Name: 超低密度のために簡略化された方法、長期初代海馬ニューロンの文化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学ぶ、マウス海馬ニューロンの超低密度初代培養法。グリア飼育層を不要とし、ニューロン自律的メカニズムの研究や免疫細胞化学ラベリングを可能にする簡略化された長期培養技術です。

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この研究は、S.Q.（R00MH087628.へのNIH/NIMH助成金によって支援されました。

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

私たちは、無血清条件下での超低密度海馬グルタミン酸作動性ニューロンの長期培養のための詳細なプロトコルを提示します。 / cm 2の〜2000ニューロンでは、密度は、少なくとも2つの既存の文献2,3,11,13,14によって報告されたグリアサポートの有無にかかわらず、ほとんどの「低密度「文化の準備よりも倍低いです。超低密度であることに加えて、このプロトコルは、新規で2つの点で重要です。低密度ニューロンがないシナプス結合または異なる密度で培養ニューロン間の直接の接触がなくても、物理的に近接内にある高密度のニューロンからの栄養因子のサポートを得るように、まず、何のグリアフィーダー層は必要ありません。このプロトコルは、先に計画された培養実験のグリア単層を調製する必要がなくなり、高密度および低密度培養物を同時に成長することを可能にします。グリア単層の調製は時間がかかり、Lであることができますaborious、最も文献は新生ラット仔の皮質2を使用しています。したがって、マウスのみで作業ラボのために、これは重要な追加の努力が必要です。それは、ニューロン、グリア、または2つの細胞型<su...

インビトロ条件下での海馬神経細胞を成長させることは、観察し、 生体内で他の方法では不可能な、これらのニューロンの実験的操作を可能にします。この実験的なアプローチは、広く成長、極性、神経突起の仕様、輸送およびタンパク質の細胞内局在、シナプス形成および機能的成熟1の神経メカニズムを明らかにするために使用されます。後期胚期から採取するとき、これらのインビトロ培養海馬ニューロンは、錐体の形態2の比較的純粋な（&gt; 90％）グルタミン酸細胞です。ニューロンがインビトロ条件下で2-D表面で増殖させたため、この方法は、単一の焦点面3を介して染色ライブイメージングまたは免疫細胞化学（ICC）のように、容易に観察できます。または、そのような薬物治療やトランスフェクション3-6のような操作、。高い密度で増殖させた場合、ニューロンがあるため、より高い共同の生存率が高い傾向にあります増殖培地から栄養支持に加えて、またために、神経突起接触依存性機構7の分泌された成長因子のncentrations。しかし、低密度海馬ニューロンは、個々のニューロンは、その全体が撮像されたまたはICC分析のために染色することができる形態学的研究のために望ましいです。低密度ニューロンが原因パラクリンサポートの欠如に培養中で維持するのは難しいですので、多くの場合、前の神経細胞培養の2に用意する必要があるグリア（典型的には皮質アストロサイト）フィーダー層からの栄養サポートを必要とします。時共培養グリア細胞フィーダー層を有する、低密度ニューロンをカバーガラス上で増殖させ、かつ低密度ニューロンおよびグリアが互いに対向するように、その後グリア層の上に反転されます。グリア細胞と神経細胞の間に小さな限られた空間は、「サンドイッチ」レイアウト2,8,9を作成するため、カバースリップの隅にパラフィンワックスのドットを配置することによって作成されます。低密度ニューロンはワット成長しますニューロンとグリアによって分泌された濃厚な要因と寛容な微小環境を作成し、グリア細胞とカバーガラスの間の限られた空間を、ithin。このアプローチは、したがって、ICC標識やライブイメージング研究を促進する、合理的に離れている低密度、完全に発達神経細胞が得られます。 ニューロン - グリア共培養の見かけ上の欠点は、脇に時間がかかり、面倒であることから、それはニューロン特異的、または細胞自律的、機構の研究を防ぐことです。このシステムははるかに複雑なin vivoでの神経組織よりもですが、分泌され、未完全に定義された要素を介してニューロンの発生にグリアの影響は実験10を混乱することができます。したがって、ニューロン特異的なメカニズムの研究、血清およびグリア支持層が必要で除去定義培養条件を必要とする実験です。以前の研究では、目を使用して（〜9000細胞/ cm 2）のニューロンの低濃度を培養することに成功しましたREE次元ヒドロゲルマトリクス11。比較的純粋な神経細胞集団は、グリアサポートなしで無血清条件下で高密度に培養することができるので、我々は、海馬神経細胞の超低密度で、高密度ニューロンでそれらを共培養することによって、無血清規定された培養培地中で増殖させることができるという仮説を立て従来採用ニューロン - グリア共培養に類似した方法。実際、「サンドイッチ」構成で高密度海馬ニューロン培養物は、最近、特殊な大細胞内分泌ニューロン12の小さな数をサポートするために使用されています。 したがって、高密度の神経細胞との共培養は、低密度ニューロンが長期生存を可能にするのに十分である栄養因子のサポートを受けることを可能にします。超低密度ニューロンを培養するこのプロトコルは、このように配合し、検証しました。プロトコルは、高密度を調製することにより、単一の実験内で実施することができる（〜250,000細胞/ ml）をDISsociated海馬ニューロンは、最初に、その後密度〜万ニューロンを得るために希釈を行う/ mLの（〜3,000の神経細胞/カバースリップ、または〜2,000の神経細胞/ cm 2）で大部分が低密度培養物を報告したよりもはるかに低い、2,3,9 、11,13。この培養条件は緩く「超低密度」培養と呼ばれ、「低密度」相互交換可能で使用されています。高密度ニューロンをポリ-D-リジンコートした24ウェルプレート上にプレーティングされます。低密度ニューロンをポリ-D-リシン被覆した12mmのガラスカバースリップ上に播種され、一方、別の24ウェルプレートの内側に配置されます。ニューロンが下降し、カバーグラスに添付された後に低密度ニューロンを付着させるとカバーガラスを2時間後に高密度ニューロンの上に反転しています。また、代わりに高密度ニューロン層、上記カバーガラスを上昇させるためにパラフィンワックスのドットを使用する、18 Gの注射針は、二つの平行なストライプで24ウェルプレートの底部をエッチングするために使用しました。その結果displプラスチックはガラスカバースリップのための高められたサポートを提供する隣接、出し抜か。このスペースは、一貫して濃縮された栄養因子との微小環境を提供しながら、十分な酸素と培地交換を可能にする150〜200ミクロンで測定されます。この状態で、低密度ニューロンが広範囲に成長し、培養3ヶ月を超えて生き残ることができます。これらのニューロンは、培養3週間後にGFPプラスミドでトランスフェクトされる場合には、樹状突起は、やたらと樹状突起棘がちりばめられています。原理の証明として、データは、この共培養系は、神経細胞が細胞の調査を容易にすることができるautaptic接続を形成し、ポリ-D-リジン「マイクロアイランド &#39;上に播種した海馬神経細胞の超低密度培養物をサポートすることを示すために提示されています-autonomous、ネットワークに依存しないメカニズム。

