マウス単球由来樹状細胞とその後続の in Vitro活性化腫瘍免疫複合体との隔離のプロトコル

この方法は、科学者が担がんマウスの血液や腫瘍から単球由来のDCを単離し、その免疫賦活特性を研究するのに役立つように設計されています。他の方法と比較したこの手順の主な利点は、得られた単球由来のDCが腫瘍と血液中の活性化状態をよりよく反映することだと思います。最も難しいのは、おそらくすべての試薬とツールが無菌であり、この手順中に汚染を持ち込まないようにすることです。

私は15年以上前から腫瘍から骨髄細胞と樹状細胞を単離してきましたが、この方法のアイデアは、単離プロトコルが異なると細胞活性化のパターンが異なることに気付いたときに思いつきました。その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるSantana-Magal夫人です。

層流フード内で二酸化炭素を使用してマウスを安楽死させた後、腫瘍を抽出し、ウシ胎児血清を含まないRPMI培地に入れます。次に、手術用ハサミを使用して腫瘍を細かくスライスします。1匹のマウスからすべての腫瘍片を、コラゲナーゼIVおよびDNase Iを添加したHBSSバッファーとマグネチックスターバーを含む30ミリリットルの平底チューブに移します。

を腫瘍片と腫瘍片を37°Cのシェーカーでインキュベートし、内部のマグネチックスターラーを毎分200〜400回転で20〜30分間インキュベートします。次に、70μmのセルストレーナーで細胞をろ過します。その後、細胞を400倍gで摂氏4度で5〜10分間遠心分離します。

遠心分離後、1.5ミリリットルの密度勾配培地ストック溶液を8.5ミリリットルのHBSSに加えます。次に、密度勾配培地を激しく混合します。次に、混合物をペレットにピペットで移します。

細胞懸濁液を400倍gで室温で20分間遠心分離します。遠心分離が終了した後、上清をデカントします。ペレット化した細胞を2回洗浄した後、1ミリリットルの分離バッファーに再懸濁します。

細胞懸濁液を30マイクロリットルのCD11b標識磁気ビーズに加えます。次に、混合物を摂氏4度で15分間インキュベートします。遠心分離後、上清を除去し、ペレットを1ミリリットルの分離バッファーに再懸濁します。

細胞懸濁液を事前に洗浄した磁気カラムに塗布します。次に、3 ミリリットルのアイソレーションバッファーを使用して、カラムを 2 回洗浄します。次に、マグネットからカラムを取り外します。

次に、カラムに6ミリリットルのアイソレーションバッファーを追加します。プランジャーで押して、磁気的に標識された細胞を滅菌コレクションチューブで洗い流します。もう一度、細胞を400倍gで摂氏4度で5〜10分間遠心分離します。

細胞を再懸濁して染色した後、小さな側と小さな前方散乱を使用して、小さな細胞をゲーティングして細胞を選別します。マウスを安楽死させた後、70%エタノールをスプレーします。次に、外科用ハサミを使用して、層状フードの下の心臓を覆っている皮膚を取り除きます。

次に、はさみをエタノールできれいにします。20ミリモルのEDTA HBSSで空洞を洗い、はさみを使用して心臓の右心房を切断します。次に、25ゲージの針が付いた10ミリリットルの注射器を使用して、心臓の右心室を20ミリモルのEDTA HBSSでゆっくりと洗い流します。

次に、滅菌注射器を使用して胸膜腔から血液を採取します。ヘパラン硫酸とEDTAを含むチューブで血液を移します。次に、密度勾配培地で血液をピペットで移します。

血液細胞を400gで室温で15分間、ローブレーキで遠心分離します。遠心分離後、単核細胞をチューブに集めます。細胞を10ミリリットルの分離緩衝液に溶解して細胞を洗浄します。

再度、細胞を400倍のgで摂氏4度で5〜10分間遠心分離します。CD11b細胞を選択するには、細胞ペレットを1ミリリットルの分離バッファーに再懸濁します。50マイクロリットルのCD11b標識磁気ビーズと摂氏4度で15分間インキュベートします。

