超低密度のために簡略化された方法、長期初代海馬ニューロンの文化
2016年3月5日
初代海馬ニューロンの低密度培養では、通常、神経栄養因子を供給し、寿命を維持するためにグリアフィーダー層が必要です。ここでは、高密度ニューロンフィーダー層の存在下でガラスカバースリップ上で超低密度ニューロンを培養する簡略化された方法について説明し、これにより特定のニューロン自律メカニズムの調査が容易になります。
この手順の全体的な目標は、免疫細胞化学の標識とニューロン細胞の自律メカニズムの研究を容易にするために、超低密度で初代マウス海馬ニューロンの健康な長期培養を確立することです。この研究は、神経形態学におけるタンパク質の特異性、発達機能の研究など、神経科学研究の分野におけるいくつかの重要な問題を理解するのに役立ちます。この技術の主な利点は、ニューロンがグリアフィーダー層のサポートなしにカバースリップ上で超低密度で成長できることです。
その手順を実演するのは、私の研究室の学生であるMariel Piechowiczです。高密度プレート2枚と低密度24ウェルプレートを2枚ご用意します。28ゲージの針を使用して、24ウェルプレートの底をエッチングし、変位したプラスチックがカバースリップのサポートとして機能し、その上に低密度のニューロンが成長します。
滅菌ガラスカバーを、低密度培養用に指定された2つの24ウェルプレートに移します。4つのプレートすべてをホウ酸塩緩衝液で希釈した0.1ミリグラム/ミリリットルのPoly-D-リジンを300マイクロリットルでコーティングし、それらをインキュベーターに戻して一晩インキュベーションコーティングします。ティッシュを採取する前に、氷冷した滅菌HBSSを充填した10cmのシャーレを2枚用意します。
顕微鏡下で、鉗子で胚を首で保持し、最初のカットを正中線の右側、小脳レベルより下で行います。その後、頭蓋骨の基部の左側に切り込みを入れます。次に、頭蓋骨の基部の右側に別の切り込みを入れます。
頭蓋骨と吻側端の皮膚組織のごく一部を切除せずに残し、脳全体を簡単に脇にひっくり返すことができるようにします。次に、脳をHBSSソリューションに移します。脳を検査して、肉眼的な切断領域がなく無傷であることを確認します。
次に、この手順を繰り返して、残りの胚の脳を20ミリリットルの冷たいHBSSバッファーを含む新しいシャーレに収集します。各脳を腹側を上にして配置します。尾側端の鉗子で脳を押さえながら、鋭いピンセットで中吻側頭部と尾側頭領域との間に斜めに切り込み
を入れます。もう一方の半球についてもこれを繰り返します。その後、海馬が無傷の2つの半球を脳の残りの幹組織から分離します。すべての脳に対して手順を繰り返し、解剖されたすべての半球を一緒にプールします。
次に、2組のピンセットを使用して髄膜を取り除きます。発達中の海馬を側頭葉の内側に折りたたまれた湾曲した構造として特定し、隣接する皮質組織から海馬を分離します。すべての海馬組織を集めてプールします。
この手順では、解剖されたすべての海馬を15ミリリットルの円錐管内の酵素消化溶液に移します。次に、チューブをウォーターバスに入れ、摂氏37度で25分間インキュベートします。25分後、酵素溶液を慎重に取り出します。
次に、5ミリリットルの温かい洗浄媒体を追加して、総容量を10ミリリットルにします。チューブをゆっくりと5回反転させて、ティッシュをやさしく洗います。洗浄液を取り出し、さらに洗浄するために、10ミリリットルの洗浄液を再度追加します。
その後、ウォッシュメディウムを取り出し、再度3ミリリットルの新鮮な温かいウォッシュメディウムを追加します。チューブを手で15回強く振って、消化されたニューロンを組織から取り除きます。細胞が組織から分離されて洗浄培地に入ると、培地は濁るはずです。
次に、細胞懸濁液を新しい15ミリリットルの円錐管に集め、残りの組織をチューブに残します。その後、さらに2ミリリットルの洗浄液をティッシュに加え、プラスチックピペットで15回トリチュアして残りのティッシュを穏やかに分離します。細胞懸濁液を5分間放置してから、集めた振れ細胞を含む新しい15ミリリットルの円錐管にプールします。
次に、血球計算盤でニューロンの密度をカウントします。ミリリットルあたり250, 000ニューロンの密度を得るために必要な細胞懸濁液量を計算し、それを30ミリリットルの完全な培養培地を含む2つの円錐管の1つに加えて、高密度ニューロンプレーティング培地を生成します。この高密度ニューロン溶液の1.2ミリリットルを別の30ミリリットルの完全な培養培地に移して、ミリリットルあたり10, 000ニューロンの濃度を生成し、この溶液を使用して低密度カバースリップを播種します。
この手順では、高密度ニューロン用のエッチングされた底部を持つ24ウェルプレートを培養フードに配置します。真空によって前調節された媒体の300マイクロリットルを取除き、次に250、000ニューロン/ミリリットルで高密度細胞懸濁液の0.6ミリリットルをめっきする。カバースリップ付きの他の2つの24ウェルプレートを培養フードに入れます。
カバースリップに1ミリリットルあたり10, 000ニューロンで0.6ミリリットルの低密度細胞懸濁液をめっきする前に、真空で前処理された媒体の300マイクロリットルを取り出します。その後、4つの24ウェルプレートすべてをインキュベーターに戻し、2時間インキュベートします。その後、ニューロンを付着させた低密度カバースリップを高密度培養物に裏返し、ニューロンが互いに向き合っていることを確認します。