<table><tbody><tr><td>神経基礎媒体</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 21103-049</td><td>光から保護する</td></tr><tr><td>B27 サプリメント</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 17504-044</td><td>アリコート、0.6ml サイズで保存</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 35050-061</td><td>希釈 100X&nbsp;</td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌薬(AA)</td><td>Life Technologies</td><td>15240-096</td>希釈<td>100X&nbsp;</td></tr><tr><td>完全培養培地</td><td></td><td></td><td>ニューロベース液 1X B27、1X AA、1X GlutaMAX-I</td></tr><tr><td>ウォッシュ培地</td><td></td><td></td><td>「ニューロベースル培地」</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>と同じ <td>1X B27 サプリメント</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td> ニューロベース <td>0.6mg/ml</td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>M.W.70000-150000</td></tr><tr><td>ホウ酸緩衝液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768 (ホウ酸); 71997 (ホウ砂)</td> <td>1.24g ホウ酸 & 1.9g ホウ砂 400ml H2O、pH 8.5 HCl</td></tr><tr><td>12 mm 丸型ガラスカバースリップ</td><td>Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH</td><td>1001/12</td><td>No. 1 ガラス、カロライナ生物供給</td></tr><tr><td>proFection トランスフェクションキット</td><td>Promega</td><td>E1200</td> から購入 詳細については<td>、プロトコル</td></tr><tr><td>を参照してください。2X HEPES緩衝生理食塩水(HBS)</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td>詳細については、プロトコルを参照してください&nbsp;シ</td></tr><tr><td>リンジフィルター</td><td>Pall Corporation</td><td>4192</td><td>0.2um孔径</td></tr> トランスフェクショングレードのプラスミドDNA<tr><td>抗MAP2抗体</td><td>ミリポア</td><td>MAB3418</td><td>マウス抗体、クローンAP20</td></tr>抗p-タウ抗体の<tr><td></td><td>調製のための</td><td>Qiagen</td><td>12362</td></tr><tr><td></td><td>ミリポア</td><td>AB10417</td><td>ウサギポリクローナル抗体</td></tr><tr><td>抗NR1抗体</td><td>ミリポア</td><td>MAB1586</td><td>マウス抗体、クローンR1JHL</td></tr><tr><td>抗GluR1抗体</td><td>ミリポア</td><td>AB1504</td><td>ウサギポリクローナル抗体</td></tr><tr><td>ハンクの平衡塩溶液</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14025092</td><td>500mlサイズ</td></tr></tbody></table>

