マウス単球由来樹状細胞とその後続の in Vitro活性化腫瘍免疫複合体との隔離のプロトコル
2018年5月31日
単球由来 DC (研) は危険性関連分子のマイナーな量を感じることができるし、簡単にプライミング、したがって。血液、腫瘍、彼らの早期活性化を避けるために考慮すべき重要注意事項を強調しながら免疫複合体とその活性化から研の隔離のための詳しいプロトコルを提供します。
この方法は、科学者が担がんマウスの血液や腫瘍から単球由来のDCを単離し、その免疫賦活特性を研究するのに役立つように設計されています。他の方法と比較したこの手順の主な利点は、得られた単球由来のDCが腫瘍と血液中の活性化状態をよりよく反映することだと思います。最も難しいのは、おそらくすべての試薬とツールが無菌であり、この手順中に汚染を持ち込まないようにすることです。
私は15年以上前から腫瘍から骨髄細胞と樹状細胞を単離してきましたが、この方法のアイデアは、単離プロトコルが異なると細胞活性化のパターンが異なることに気付いたときに思いつきました。その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるSantana-Magal夫人です。
層流フード内で二酸化炭素を使用してマウスを安楽死させた後、腫瘍を抽出し、ウシ胎児血清を含まないRPMI培地に入れます。次に、手術用ハサミを使用して腫瘍を細かくスライスします。1匹のマウスからすべての腫瘍片を、コラゲナーゼIVおよびDNase Iを添加したHBSSバッファーとマグネチックスターバーを含む30ミリリットルの平底チューブに移します。
チューブを腫瘍片と腫瘍片を37°Cのシェーカーでインキュベートし、内部のマグネチックスターラーを毎分200〜400回転で20〜30分間インキュベートします。次に、70μmのセルストレーナーで細胞をろ過します。その後、細胞を400倍gで摂氏4度で5〜10分間遠心分離します。
遠心分離後、1.5ミリリットルの密度勾配培地ストック溶液を8.5ミリリットルのHBSSに加えます。次に、密度勾配培地を激しく混合します。次に、混合物をペレットにピペットで移します。
細胞懸濁液を400倍gで室温で20分間遠心分離します。遠心分離が終了した後、上清をデカントします。ペレット化した細胞を2回洗浄した後、1ミリリットルの分離バッファーに再懸濁します。
細胞懸濁液を30マイクロリットルのCD11b標識磁気ビーズに加えます。次に、混合物を摂氏4度で15分間インキュベートします。遠心分離後、上清を除去し、ペレットを1ミリリットルの分離バッファーに再懸濁します。
細胞懸濁液を事前に洗浄した磁気カラムに塗布します。次に、3 ミリリットルのアイソレーションバッファーを使用して、カラムを 2 回洗浄します。次に、マグネットからカラムを取り外します。
次に、カラムに6ミリリットルのアイソレーションバッファーを追加します。プランジャーで押して、磁気的に標識された細胞を滅菌コレクションチューブで洗い流します。もう一度、細胞を400倍gで摂氏4度で5〜10分間遠心分離します。
細胞を再懸濁して染色した後、小さな側と小さな前方散乱を使用して、小さな細胞をゲーティングして細胞を選別します。マウスを安楽死させた後、70%エタノールをスプレーします。次に、外科用ハサミを使用して、層状フードの下の心臓を覆っている皮膚を取り除きます。
次に、はさみをエタノールできれいにします。20ミリモルのEDTA HBSSで空洞を洗い、はさみを使用して心臓の右心房を切断します。次に、25ゲージの針が付いた10ミリリットルの注射器を使用して、心臓の右心室を20ミリモルのEDTA HBSSでゆっくりと洗い流します。
次に、滅菌注射器を使用して胸膜腔から血液を採取します。ヘパラン硫酸とEDTAを含むチューブで血液を移します。次に、密度勾配培地で血液をピペットで移します。
血液細胞を400gで室温で15分間、ローブレーキで遠心分離します。遠心分離後、単核細胞をチューブに集めます。細胞を10ミリリットルの分離緩衝液に溶解して細胞を洗浄します。
再度、細胞を400倍のgで摂氏4度で5〜10分間遠心分離します。CD11b細胞を選択するには、細胞ペレットを1ミリリットルの分離バッファーに再懸濁します。50マイクロリットルのCD11b標識磁気ビーズと摂氏4度で15分間インキュベートします。
400 g で 4 °C で 5 〜 10 分間再遠心分離します。次に、上清を取り除きます。ペレットを1ミリリットルの分離バッファーに再懸濁します。
次に、事前に洗浄した磁気カラムに細胞懸濁液を塗布します。カラムをアイソレーションバッファーで2回洗浄します。マグネットからカラムを取り外し、カラムに6ミリリットルのアイソレーションバッファを追加します。
次に、プランジャーを押して、磁気的に標識された細胞を滅菌収集チューブで洗い流します。細胞を400倍gで4°Cで5〜10分間遠心分離します。細胞を分離バッファーに再懸濁し、蛍光色素標識抗体で染色します。
小さな側と小さな前方散乱を使用して小さなセルをゲーティングすることにより、セルをソートします。まず、細胞を1.8%バッファーパラホルムアルデヒドに室温で10分間固定します。細胞懸濁液をU字型の96ウェルプレートの各ウェルに播種します。
