組換え細菌タンパク質の精製のための親和性クロマトグラフィー技術

ポリヒスチジン標的タンパク質を発現する細菌細胞の懸浮液を考えてみましょう。

タンパク質分解を最小限に抑えるために氷でソニック酸を使いましょう。高周波の音波が細胞を溶かし、標的タンパク質を含む細胞内内容物を放出します。

遠心分離機でゴミを分離し、上清液を含むタンパク質を注射器に移します。

上清液をろ過して凝集体を除去し、クロマトグラフィーカラムの詰まりを防ぎます。

ニッケル系親和性クロマトグラフィーカラムを取り、最適なタンパク質精製のために平衡させます。

ろ過液をカラムに積み込め。ポリヒスチジンタグはカラム樹脂上のニッケルイオンに結合し、標的タンパク質を固定します。

カラムをバッファーで洗浄して結合していないタンパク質を除去し、非標的タンパク質の除去を確認するためにエリュートの紫外線吸収を監視します。

イミダゾールを含む洗脱バッファーを加え、ポリヒスチジンタグと競合してニッケル結合を促し、タンパク質を放出します。

UV吸収の2度目の急増により、標的タンパク質の洗脱が確認され、下流での利用が整います。

氷上で細胞を超音波処理し、15秒のパルスと30秒の休止を5サイクル行います。

細胞溶解液を21,000g、4度Cで15分間遠心分離した後、無菌シリンジフィルターシステムで上清液をろ過します。5ミリリットルのニッケル系親和性カラムを備えた自動精製システムを用いて、無菌でろ過された大腸菌上清液からHIS標識付きRTA画分を精製します。一般的には、1分あたり1ミリリットルの洗脱速度を用い、精製システム全体を冷却して非効率的な毒素結合や毒素活性の喪失を防ぎます。

親和性カラムを20ミリリットルの結合バッファーで短時間平衡させて貯蔵バッファーを除去します。その後、無菌でろ過された上清液を注射器で親和性カラムに塗布します。カラムを25〜35ミリリットルの結合バッファーで洗浄し、カラムから結合していないタンパク質を除去します。

280ナノメートルのUV吸収が初期のUV値に近づくまで洗浄工程を繰り返します。次に、結合したRTA分画を20〜35ミリリットルの洗脱バッファーで溶出し、サンプルを氷上に保管します。UV 280値が上昇した直後にRTAフラクションサンプリングを開始し、元の基準値に戻ったら終了することが重要です。