インビボDrosophila melanogasterにおけるシナプス局在カルシウムセンサを用いたカルシウムイメージング

脳を露出させたハエをイメージングチャンバーで固定します。

ハエは、遺伝的にコードされたカルシウム指標、またはキノコ体の樹状突起またはMBニューロンに局在するGECIを発現します。

ハエを電線で接続し、アンテナの近くに臭気伝達針を配置します。

露出した脳に緩衝液滴を追加し、ハエを顕微鏡下に置き、針を臭気伝達システムに接続します。

GECIを励起し、臭気刺激を届けます。

臭気物質はアンテナの感覚ニューロン受容体に結合し、活動電位を生成します。

活動電位は感覚ニューロンから投射ニューロンに伝播し、神経伝達物質の放出を誘導し、シナプス後MBニューロンにおけるカルシウムの流入とGECI

2番目と3番目の臭気剤で繰り返します。

次に、最初の臭いを感電させ、2番目の臭いを感電させずに適用します。

最後に、3つの臭いを衝撃なく届けます。蛍光を記録します。

対照と比較してショック関連刺激に応答して蛍光が減少すると、学習誘発シナプス可塑性が明らかになります。

GFPベースのカルシウムインジケーターを可視化するには、赤外線レーザーを搭載した多光子顕微鏡のレーザーと、防振テーブルに設置した水浸対物レンズのレーザーを励起波長920ナノメートルに調整し、GFPバンドパスフィルターを設置します。粗いZ調整ノブを使用して、脳のZ軸をスキャンして、関心のある脳領域を見つけます。

切り抜き機能を使用して、スキャン時間を最小限に抑えるために対象領域のみにスキャンの焦点を合わせ、頭の前が下を向くようにスキャンビューを回転させます。次に、フレーム サイズを 512 x 512 ピクセルに調整し、各フレームの計算されたスキャン時間を考慮してスキャンする領域を選択して、少なくとも 4 ヘルツのフレーム レートを実現します。

臭気誘発カルシウム過渡可視化では、臭気伝達プログラムで画像取得ソフトウェアをリンクできる事前にプログラムされたマクロパッケージを開始し、顕微鏡ソフトウェアで6.25秒間測定を開始して、F0ベースライン値を確立します。

臭気伝達システムでは、特定の臭気カップバルブの開閉によってトリガーされるLEDの照明によって示される2.5秒間の臭気刺激を伝達し、続いて臭気オフセットの終了時に12.5秒間の記録を行います。次に、同じ方法で2回目、3回目の臭気剤の送達を繰り返します。

このセットアップで連想条件付けを実行するには、コンピューター制御の臭気伝達システムを使用して、条件付けされた刺激と臭気を12〜90ボルトの電気ショックとともに60秒間提示します。60秒間の休憩後、感電せずに60秒間、匂いを引いた条件刺激のみを提示します。トレーニングフェーズの終了から 3 分後に、トレーニング前の臭気刺激プロトコルを繰り返して、トレーニング後の臭気誘発カルシウムの一過性を再度測定します。