マイクロスケール熱泳動によって結合親和性の決定のタンパク質精製·フリー法

この手順の全体的な目的は、細胞溶解物からタンパク質を精製することなく、タンパク質とリガンドの相互作用における結合親和性を決定することです。これは、まず任意の接着性細胞株で目的のGFP融合タンパク質を発現させることで達成されます。細胞溶解物の調製とリガンドの希釈後、細胞溶解物とリガンドの混合液を調製し、キャピラリーに充填します。

次に、さまざまなリガンド濃度におけるGFP融合タンパク質の熱泳動性が測定されます。最終ステップは、マイクロスケール熱泳動（MST）測定のデータ解析です。最終的に、マイクロスケール熱泳動を用いて、GFP融合タンパク質とさまざまなリガンドとの相互作用における結合親和性を決定します。

滴定法、カロリメトリー、または表面プラズモン共鳴などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、タンパク質の精製を回避できることであり、これによりバイナリー相互作用の定量的特性評価を大幅に簡略化し、加速させることができる点にあります。この方法は、膜タンパク質や転写因子など、発現および精製が困難なタンパク質を扱う際に大きな利点をもたらします。マイクロスケール熱泳動法の最大の利点の一つは、多様なバッファーで動作し、システム内に界面活性剤やミセルが存在していても許容されることです。本技術のデモンストレーションを行うのは、私の研究室の生物学者であるKaren Stefkaです。まず、T75フラスコあたり10 mLのバッファーを用い、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を短時間洗浄します。

細胞を氷上で5分間、またはフラスコから剥離し始めるまで保持します。必要に応じて、セルスクレーパーで細胞を掻き取って剥離させます。氷冷したPBS 10 millilitersで細胞を再懸濁し、あらかじめ冷却した14 milliliterのラウンドボトム遠心チューブに移します。

400〜600 G、4 °Cで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。上清を除去し、ペレットを200 µLの氷冷した溶解バッファーに再懸濁します。細胞質タンパク質を抽出するため、懸濁液をあらかじめ冷却した1.5 mLエッペンドルフチューブに移します。

局所的な過熱を最小限に抑えるため、細胞を氷上に置き、30%の振幅で10秒間の超音波処理を3回行い、細胞を溶解します。2〜3 mmの冷却済みチップを使用し、泡立ちを最小限に抑えるためにチップの先端を液面下に保ちます。界面活性剤を含むバッファーを使用する場合はこのステップを省略し、氷上で30分間インキュベートします。

代わりに、必要に応じて5 M塩化ナトリウムストック溶液を用いて、溶解液の生理学的塩濃度を100 mM塩化ナトリウムに調整します。最後に、約25,000 G、4 °Cで10分間遠心分離し、溶解液を回収します。MST装置で、波長が470 nmの発光ダイオード（LED）励起光源を選択します。

MSTバッファーで2倍および10倍に希釈した細胞抽出液をキャピラリーに充填し、MST装置にセットします。MST装置のコントロールソフトウェアで「find capillaries」操作を実行します。希釈ライセートにおける最適な蛍光強度の範囲は、400〜1500 fluorescence unitsです。

テキストプロトコルに従い、最適なリガンド濃度範囲の決定に進みます。必要数の0.5 milliliter低吸着遠心チューブをセットしたチューブラックを氷上に置き、各チューブの底に25 microlitersのMST bufferを分注します。最初のチューブに25 microlitersのリガンドストック溶液を加え、残りのチューブを用いてリガンドの2倍連続希釈を行います。リガンド試料が入ったラックは氷上で保持してください。

結合反応において蛍光標的タンパク質の最適なレベルが得られるように、細胞溶解液の希釈倍率を算出します。最終的なタンパク質濃度は、予想される結合解離定数に近い値またはそれ以下である必要があり、必要な蛍光カウント数を得られるように調整してください。最終溶液にする際、MST Bufferを用いて細胞溶解液を希釈します。

リガンド連続希釈サンプルが入ったチューブの向かい側のチューブラックに、0.5 milliliterのローバインドチューブを配置します。各チューブの底に、細胞溶解液を15 microlitersずつ慎重に加えます。サンプルの損失を防ぐため、チューブの壁面に触れないようにしてください。