その後、共培養した2つのプレートをインキュベーターに戻します。DIV 5で300マイクロリットルの新鮮な飼料培地を追加して、共培養物に給餌します。この最初の給餌に続いて、毎週各ウェルにシトシンアラビノシドを含まない300マイクロリットルの新鮮な飼料培地を追加します。
培養物を1か月以上保持する場合は、1か月の時点を超えて毎週、培地の半分を新鮮な飼料培地に交換します。形態学的には、高密度ニューロンと低密度ニューロンの両方が最大3か月まで健康に見えるはずです。ここでは、免疫細胞化学標識を用いて、NMDA受容体サブユニットNR1とApoE受容体サブユニットGluR1が二重染色で標識された機能的なグルタミン酸作動性シナプスを明らかにします。
また、機能的なシナプスは、画像J.Low-densityニューロンは、樹状タンパク質マーカーMAP2に対する抗体で、軸索タンパク質マーカーp-Tauと組み合わせて標識することもでき、画像Jを使用して容易に同定および定量化できます。この二重標識により、樹状突起と軸索を明確に区別できます。低密度培養物は、リン酸カルシウム法を使用してDNAプラスミドでトランスフェクションすることもできますが、トランスフェクション速度は通常、後の段階では非常に低くなります。
この図は、EGFPトランスフェクションがニューロンの形態を明らかにし、細かい樹状突起スパイン構造を可視化できることを示しています。最後に、概念実証として、超低密度ニューロンは、アウタプス形成を促進する条件下で成長させることができます。Poly-D-リジンでコーティングされたマイクロアイランド上で成長したこれらの超低密度オータプティックニューロンは、この共培養プロトコルにより、高密度フィーダーニューロンによって2か月以上維持することができます。
この技術を習得すると、適切に実行すれば、細胞培養当日に2〜3時間で行うことができます。この手順を試みる際には、ガラスカバースリップと24ウェルプレートの底部をPoly-D-リジンでコーティングすることが重要です。プレートの底部をエッチングするだけで、カバースリップ上で成長する低密度の海馬ニューロンに機械的および栄養的なサポートを提供するのに十分です。
このビデオを見れば、グリアフィーダー層がない場合に、超低密度の初代マウス胚性海馬ニューロンを成長させる方法についてよく理解できるはずです。うまくいけば、この方法をあなた自身の実験目的に利用できるでしょう。
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概要
この記事では、ガラスカバースリップ上で超低密度で初代マウス海馬ニューロンを培養する方法を紹介します。この技術はグリア供給層の必要性を排除し、ニューロンの自律メカニズムの研究を可能にします。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- ニューロン培養技術
背景
- 初代海馬ニューロンは通常、成長のためにグリアのサポートを必要とします。
- 超低密度培養は特定のニューロン機能の研究を強化できます。
- ニューロンメカニズムの理解は神経科学研究にとって重要です。
- この方法はニューロンの健康を維持しながら培養プロセスを簡素化することを目的としています。
研究の目的
- 初代海馬ニューロンの長期培養を確立すること。
- 免疫細胞化学的ラベリングを促進すること。
- ニューロンの自己調整メカニズムを調査すること。
使用された方法
- 高密度および低密度24ウェルプレートの準備。
- 28ゲージ針でプレートの底をエッチングすること。
- 低密度ニューロン成長のためにカバースリップの使用。
- 実験室の学生による手順のデモンストレーション。
主な結果
- 超低密度ニューロン培養の成功した確立。
- ニューロンはグリアサポートなしで健康と寿命を維持しました。
- ニューロンメカニズムの研究を効果的に促進しました。
- 将来の研究応用のための簡素化された方法を提供しました。
結論
- この方法はニューロンの自己調整メカニズムの研究を可能にします。
- 初代ニューロンの培養プロセスを簡素化します。
- このアプローチは神経科学の研究を強化できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Establishing ultra-low density primary hippocampal neuron cultures without glial support enables mechanistic interrogation of cell-autonomous neuronal functions, reducing confounding variables in target validation. This approach supports predictive confidence in early discovery by isolating intrinsic neuronal phenotypes relevant to neuropsychiatric and neurodegenerative disease models. Long-term culture stability (>3 months) facilitates sustained assay windows for lead compound screening and phenotypic screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neuronal cell-autonomous mechanisms by eliminating glial feeder layer variability.
