フローサイトメトリーを用いたニューロンにおける複数のミトコンドリアパラメータの測定

固定および透過処理されたニューロンをチューブに入れます。

非特異的抗体結合を防ぐためにブロッキングバッファーを追加します。

懸濁液を遠心分離し、上清を除去します。次に、ニューロンをバッファーに再懸濁します。

懸

濁液を、タグなしおよび蛍光色素タグ付き一次抗体を含むチューブに均等に移します。

イン

キュベートすると、抗体がニューロン内のミトコンドリア呼吸鎖またはMRC複合体サブユニット、ミトコンドリアDNA関連タンパク質、およびミトコンドリア外膜タンパク質に特異的に結合します。

結合していない抗体をすべて除去します。

タグなしの一次抗体に結合する蛍光色素タグ付き二次抗体とインキュベートします。

混合物を遠心分離し、上清を廃棄します。

ニューロンをバッファーに再懸濁し、微量遠心チューブに移します。

フローサイトメトリーを実行して、MRC複合体サブユニットの発現レベルと相対的なミトコンドリアDNAレベルの測定に対応する標識ニューロンの蛍光シグナルを検出します。

サンプル

を1ミリリットルのブロッキングバッファーでブロックし、示されているようにPBSで遠心分離して細胞を洗浄します。異なるミトコンドリア複合体とサブユニットを検出するには、テキスト原稿に記載されているそれぞれの一次抗体で細胞を30分間インキュベートします。PBSで細胞を一度洗浄した後、二次抗体で細胞を30分間インキュベートします。

インキュベーションの最後に、示されているように細胞を洗浄し、PBSで再懸濁します。細胞懸濁液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、暗所で氷の上に保管します。次に、フローサイトメーターで細胞を分析し、信号を検出し、530/30バンドパスフィルターを使用して1つをフィルタリングします。