超低密度のために簡略化された方法、長期初代海馬ニューロンの文化

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

in vitroで初代海馬神経細胞を培養し、神経発達の多くの側面の機構的な尋問を容易にします。解離胚の海馬ニューロンは、多くの場合、無血清条件下で高密度にカバーガラス上で正常に成長することができますが、低密度培養は、通常、グリアフィーダー層でそれらを共培養することにより、栄養因子の供給を必要とする、の準備には時間がかかることがあります骨の折れます。また、グリアの存在は、ニューロン特異的メカニズムに関する結果と排除して研究の解釈を混乱させることができます。ここでは、簡略化された方法は、無血清条件下およびグリア細胞のサポートなしで、超低密度（〜2000ニューロン/ cm 2）で、長期（&gt; 3ヶ月）初代海馬神経細胞培養のために提示されています。低密度ニューロンをポリ-D-リシン被覆カバーガラス上で増殖させ、24ウェルプレート中で増殖させた高密度ニューロンに反転されます。代わりにbetweeスペースを作成するために、パラフィンドットを使用してのnは2ニューロン層、実験者は、単に低密度ニューロンの成長を助長する微小空間を作成するには、高密度のニューロンが存在する上、ウェルのプラスチック製の底をエッチングすることができます。共培養は、容易に、従って、これらのニューロンの形態学的および生理学的な研究を促進する、低密度ニューロンの有意な損失なし&gt; 3ヶ月間維持することができます。この成功した培養条件を説明するために、データは、長期培養後の低密度細胞における多量のシナプス形成を示すために提供されます。この共培養系はまた、ポリ-D-リジン基質したがってautaptic接続の形成の島で増殖させたスパース個々のニューロンの生存を促進します。

ここで説明するプロトコルは、フィーダー層としてのグリア細胞を必要とせずに成功した超低密度、純粋なグルタミン酸作動性ニューロンの長期培養を可能にします。プロトコルは、缶別々 （ポリ-D-リジンコーティングされたガラスカバースリップ上）（24ウェルをコーティングしたポリ-D-リジンで）高密度の調製および低密度ニューロンを含む図1に図解され、その後の共培養されます3ヶ月まで維持されます。 図2Aおよび2Bは、プレーティング後5日目に、高密度および低密度ニューロンの図です。低密度培養物は、密度の約30倍以下です。 Kaechとバンカー（2006）によって概説されるように、両方の神経細胞は、典型的な発達段階を経ます。 DIC画像（ 図2Cによって明らかにされるように14日目に、高密度および低密度ニューロンの両方が、精巧な樹枝状...

初代海馬ニューロンの低密度培養では、通常、神経栄養因子を供給し、寿命を維持するためにグリアフィーダー層が必要です。ここでは、高密度ニューロンフィーダー層の存在下でガラスカバースリップ上で超低密度ニューロンを培養する簡略化された方法について説明し、これにより特定のニューロン自律メカニズムの調査が容易になります。