次に、各ウェルにさまざまな希釈の腫瘍結合抗体を添加します。その後、細胞を氷上で15〜20分間インキュベートします。インキュベーション後、150マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄します。
その後、400gで4°Cで5〜10分間遠心分離します。遠心分離後、上清を排出し、細胞を2回洗浄します。細胞を、フルオロフォア標識二次抗体を含む100マイクロリットルのFACS緩衝液に溶解します。
次に、プレートを氷上で15〜20分間インキュベートします。15〜20分後、200マイクロリットルのFACSバッファーを加えて細胞を洗浄します。プレートを400倍gで5〜10分間遠心分離します。
上清をデカントします。フローサイトメトリーを実施して、腫瘍の結合を分析し、細胞をコーティングするために必要な免疫グロブリンGの最小濃度を決定します。細胞が最小の免疫グロブリンG濃度でコーティングされたら、CFSE標識腫瘍免疫複合体を単球由来樹状細胞に1対5の比率で追加します。
次に、混合物を完全な培地で一晩12〜16時間インキュベートします。単球由来樹状細胞の活性化のFACS解析を行います。平均蛍光強度は、LMP腫瘍細胞にex vivoで結合するIgGおよびM抗体の存在を研究するためのフローサイトメトリー解析後に計算されます。
その結果、C57-Black/6同種マウス由来のIgG抗体は、129S1同系マウス由来の抗体よりもはるかに強く腫瘍細胞に結合することが示されました。次に、B16F10腫瘍細胞とIgGとの結合能の平均蛍光強度を計算します。129S1同種マウスから得られたIgGは、C57-Black/6マウスの同系IgGと比較して、B16F10腫瘍による染色強度が10倍高いことを示しています。
次に、DICの顕微鏡画像を撮影し、B16F10腫瘍から腫瘍に関連する単球由来樹状細胞を示します。ここでは、B16F10担がんマウスの血液から単離された炎症性およびパトロール性の単球由来樹状細胞を示すためにDIC画像が撮影されています。フローサイトメトリー解析は、脾臓および骨髄からの単球由来樹状細胞の活性化パターンを、免疫複合体とのインキュベーション時の腫瘍および血液の活性化パターンと比較するためにも行われます。
その結果、骨髄および脾臓樹状細胞による免疫複合体によるCD86およびMHC IIの発現が増加したことが示されています。次に、共焦点免疫組織化学が行われ、樹状細胞をCFSE標識腫瘍免疫複合体とインキュベートすると、腫瘍の取り込みとMHC IIの発現が示されます。一度習得すれば、この手順は使用しているマウスの数にもよりますが、数時間で完了します。
この手順を試行する際は、すべての試薬とツールを常に滅菌状態に保つことを忘れないでください。ネズミの毛皮は汚染の主な原因です。どの毛も組織に触れていないことを確認してください。
このビデオをご覧いただければ、マウスの血液や腫瘍から単球由来のDCを単離する方法や、その後、免疫複合体細胞でそれらを活性化し、早期の活性化を回避する方法についてよく理解していただければ幸
いです。完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本記事では、腫瘍担持マウスの血液および腫瘍から単球由来樹状細胞（MoDC）を単離する方法を提示します。本プロトコルでは、コンタミネーションを防ぎ、細胞の活性化状態に関する正確な結果を得るために、無菌状態を維持することの重要性を強調しています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 免疫学
- 細胞生物学
- 腫瘍学
背景
- 単球由来DCは免疫応答において極めて重要である。
- 分離方法は、これらの細胞の活性化状態に影響を及ぼす可能性がある。
- 分離プロセス中の無菌状態の維持は不可欠である。
- プロトコルによって、細胞の活性化パターンの結果が異なる。
研究の目的
- MoDCを単離するための詳細なプロトコルを提供すること。
- 早期活性化を避けるための注意点を強調すること。
- MoDCの免疫刺激特性に関する理解を深めること。
使用方法
- 血液および腫瘍からのMoDCの単離。
- 免疫複合体によるMoDCの活性化。
- 滅菌試薬および器具の使用。
- 大学院生による手順のデモンストレーション。
主な結果
- この分離方法は、MoDCの活性化状態を正確に反映します。
- コンタミネーションを防ぐための重要な注意点が特定されています。
- MoDCは、その由来に基づいて異なる免疫刺激特性を示します。
- プロトコルの有効性は、実際の実演を通じて検証されています。
結論
- 記載された方法は、免疫学におけるMoDCの研究を促進します。
- 信頼性の高い結果を得るためには、無菌状態を維持することが不可欠です。
- 今後の研究では、このプロトコルを基にしてMoDCの機能を探索することが可能です。
よくある質問
業界における重要性
