ニッケルアフィニティークロマトグラフィーベースのタンパク質精製:細菌細胞溶解物からポリヒスチジンタグ付き組換えタンパク質を精製する技術

ポリヒスチジンタグ(1つの末端にあるヒスチジン残基のストリング)に融合した組換えタンパク質を細菌細胞ライセートから精製するには、まず、細胞ライセートを希釈して、クロマトグラフィー分析中のカラムの目詰まりを防ぎます。

キレート剤であるニトリロ三酢酸を使用して、アガロースビーズマトリックスに固定化された二価ニッケルカチオンを含むアフィニティーカラムを組み立てます。ニトリロ三酢酸は、4つの配位共有結合部位を介してニッケルカチオンに結合しますが、金属イオン上の2つの部位は、目的のタンパク質のポリヒスチジンタグとの相互作用に引き続き利用できます。

カラムを適切なバッファーで平衡化し、効果的な金属とタンパク質の相互作用のための条件を最適化します。細胞ライセートをカラムにロードします。

アクセス可能な末端ヒスチジン残基を運ぶ組換えタンパク質は、ヒスチジンの側鎖であるイミダゾールに対する金属イオンの高い親和性により、ニッケルカチオンと配位結合を形成し、マトリックスに結合します。組換えタンパク質中の連続したヒスチジンの数が多いと、マトリックスへの付着が強化されます。

これに対し、ヒスチジン残基を欠くタンパク質はカラムに付着せず、フロースルーで溶出します。低濃度イミダゾール緩衝液でカラムを洗浄します。

イミダゾールは、ポリペプチド鎖内のヒスチジン残基を介してマトリックスに非特異的に付着した可能性のある弱く結合したタンパク質汚染物質と競合し、それらを置換して溶出を促進します。高濃度のイミダゾール緩衝液でカラムを洗浄し、強く結合したヒスチジンタグ付き組換えタンパク質をニッケルイオンキレートから解離し、フロースルーで溶出させます。

精製された組換えタンパク質画分を収集して、さらなる分析を行います。

テキストプロトコルに記載されているように、ヒスチジンタグ付きタンパク質の誘導性過剰発現からこのプロトコルを開始します。重力カラムで1ミリリットルのニッケルニトリロ酢酸樹脂を調製し、タンパク質を精製します。使用前日に、カラムを摂氏 4 度で 2 ミリリットルの平衡バッファーで一晩平衡化します。

翌日、清澄化したライセートをロードする前に、カラムを摂氏4度から室温に持ち込み、約2〜3時間放置します。次に、ペレットを溶解バッファーに再懸濁します。

氷上で細胞を10秒間隔で10回超音波処理し、パルスの間に30秒間を休ませます。微量遠心分離機を使用して、摂氏4度で30分間、3080 x g で遠心分離することにより、ライセートを清澄

量の溶解バッファーで清澄化ライセートを調製し、調製した清掃ライセートをカラムに塗布し、フロースルーを回収します。清澄化したライセートフロースルーをカラムに再塗布し、二次フロースルーを回収します。

次に、5 ミリリットルの洗浄バッファー #1 でカラムを洗浄し、フロースルーを回収します。5 ミリリットルの洗浄バッファー #2 でカラムを再度洗浄し、フロースルーを回収します。次に、2ミリリットルの溶出バッファーを塗布します。フロースルーをそれぞれ1ミリリットルの2つの部分に分けて収集します。