Name: 異なる均質化法を通じてマウス脳/脊髄から取り出された複数の細胞型の同時フロー細胞特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-19T01:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学ぶマウス脳と脊髄から複数細胞型を同時に同定するフローサイトメトリー法。神経変性疾患における細胞集団の分離と標的評価に応用可能です。

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この研究は、ボストン小児病院のスタートアップ資金によってA.B.、ALSA助成金nrに資金提供されました。17-IIP-343からM.P.、および筋萎縮性側索硬化症研究プログラムを通じて国防次官補室賞No.W81XWH-17-1-0036 から M.P.DFCIフローサイトメトリーコアの技術サポートを認めます。

ここで説明するすべての方法は、ダナ・ファーバー癌研究所(プロトコル番号16-024)の制度動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. 実験に必要なソリューションの準備
<ol><li>10x HBSSを滅菌水で希釈して、1xハンクのバランスのとれた塩溶液(HBSS)を調製します。氷の上で溶液を事前に冷やします。各サンプルには少なくとも25mLの溶液が必要です。</li>
	<li>10x滅菌HBSS 1:10と密度勾配培地(すなわち、Percoll)を混合して等張性パーコール溶液(IPS)を調製します。氷の上で冷やす前に。 注:IPSは4 °Cで最大30日間保存することができます。</li>
	<li>フローサイトメトリー(FACS)ブロッキング(BL)溶液(1%ウシ血清アルブミン[BSA]、リン酸緩衝生理食塩水[PBS]中の5%ウシウシ血清[FBS])を調製する。氷の上で冷やす前に。</li>
</ol>2. 心内灌流と組織解剖による動物安楽死
注:8週齢のC57BL/6Jマウスは、どちらかの性別で、実験に用いた。PBS溶液による灌流は、組織消化を進める前に、臓器からの血液汚染を排除するために行われる。
<ol><li>ケタミン/キシラジン(90−200 mg/kgケタミン、10 mg/kgキシラジン)の混合物を使用してマウスを麻酔する。マウスを背面に置き、各四肢をサポートまでテープで留める。離脱反射を確認して、麻酔の十分な深さを確認します。</li>
	<li>胸骨を露出させるために胸部入口のレベルで中線の皮膚切開を行う。鉗子を使用して胸骨の先端をつかみ、リブケージの両側に1cmの切開を行います。最後に横隔膜を切り取り、胸骨を広く開いて心臓を可視化します。</li>
	<li>鉗子を使用して心臓を右心室で穏やかにつかみ、中線まで持ち上げて胸から少し出す。</li>
	<li>左心室の先端、大直田に向かって23Gの蝶の針を挿入し、しっかりと保持します。</li>
	<li>1x PBS で灌流を開始します。はさみを使用して右のオーリクルを貫通し、排煙が循環を終了できるようにします。PBS の流量を 3 mL/min に設定し、1x PBS の少なくとも 15 mL でパーフューズを設定して、組織が明確であることを確認します。 注:肝臓と腸間膜血管のブランチングは良好な灌流の兆候です。必要に応じて、心臓から出る体液が血液を取り除くまで、予備の体積を増やすことができ、その時点でフラッシュラインを停止できる。</li>
	<li>灌流後、脊髄から脳を切り離し、はさみと鉗子で頭蓋骨から脳を取り除く。解剖中の可視性と制御を高め、毛髪汚染物質を持ち越さないようにするために毛皮を取り外します。PBSで満たされた3 mLシリンジを使用して、脊髄をカラムから洗い流します。</li>
	<li>氷冷1x HBSSの2 mLをプレフィルした6ウェルマルチウェルプレートの井戸に各組織を移し、消化するまで氷の上に保ちます。</li>
	<li>脳と脊髄を縦線に沿って2つの半分に分けます。 注:各組織の半分が均質化され(以下のセクションを参照)、フローサイトメトリック解析が可能です。残りの半分は、代替分析のための異なる処理に割り当てることができます(例えば、組織学のためのパラホルムアルデヒド固定溶液に浸漬)。</li>
</ol>3. 脳と脊髄の酵素消化
注:このセクションで説明するボリュームは、半分の脳または脊髄の消化のために十分です。
<ol><li>はさみを使用して、組織を1-2mmの厚さにミンチします。</li>
	<li>1000°Lピペットの先端をはさみで切り、組織片の回収を可能にするのに十分な大きさにします。ピペットチップを1x HBSSで事前にすすします。次に、ピペットを使用して、15 mL円錐状チューブに細分化された組織を含むHBSS溶液の2 mLを移します。 メモ:ピペット先端の事前すすりは、先端の内側のティッシュピースの粘着性を防ぐために重要です。</li>
	<li>氷冷1x HBSSの追加の2 mLで井戸を洗浄し、組織片を含む対応する15 mL円錐形チューブに溶液を移します。</li>
	<li>各サンプルを4°Cで250 x gで5分間遠心分離します。</li>
	<li>神経組織解離キットの酵素ミックス1を調製する(NTDK;材料表)酵素Pの50μLをサンプルあたり1900μLの緩衝液Xと混合することにより。温かい酵素は、水浴中の37°で1を混合する。酵素の完全な活性化を可能にするために、使用前に少なくとも10分間37°Cで酵素ミックス1をインキュベートする。</li>
	<li>15mL円錐管から上清を吸引し、各サンプルに1.95mLの酵素ミックス1を加える。穏やかに渦をしてペレットが再懸濁していることを確認します。</li>