最高濃度のリガンド試料を15 µL、対応するチューブ（細胞溶解液を含むチューブ1）に加えます。十分に混ぜ合わせ、ピペットチップを交換してください。

リガンドを含まない最後のチューブを除き、残りのチューブでこの手順を繰り返します。最後のチューブに15 µLのMSTバッファーを加えて混合します。1番目のキャピラリーの約3分の2まで、チューブ1の結合混合液で満たします。

傾けて溶液を中心方向に移動させ、キャピラリーをキャピラリートレイの1番の位置に配置します。残りのキャピラリーについてもこの手順を繰り返します。実験時間が長い場合は、キャピラリーの端をワックスで封止することができます。

トレイをMST装置内にセットし、装置のドアを閉じます。次に、波長470 nanometersのLED励起光源を選択します。MST装置で「find capillaries」コマンドを実行し、装置にキャピラリーの正確な位置を特定させ、蛍光信号強度に基づいてサンプルの蛍光を測定します。

LED出力を400から1500ユニットの範囲に調整します。開始ボタンをクリックして、熱耐性実験（Thermo Resis Experiment）を実行してください。実験に使用する赤外線レーザー出力は、複数選択することが可能です。

特定のシステムに最適な温度勾配を決定するために、16本のキャピラリー1セットの走行に10〜12分かかります。測定の再現性を確保するため、同一のキャピラリーセットを用いて2〜3回の走行データを収集してください。データ解析を開始するには、解析ソフトウェアを開き、プロジェクトフォルダをロードします。

表示された情報ランビューアにおいて、特定のIRレーザー出力で収集されたサーモレティック曲線を選択します。さまざまな条件下で収集されたすべてのサーモレティックトレースを一度に開き、その後、オン・オフを切り替えることで解析に使用する曲線を選択できるオプションがありました。評価ポイントのグラフウィンドウで、Tジャンプの青色線および赤色線で示されるサーモレシスまたはサーモフォレシスを選択します。

ソフトウェアによる解析のために、手動で選択する実験曲線の2つの領域を定義します。Thermo Resisの最大変化が得られるよう、青線と赤線が正しく配置されていることを確認してください。標準偏差を伴う平均点を得るには、「use average（平均を使用）」を選択するか、個別のランについては「distinguish runs（ランを区別）」を選択してください。

解離定数のフィッティングをプロットするには、[use average]を選択し、ラベル付けされた分子の濃度値を入力して固定し、曲線をフィッティングさせます。結合解離定数またはKD値とその標準偏差が、別の情報ポップアップウィンドウに表示されます。平均フィッティングデータをテキストファイルに保存し、Excelに転送してください。Heck。

STAT 3G FPを発現させた2 9 3細胞を、蛍光標識したstat threeの供給源として使用した。AのDNA結合アッセイにおいて、高電荷のオリゴヌクレオチドの結合により、STAT threeの移動度に顕著な変化が生じた。温度勾配において。

Thermo retic signalをオリゴヌクレオチド濃度の関数としてプロットした。各データ点は3回の測定値の平均を表している。Nano temporal analysisソフトウェアを用いてフィッティングを行い、見かけのKD値を決定した。

見かけの解離定数は、gasモチーフへの結合で37.9 ± 1.0 µM、ATリッチなオリゴヌクレオチドs+100への結合で23.3 ± 0.6 µMであった。驚くべきことに、s+100配列はgasよりもわずかに強い結合を示した。3回の測定において、AからGへの置換により、s+100変異体1の親和性は劇的に低下した。

S plus 100 変異体 2 では結合が検出されなかったため、STAT three の S plus 100 への結合が配列選択的であることが確認されました。この手法を習得すれば、適切に実施することで 2 時間以内に完了させることができます。本手順を行う際は、膜タンパク質の抽出における最適条件はタンパク質ごとに異なり、通常は最適化が必要であることを留意してください。このビデオを視聴することで、細胞溶解物からタンパク質を精製することなく、リガンドに対するタンパク質の結合親和性を決定する方法について十分な理解が得られるはずです。