アフィニティークロマトグラフィーを用いた自己組織化タンパク質ナノ粒子の精製

組換え自己組織化タンパク質ナノ粒子を発現する操作細菌の懸濁液をポリヒスチジンタグで取ります。

超音波処理して細胞内成分を放出します。

ナノ粒子を含む上清を遠心分離します。イミダゾールフリーの緩衝液で希釈します。

化ニッケルカチオンを含むアガロースビーズを含むアフィニティークロマトグラフィーカラムを取ります。

カラム平衡化のために、イミダゾール濃度の低いバッファーを加えます。

細菌ライセートをカラムに加えます。

実行中、タンパク質ナノ粒子上のポリヒスチジンはニッケルカチオンと強く結合します。

、細菌のリポ多糖類やその他のタンパク質などの汚染物質は、カラムへの結合が弱くなります。

低濃度のイミダゾールを含む緩衝液で洗浄し、弱く結合したタンパク質を除去します。

イソプロパノールを導入してリポ多糖類を除去し、洗浄します。

次に、中程度のイミダゾール濃度の緩衝液を導入します。イミダゾールはニッケルカチオンへの結合をめぐってヒスチジンと競合し、結合したタンパク質ナノ粒子を放出します。

次に、高濃度のイミダゾールを含む緩衝液を加えて、タンパク質ナノ粒子を完全に溶出します。

精製されたタンパク質ナノ粒子を収集して、さらに応用します。

収穫された大腸菌の溶解のために、6ヘリックスバンドルSAPNを発現する、150ワットの超音波処理出力を持つプローブを使用し、4秒間の超音波処理と6秒の休息で、再懸濁した細菌ペレットを40ミリリットルのイミダゾールフリーバッファーに5分間超音波処理します。

細胞ライセートを遠心分離して清澄上清を生成し、上清を滅菌150ミリリットルフラスコに移します。次に、新鮮なイミダゾールフリーバッファーでサンプルを最終容量100ミリリットルまで上げます。

目的のタンパク質を単離するには、FPLCソフトウェアを開き、[新しいメソッド]オプションをクリックします。[メソッド設定]メニューで、[列の位置]ドロップダウンメニューを開き、[C1ポート3]を選択します。[Showing By Technique] ドロップダウン メニューで、[Affinity] を選択します。[列タイプ] ドロップダウン メニューで、[その他]、[HisTrap HP]、および [5 ミリリットル] を選択します。カラム容量と圧力ボックスは自動的に適切な値に設定されます。

メソッドアウトライン]をクリックし、[平衡化]ボタンと[サンプル適用]ボタン、3つの[カラム洗浄]ボタン、および[溶出]ボタンを[フェーズライブラリ]ポップアップメニューの矢印の横にドラッグしてから、[フェーズライブラリ]メニューを閉じます。「平衡化」をクリックし、表にリストされている値を「初期バッファー B、4%」、「最終バッファー B、4%」、および「カラム容量」に設定します。

サンプルアプリケーション] をクリックします。[サンプルローディング]ボックスで、[サンプルポンプでカラムにサンプルを注入]のラジオボタンをクリックし、[サンプル注入]で[メソッド設定から流量を使用]の横のボックスがオンになっていることを確認します システムポンプボックス付き。[ボリューム]ボックスの値を100ミリリットルに変更し、[フラクション収集スキーム]を[有効]に変更します。

[メソッド設定からフラクションサイズを使用]ボックスをオフにし、フラクションサイズを4ミリリットルに変更します。最初のカラム洗浄ボタンをクリックします。表にリストされている値を、初期バッファー B、4%、最終バッファー B、4%、およびカラム容量 10 に設定します。[フラクション収集スキームの有効化]ボックスをクリックし、[メソッド設定にフラクションサイズを使用]のクリックを解除します。フラクションサイズを4ミリリットルに変更し、2番目のカラム洗浄ボタンをクリックします。

表の値を「初期バッファー B、0%」、「最終バッファー B、0%」、および「カラム容量」5 に設定します。[フラクション収集スキームの有効化]ボックスをクリックし、[メソッド設定]から[フラクションサイズを使用]のクリックを解除します。フラクションサイズを4ミリリットルに変更し、[3番目の列洗浄]ボタンをクリックします。表の値を「初期バッファー B、0%」、「最終バッファー B、0%」、および「カラム容量」10 に設定します。「フラクション収集スキームの有効化」ボタンをクリックし、「メソッド設定にフラクションサイズを使用」ボックスの選択を解除します。次に、分数のサイズを4ミリリットルに変更します。

溶出]ボタンをクリックし、表内の情報を右クリックします。ポップアップメニューで「ステップを削除」をクリックし、「アイソクラティックグラデーション」ボタンをテーブルに 2 回ドラッグして、2 つのエントリがあるようにします。最初のエントリの値を [初期バッファー B] 30%、[最終バッファー B] 30%、および [カラム容量] 10 に設定します。

2 番目のエントリの値を Initial Buffer B、100%、Final Buffer B、100%、およびカラム容量 10 に設定します。「フラクション収集スキームの有効化」ボタンをクリックし、「メソッド設定にフラクションサイズを使用」ボックスをクリックします。次に、[名前を付けて保存]をクリックし、ファイルに「Purification」という名前を付けます。

FPLCのポンプAチューブをイミダゾールフリーの洗浄バッファーに入れ、ポンプBチューブを500ミリモルのイミダゾールバッファーに入れます。サンプルポンプチューブを100ミリリットルのサンプルに入れ、精製プログラムを実行します。60%イソプロパノール洗浄が必要な場合は、プログラムを一時停止し、ポンプチューブをイミダゾールフリー洗浄から60%イソプロパノール洗浄に移動して、プログラムを再起動します。洗浄の最後に、プログラムを再度一時停止し、ポンプAチューブをイミダゾールフリーの洗浄バッファーに戻し、精製プログラムを再開します。