	<li>37°Cで15分間、ホイールまたはシェーカーのサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>一方、10μLの酵素Aとサンプル当たり20μLの緩衝液Yを混合することにより、NTDKの酵素ミックス2を調製する。水浴中の37°Cで溶液を事前に温めます。</li>
	<li>酵素ミックス1によるインキュベーションの終了時に、各試料に30μLの酵素ミックス2を加える。</li>
	<li>1x HBSSでプリリンスされた1000 μLピペットチップで上下にピペットを取り込んでサンプルを軽く混ぜます。</li>
	<li>37°Cで15分間、ホイールまたはシェーカーにサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>インキュベーション後、各チューブに10mLの氷冷1x HBSSを加えて、酵素ミックス1と酵素ミックス2を不活性化します。</li>
	<li>各サンプルを4°Cで320 x gで10分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を捨てる。氷冷1x HBSSを各チューブに7mLの最終容積まで加え、ボルテックスによってペレットを穏やかに再懸濁します。</li>
	<li>破片の取り外しについては、セクション 5 に進みます。</li>
</ol>4. 脳と脊髄の機械的均質化
注:このセクションで説明するボリュームは、半分の脳または脊髄の均質化に十分です。このセクションで説明するプロトコルは、以下で説明するユーザーのニーズに応じて、セクション 3 で説明する方法の代替方法として使用できます。
<ol><li>氷の上にセットされたDounceティッシュグラインダー(材料のテーブル)のガラスモルタルを事前に冷やします。</li>
	<li>モルタルに3mLの予冷済み1x HBSSを加えます。</li>
	<li>6ウェルプレートのウェルからガラスモルタルに組織(脳または脊髄)を移し、1x HBSSに浸漬し、モルタルの底部に座っていることを確認します。</li>
	<li>10ストロークの害虫Aで組織を穏やかに粉砕し、続いて10ストロークの害虫B.均質化ミックスを新しい15 mL円錐チューブに移します。</li>
	<li>予め冷めた1x HBSSを使用してチューブを10mLの最終容積に充填し、4°Cで320 x gで10分間遠心分離機を使用します。</li>
	<li>上清を吸引し、7 mLの最終容積まで各チューブに氷冷1x HBSSを加え、ボルテックスによってペレットを穏やかに再懸濁します。</li>
	<li>破片の取り外しについては、セクション 5 に進みます。</li>
</ol>5. デブリ除去
注:未消化組織とミエリン鞘を主成分とする破片の除去は、その後のフローサイトメトリック分析のために組織ホモジネートの効率的な染色を可能にする重要なステップです。
<ol><li>70μmの細胞ストレーナーを通して各サンプルを濾過し、未消化組織チャンクを除去します。これらのサンプルは、その後のステップに影響を与える可能性のある未消化神経断片または髄質を含む可能性が高いので、脊髄組織を扱う場合、このステップは特に重要です。</li>
	<li>各サンプルチューブの最終体積が7mLであることを確認します。そうでない場合は、7 mLまでの氷冷1x HBSSで満たします。</li>
	<li>各サンプルに3mLのプレチルドIPSを加え、最終濃度30%の密度勾配培地を含む溶液の最終体積を10mLにします。サンプルを穏やかに渦巻き、それらが均一に混合されていることを確認します。</li>
	<li>18°Cで700 x gで15分間の遠心分離サンプルを行い、遠心分離機の加速度を7、ブレーキを0に設定します。 注:遠心分離には約30分かかります。</li>
	<li>遠心分離機からサンプルを繊細に取り除く。 メモ:破片とミエリンで構成された白っぽいディスクは、溶液の表面に浮かんで見える必要があります。ペレット(目的の細胞を含む)は、チューブの下部に表示する必要があります。</li>
	<li>慎重に破片のすべての白っぽいディスクを吸引し、その後、上清の残りの部分は、ペレットを外さないようにしてください。誤って解き放つリスクを避けるために、約100μLの溶液を細胞ペレットの上に置きます。</li>
	<li>FACS BLを1mL加え、1000 μLピペットチップで上下にピペットを取り替えてペレットを再サスペンドし、サンプルを1.5 mLチューブに移します。</li>
	<li>室温(RT)で450 x gで5分間遠心分離機。</li>
	<li>上清を穏やかに吸引し、下流解析と互換性のある適切なバッファーでペレットを再サスペンドします(複数の細胞タイプのフローサイトメトリック評価に使用されるプロトコルについてはセクション6を参照)。</li>
</ol>6. 複数の細胞型のフローサイトメトリック評価のための染色
<ol><li>FACS BLの350°Lでステップ5.9で得られたペレットを再サスペンドし、最終濃度5μg/mLで各サンプルにFcブロックを追加します。 注:サンプルの少なくとも100°Lは、信頼性の高い分析を可能にするために十分な細胞を処理するために、1つの染色に使用する必要があります。</li>
	<li>染色を進める前に、4°Cで10分間サンプルをインキュベートします。</li>
	<li>表1に記載の抗体ミックスを調製する。</li>
	<li>各チューブに抗体ミックスを加え、5°の渦を加え、暗闇の中で4°Cで15分間サンプルをインキュベートします。</li>
	<li>各チューブ、渦、遠心分離機に1mLのPBSを加え、RTで450 x gで5分間追加します。</li>
	<li>一方、表1に従ってストレプトアビジンミックスを調製する。</li>