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

本手順の目的は、免疫細胞化学的な標識およびニューロンの細胞自律的メカニズムの研究を容易にするため、超低密度でマウス初代海馬ニューロンの健全な長期培養系を確立することです。この手法は、神経形態におけるタンパク質の特異性や、発生における機能に関する研究など、神経科学研究分野におけるいくつかの重要な疑問を解明するのに役立ちます。本技術の主な利点は、グリアフィーダー層のサポートなしに、カバーガラス上でニューロンを超低密度で成長させることができる点にあります。手順の実演は、私の研究室の学生であるMariel Piechowiczが行います。高密度および低密度の24ウェルプレートをそれぞれ2枚ずつ用意してください。28ゲージの針を用いて24ウェルプレートの底面をエッチングし、削り取られたプラスチックが、低密度ニューロンを培養したカバーガラスの支持体となるようにします。滅菌済みのガラスカバースリップを、低密度培養用に指定した2枚の24ウェルプレートに移します。4枚すべてのプレートに、ホウ酸緩衝液で希釈した0.1 mg/mL Poly-D-lysineを300 µLずつコーティングし、インキュベーターに戻して一晩コーティングします。組織採取の前に、氷冷した滅菌HBSSを満たした10 cmペトリ皿を2枚準備します。顕微鏡下で、ピンセットを用いて胚の頚部を固定し、小脳レベル直下の正中線上で最初の切開を行います。続いて、頭蓋底の左側を切開します。次に、頭蓋底の右側を同様に切開します。脳を容易に反転させて摘出できるよう、頭蓋骨と皮膚組織の吻側端の一部は切断せずに残しておきます。次に、脳をHBSS溶液に転移させます。脳に大きな欠損部位がなく、完全な状態であることを確認してください。次に、20 mLの冷HBSSバッファーを入れた新しいシャーレを用いて、残りの胚脳を回収する手順を繰り返します。各脳を腹側が上になるように配置します。ピンセットで脳の尾側端を固定しながら、鋭利なツイーザーを用いて、吻側の中間点から尾側側頭部にかけて斜めに切開します。もう一方の半球についても同様に繰り返します。その後、海馬を保持したまま、2つの半球を脳幹組織から分離します。すべての脳でこの手順を繰り返し、切断したすべての半球を合わせてまとめます。次に、2組のピンセットを使用して髄膜を取り除きます。側頭葉の内側に折りたたまれた曲線状の構造として発達中の海馬を特定し、隣接する皮質組織から分離します。すべての海馬組織を回収し、まとめて集めます。この手順では、解剖したすべての海馬を15 mLコニカルチューブに入った酵素消化液に移します。次に、チューブをウォーターバスに入れ、37 °Cで25分間インキュベートします。25分後、酵素溶液を慎重に取り除きます。次に、加温した洗浄液を5 mL加え、全量を10 mLにします。チューブをゆっくりと5回転がし、組織を穏やかに洗浄します。洗浄液を除去し、さらに洗浄を行うため、再び10 mLの洗浄液を加えます。その後、洗浄液を除去し、新鮮な温めた洗浄液を3 mL再び加えます。チューブを手で15回激しく振って、消化されたニューロンを組織から剥離させます。細胞が組織から洗浄液中に分離されると、洗浄液は濁った状態になります。次に、チューブ内に残った組織はそのままにして、細胞懸濁液を新しい15 mLコニカルチューブに回収します。その後、組織にさらに2 mLの洗浄液を加え、プラスチックピペットで15回トリチュレーションして、残りの組織を穏やかに分離します。細胞懸濁液を5分間静置した後、回収済みのシェイクオフ細胞が入った新しい15 mLコニカルチューブに合わせてまとめます。次に、ヘモサイトメーターを用いてニューロンの密度をカウントします。1 mLあたり250,000個のニューロン密度にするために必要な細胞懸濁液の量を算出し、30 mLの完全培地を含む2本の円錐チューブのうち1本に加えて、高密度ニューロン播種用培地を作成します。この高密度ニューロン溶液を1.2 mL分、もう一方の30 mLの完全培地に転移して、1 mLあたり10,000個のニューロン濃度の溶液を作成し、この溶液を用いて低密度カバースリップに播種します。本手順では、高密度ニューロン用エッチング底 24ウェルプレートを培養フード内に設置します。真空吸引によりプレコンディショニング済み培地 300 µL を除去し、続いて高密度細胞懸濁液（250,000 neurons/mL）を 0.6 mL 播種します。カバーガラス付きの別の2枚の24ウェルプレートを培養フード内に設置します。真空吸引により、プレコンディショニング済みの培地を300 µL除去し、カバーガラス上に低密度細胞懸濁液（10,000 neurons/mL）を0.6 mL播種します。その後、4枚の24ウェルプレートすべてをインキュベーターに戻し、2時間インキュベートします。その後、ニューロンが付着した低密度カバーガラスを反転させて高密度培養側に合わせ、ニューロン同士が向き合うように配置します。続いて、共培養した2枚のプレートをインキュベーターに戻します。DIV 5に、300 µLの新鮮な供給培地を添加して共培養細胞に栄養を与えます。この初回供給後は、毎週各ウェルにサイトシンアラビノシドを含まない新鮮な供給培地を300 µL添加します。培養を1カ月以上にわたって維持する場合は、1カ月後の時点から毎週、培地の半分を新鮮な供給培地と交換してください。形態学的に、高密度および低密度のニューロンはいずれも3カ月まで健全な状態を維持するはずです。ここでは、免疫細胞化学的標識を用いて機能的なグルタミン酸作動性シナプスを明らかにし、NMDA受容体サブユニットNR1およびApoE受容体サブユニットGluR1を二重染色で標識します。機能的なシナプスは、Image Jを用いて容易に同定および定量することができます。低密度ニューロンは、軸索タンパク質マーカーであるp-Tauと組み合わせて、樹状突起タンパク質マーカーMAP2に対する抗体で標識されます。この二重標識により、樹状突起と軸索を明確に区別することが可能です。低密度培養においても、リン酸カルシウム法を用いてDNAプラスミドを導入することに成功していますが、導入率は通常、後期の段階では非常に低くなります。この図は、EGFPのトランスフェクションによってニューロンの形態を明らかにでき、微細な樹状突起スパイン構造を可視化できることを示しています。最後に、概念実証として、オートサイナプス形成を促進する条件下で超低密度ニューロンを育成することが可能です。Poly-D-lysineでコーティングされたマイクロアイランド上で育成されたこれらの超低密度オートサイナプスニューロンは、この共培養プロトコルを用いることで、高密度フィーダーニューロンによって2か月以上にわたって維持することができます。この手法を習得すれば、適切に行った場合、細胞培養当日に2〜3時間で完了させることができます。この手順において、ガラスカバースリップと24ウェルプレートの底面をPoly-D-lysineでコーティングすることが極めて重要です。プレート底面の簡単なエッチングにより、低密度の海馬ニューロンがカバースリップ上で成長するための機械的および栄養的なサポートを十分に提供できます。このビデオを視聴することで、グリアフィーダー層を用いずに、超低密度でマウス胎生海馬一次ニューロンを培養する方法を十分に理解できるはずです。この手法をぜひご自身の実験目的にお役立てください。