血液および腫瘍から単球由来樹状細胞（MoDC）を正確に単離することは、前臨床腫瘍モデルにおけるそれらの活性化状態を研究する上で極めて重要です。本プロトコルでは、早期の活性化とコンタミネーションを最小限に抑えることで、免疫刺激特性および免疫複合体相互作用の信頼性の高い評価を可能にします。このような精度は、in vivo の条件を反映した疾患関連システムを提供することにより、免疫療法の創薬におけるターゲットの検証およびメカニズム上のリスク低減を支援します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：腫瘍免疫複合体によるMoDC活性化経路の解析を可能にし、機能的標的の妥当性を明確にする。
- 実用的価値：複数のソースからMoDCを単離するための再現性のある手法を提供し、初期段階の仮説検証におけるばらつきを低減する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値：免疫複合体の結合および活性化マーカーの定量分析に向けた、検証済みのMoDC集団を生成する。
- 運用的価値：下流のフローサイトメトリーおよびイメージングアッセイに向けた細胞調製を標準化し、スクリーニングの準備効率を向上させる。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： 腫瘍担がんマウスの腫瘍および血液からMoDCを単離することで、トランスレーショナルバイオマーカー研究に沿った疾患関連モデリングを支援します。
- 運用上の価値： 組織ソース間での活性化パターンのクロスファンクショナルな比較を容易にし、前臨床リスクアセスメントに寄与します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、初期のターゲットバリデーションに生物学的に適切なMoDCを提供し、免疫複合体スクリーニングのためのアッセイ開発へと進み、さらに樹状細胞ベースの免疫療法の前臨床評価に情報を与えることで、創薬の連続的なプロセスに統合されます。
- 探索生物学：制御された免疫複合体の曝露を通じて、MoDC活性化メカニズムの仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：化合物や複合体の評価のため、平均蛍光強度やマーカー発現（CD86、MHC II）などの標準化された定量的リードアウトを提供します。
- 分析：定義された条件下での、骨髄、脾臓、腫瘍、および血液由来のMoDCにおける活性化状態の統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：腫瘍由来のMoDCを用いてin vivoでの抗原取り込みと提示をモデル化することで、探索研究から前臨床段階への連続性を繋げます。
- エンタープライズでの再利用：樹状細胞の機能検証を必要とする免疫療法プロジェクト全般に適用可能な、再利用可能な単離および活性化プラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：真のMoDC活性化状態を反映させることで予測の信頼性を高め、免疫療法のターゲット検証におけるメカニズム上の曖昧さを軽減します。
- 運用の価値：無菌的かつ標準化された分離・活性化ワークフローを通じて再現性を確保し、実験ノイズを最小限に抑えます。
- 戦略的価値：MoDCの免疫刺激特性に関する信頼性の高いデータを提供することで、Go/No-go判断を改善し、後段階における生物学的リスクを軽減します。
- ポートフォリオへの影響：検証済みの機能的アウトプットに基づき、樹状細胞標的候補のリスク調整済み優先順位付けを可能にします。
実施上の考慮事項
- 無菌的な細胞分離、磁気ビーズ分離、およびフローサイトメトリーの専門知識が必要です。
- 遠心分離機、磁気カラム、セルストレーナー、および無菌的な組織培養施設へのアクセスが必須となります。
- 試薬の取り扱い、抗体染色、および免疫複合体の調製について、チーム間での標準化が必要です。
- 活性化の結果を解釈する際は、腫瘍モデルシステムやマウス系統による変動を考慮しなければなりません。
- 新鮮な組織処理が必要であること、および分離ステップにおける汚染への感受性によって制限されます。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:04
Title
1:11
Isolation of Tumor Associated Monocyte-derived DC
4:07
Isolation of Monocyte-derived DC from Peripheral Blood
6:54
Preparation of Tumor-IgG Immune Complexes Followed by Activation of MoDC with Tumor-IgG
8:58
Results: Isolation and Analysis of the Activation of MoDC with the Tumor Immune Complex
11:02
Conclusion
