マウス胚背外側末脳からの細胞の単離と培養

マウス胚を緩衝液に入れ、頭蓋骨を分離して脳を分離します。

脳を覆う膜層である髄膜を取り除きます。

脳を解剖して半球を分離します。

外側終脳を半球から分離し、チューブに移します。

背外側終脳はニューロンと神経前駆細胞が豊富です。

心分離して上清を除去します。

酵素溶液を追加します。酵素は組織マトリックスを分解し、細胞を緩めます。

血清を含む増殖培地を導入します。血清タンパク質は酵素活性を阻害します。

ピペットを使用して組織を機械的に解離し、細胞懸濁液を形成します。

活化酵素と組織破片を含む上清を遠心分離して除去します。

増殖培地に細胞を再懸濁します。

細胞を細胞培養基質でコーティングされたマイクロプレートに移します。

細胞が基質に付着するまでインキュベートします。培地は前駆細胞の増殖を促進します。

、低温解剖培地を入れたペトリ皿で5〜10個のE14胚から脳を取り除きます。鉗子を使用して皮膚と頭蓋骨を慎重に引き抜き、脳を分離します。実体顕微鏡下で作業している間、解剖鉗子を使用して髄膜を除去します。次に、終脳を真ん中で分割して半球を分離します。

外側終脳を分離し、背内側曲線と淡蒼下-天蓋下境界に沿って切断します。すべての脳が解剖されるまで、背外側終脳を氷上の解剖培地を含む2ミリリットルのチューブに移します。背外側終脳の顕微解剖後、組織を15ミリリットルの円錐形のチューブに入れます。

次に、採取した組織と低温解剖培地を含むチューブを摂氏4度、340gで5分間遠心分離し、組織を沈殿させます。スピン後、ピペットで上清を取り除き、化学消化のために摂氏37度0.05%トリプシン-EDTAを1ミリリットル加えます。摂氏37度で15分間インキュベートします。

インキュベーション後、トリプシン活性を阻害するために2ミリリットルの増殖培地を加えます。次に、ガラス製パスツールピペットの先端をガスバーナーまたはブンゼンバーナーで数秒間磨き、開口部をわずかに狭めます。FCSを吸引してピペットの先端をコーティングします。次に、気泡が発生しないように注意しながら、上下にピペッティングして、火で研磨され、FCSコーティングされたパスツールピペットで細胞を機械的に解離します。

解離した細胞を摂氏4度、gの340倍で5分間遠心分離します。ピペットで上清を取り除きます。次に、1ミリリットルの増殖培地を加え、ピペットを使用して細胞を再懸濁します。ポリ-D-リジンで前処理されたプレートからPBSを取り除きます。次に、ゼロ点を決定するための基準として使用できる記号をプレートの底に描きます。

細胞を増殖培地に2回目に再懸濁した後、0.4%トリパンブルー溶液を使用して細胞懸濁液の1対1希釈液を調製します。計数チャンバースライドにロードし、未染色の生細胞の数をカウントします。生存不能な細胞は青色になります。増殖培地で細胞を希釈して、ミリリットルあたり10〜⁶個の細胞を得る。24ウェル組織培養プレートの各ウェルに500マイクロリットルの細胞懸濁液を加え、摂氏37度、二酸化炭素5%で細胞をインキュベートします。