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Neuroscience

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私達は非常にフィーダーグリア細胞層を使用せずに出生マウスの脳から海馬神経細胞の精製培養のためのプロトコルを提供しています。...

胎児マウスから海馬ニューロンの単離および培養

ビデオは、マウスの海馬からニューロンを培養する方法を示しています。最初に、海馬は酵素消化を受けて細胞外組織マトリックスを分解します。その後、消化された組織は機械的に破壊され、個々のニューロンが分離されます。最後に、これらのニューロンをグリアフィーダー細胞上で培養します。...

マウス海馬ニューロンの培養技術

このビデオでは、凍結保存された胚性ニューロンの培養方法を示しており、解凍を制御し、神経基底培地で希釈し、ポリ-L-リジンでコーティングしたプレートに播種します。その後のインキュベーションは、ニューロン接続の成長と維持をサポートします。...

凍結胚性ニューロンからの低密度初代ニューロン培養物の生成

このビデオでは、高密度のニューロンフィーダー層の存在下で超低密度のニューロンを培養する方法を実演しています。これは、密度の異なるニューロンの共培養を確立し、物理的に近接します。高密度ニューロンが分泌する成長因子は、ニューロンの生存と成長を助け、超低密度ニューロンを長期間維持します。...

高密度ニューロンフィーダー層を用いた超低密度ニューロン培養物の作製

このビデオは、酵素的および機械的な解離を使用して、海馬組織サンプルからの海馬ニューロンの解離と培養を示しています。Ara-Cによる治療は、非ニューロン細胞の増殖を阻害し、海馬ニューロンの選択的増殖を促進します。...

海馬組織サンプルからのニューロンの解離と培養

この記事では、グリア単層の上に反転したカバーガラス上で成長する低密度初代海馬神経細胞を培養するためのプロトコルを記述しています。ニューロンとグリアの層は、パラフィンワックスビーズで分離されています。この方法によって成長させた神経細胞は、高分解能光学イメージングおよび機能アッセイに適しています。...

低密度初代海馬ニューロンの文化

このプロトコルは、一次神経細胞培養におけるタンパク質の共局在化を研究するために超解像顕微鏡を採用する方法を示す。...

一次ニューロンにおけるタンパク質とシナプスマーカーの共局在化を研究する超分解能イメージング

すぐに使用できるニューロンの凍結ストックは、シナプス機能を評価するための強力なツールです。ここでは、96ウェルプレートを用いた凍結ストックからの容易な低密度初代培養を紹介します。...

胚性海馬ニューロンの凍結ストックを用いた容易で再現性の高い低密度初代培養

学ぶ、マウス海馬ニューロンの超低密度初代培養法。グリア飼育層を不要とし、ニューロン自律的メカニズムの研究や免疫細胞化学ラベリングを可能にする簡略化された長期培養技術です。

超低密度のために簡略化された方法、長期初代海馬ニューロンの文化

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