- Operational Value: Simplifies culture workflow by removing time-consuming glial preparation and maintenance steps.
- Predictive Value: Supports target de-risking through isolated study of protein function in neurite morphology and synaptic formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a stable, serum-free, glial-free platform for quantifying synapse formation and dendritic spine morphology over extended periods.
- Operational Value: Etched well-bottom microspaces allow reproducible, low-density neuron seeding without physical spacers, enhancing assay standardization.
- Scalability: Compatible with standard 24-well plates and coverslips, enabling integration into existing imaging and transfection workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Ultra-low density autaptic neuron cultures model isolated neuronal circuit function, relevant to studying hyperexcitability in epilepsy and autism spectrum disorders.
- Mechanistic De-risking: Enables longitudinal observation of neuronal health and synaptic marker expression (e.g., NR1, GluR1, MAP2, p-Tau) to assess compound effects on neuronal integrity.
- Assay Continuity: Supports immunocytochemistry and transfection-based readouts for target engagement and pathway modulation studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early neuronal phenotype screening to mechanistic follow-up in lead optimization, particularly for CNS-targeted programs requiring neuronal health readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neuronal-autonomous pathways by isolating intrinsic growth and synaptogenesis without glial interference.
- Screening: Enables reproducible, low-density plating for high-content imaging of dendritic complexity and spine density as phenotypic endpoints.
- Analytics: Facilitates quantitative immunocytochemistry and image-based analysis of synaptic puncta and axonal-dendritic compartmentalization.
- Translational Research: Autaptic neuron islands allow study of isolated synaptic function, modeling monosynaptic circuit disruptions in disease.
- Enterprise Reuse: Poly-D-lysine coated coverslips and etched plates represent a low-cost, reusable platform for long-term neuronal culture across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuronal studies by eliminating glial-derived trophic and signaling confounders.
- Operational Value: Eliminates need for glial feeder layer preparation, reducing culture setup time and technical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence in CNS target validation by providing cleaner phenotypic readouts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on neuron-specific functional data rather than mixed glia-neuron responses.
Implementation Considerations
- Requires aseptic technique for hippocampal dissection and enzymatic dissociation of embryonic mouse tissue.
- Depends on precise Poly-D-lysine coating of glass coverslips and 24-well plate surfaces for neuron adhesion.
- Necessitates micro-etching of well plate bottoms with a 28-gauge needle to create supportive microspaces for coverslips.
- Relies on weekly feeding with fresh medium (without cytosine arabinoside after DIV5) to maintain culture health beyond one month.
- Limited transfection efficiency at later stages may require alternative methods (e.g., viral vectors) for genetic manipulation in mature neurons.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:59
24-well Plate Preparation for High and Low Density Neuron Culture
1:48
Brain Removal and Hippocampi Dissection of E16.5 - E17.5 Mouse Embryos
4:02
Enzymatic Digestion and Separation into Single Neurons
6:53
Plating of Neurons and Long Term Co-Culture
8:51
Results: Experimental Manipulations of Low Density Neurons Grown in Co-Culture
10:23
Conclusion