400 g で 4 °C で 5 〜 10 分間再遠心分離します。次に、上清を取り除きます。ペレットを1ミリリットルの分離バッファーに再懸濁します。

次に、事前に洗浄した磁気カラムに細胞懸濁液を塗布します。カラムをアイソレーションバッファーで2回洗浄します。マグネットからカラムを取り外し、カラムに6ミリリットルのアイソレーションバッファを追加します。

次に、プランジャーを押して、磁気的に標識された細胞を滅菌収集チューブで洗い流します。細胞を400倍gで4°Cで5〜10分間遠心分離します。細胞を分離バッファーに再懸濁し、蛍光色素標識抗体で染色します。

小さな側と小さな前方散乱を使用して小さなセルをゲーティングすることにより、セルをソートします。まず、細胞を1.8%バッファーパラホルムアルデヒドに室温で10分間固定します。細胞懸濁液をU字型の96ウェルプレートの各ウェルに播種します。

次に、各ウェルにさまざまな希釈の腫瘍結合抗体を添加します。その後、細胞を氷上で15〜20分間インキュベートします。インキュベーション後、150マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄します。

その後、400gで4°Cで5〜10分間遠心分離します。遠心分離後、上清を排出し、細胞を2回洗浄します。細胞を、フルオロフォア標識二次抗体を含む100マイクロリットルのFACS緩衝液に溶解します。

次に、プレートを氷上で15〜20分間インキュベートします。15〜20分後、200マイクロリットルのFACSバッファーを加えて細胞を洗浄します。プレートを400倍gで5〜10分間遠心分離します。

上清をデカントします。フローサイトメトリーを実施して、腫瘍の結合を分析し、細胞をコーティングするために必要な免疫グロブリンGの最小濃度を決定します。細胞が最小の免疫グロブリンG濃度でコーティングされたら、CFSE標識腫瘍免疫複合体を単球由来樹状細胞に1対5の比率で追加します。

次に、混合物を完全な培地で一晩12〜16時間インキュベートします。単球由来樹状細胞の活性化のFACS解析を行います。平均蛍光強度は、LMP腫瘍細胞にex vivoで結合するIgGおよびM抗体の存在を研究するためのフローサイトメトリー解析後に計算されます。

その結果、C57-Black/6同種マウス由来のIgG抗体は、129S1同系マウス由来の抗体よりもはるかに強く腫瘍細胞に結合することが示されました。次に、B16F10腫瘍細胞とIgGとの結合能の平均蛍光強度を計算します。129S1同種マウスから得られたIgGは、C57-Black/6マウスの同系IgGと比較して、B16F10腫瘍による染色強度が10倍高いことを示しています。

次に、DICの顕微鏡画像を撮影し、B16F10腫瘍から腫瘍に関連する単球由来樹状細胞を示します。ここでは、B16F10担がんマウスの血液から単離された炎症性およびパトロール性の単球由来樹状細胞を示すためにDIC画像が撮影されています。フローサイトメトリー解析は、脾臓および骨髄からの単球由来樹状細胞の活性化パターンを、免疫複合体とのインキュベーション時の腫瘍および血液の活性化パターンと比較するためにも行われます。

その結果、骨髄および脾臓樹状細胞による免疫複合体によるCD86およびMHC IIの発現が増加したことが示されています。次に、共焦点免疫組織化学が行われ、樹状細胞をCFSE標識腫瘍免疫複合体とインキュベートすると、腫瘍の取り込みとMHC IIの発現が示されます。一度習得すれば、この手順は使用しているマウスの数にもよりますが、数時間で完了します。

この手順を試行する際は、すべての試薬とツールを常に滅菌状態に保つことを忘れないでください。ネズミの毛皮は汚染の主な原因です。どの毛も組織に触れていないことを確認してください。

このビデオをご覧いただければ、マウスの血液や腫瘍から単球由来のDCを単離する方法や、その後、免疫複合体細胞でそれらを活性化し、早期の活性化を回避する方法についてよく理解していただければ幸