、共培養では、MSC誘導単球がIL-10を分泌し、エフェクターT細胞の増殖を抑制します。

フローサイトメトリーを使用すると、単球濃度の増加に伴ってCFSE蛍光強度の低下を示すT細胞が少なくなることが観察され、MSC誘導単球によるエフェクターT細胞増殖の抑制が

エフェクター抑制アッセイを実行するには、まず、250,000 MSCと共培養した2.5 x 10⁶ PBMCとのMSC-PBMC共培養を設定して、亜集団選択に十分なMSC共培養PBMCを確保します。

摂氏37度で48〜72時間後、適切な磁気ビーズを使用して目的のMSC誘導免疫調節白血球を選択します。次に、CFSE標識同種CD4陽性T細胞をウェルあたり1ミリリットルの完全白血球培地に、さまざまな実験比率で添加します。

次に、抗CD3/28結合マイクロビーズをビーズと細胞の比率を1対1で添加して、CD4陽性T細胞を刺激します。共培養の3日目に、フローサイトメトリーによってCFSE標識CD4陽性T細胞の増殖を評価します。