	<li>上清を廃棄し、ステップ6.6で調製したストレプトアビジンミックスでペレットを再サスペンドする。各サンプルについて、ステップ6.4の染色に使用したものと同じボリュームを使用します。</li>
	<li>5s用渦と暗闇の中で4°Cで10分間サンプルをインキュベートする。</li>
	<li>各チューブ、渦、遠心分離機に1mLのPBSを加え、RTで450 x gで5分間追加します。</li>
	<li>上清を廃棄し、FACS BLでペレットを再サスペンドします。</li>
	<li>各サンプルに7-アミノ-アクチノマイシンD(7-AAD)溶液を加えます。ステップ6.10で調製したサンプルの300μLごとに、7-AADの5μLを使用します。</li>
	<li>細胞フルオリメトリック分析まで、サンプルを暗闇の中で4°Cで保存します。サンプル調製から16時間以内に分析を行い、細胞生存率を60%保証します。</li>
</ol>

<ol><li>Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+neurological+disorders%3A+progress+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).</li>
<li>Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterials+for+Drug+Delivery+to+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System.</a> Nanomaterials. 9 (3), 371(2019).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Viral+Vectors+as+Neuroscience+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools.</a> Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67(2019).</li>
<li>Alves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy+as+a+novel+tool+to+unravel+the+tropism+of+AAV+gene+therapy+vectors+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain.</a> Scientific Reports. 6 (1), 28272(2016).</li>
<li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+carrying+enhancer+elements+of+Hb9+promoter+drive+selective+transgene+expression+in+mouse+spinal+cord+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Sykora, M. M., Reschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+of+Tissue+Samples+Using+Multicolor+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).</li>
<li>Legroux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+to+process+mouse+CNS+to+simultaneously+analyze+neural+cells+and+leukocytes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).</li>
<li>Lee, J. K., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Isolation+from+Adult+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia Isolation from Adult Mouse Brain.</a> Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).</li>
<li>Grabert, K., McColl, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Phenotyping+of+Adult+Mouse+Microglial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).</li>
<li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635(2012).</li>
<li>Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+of+mouse+microglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis of mouse microglial cells.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).</li>
<li>Papa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Nanovector+Mediated+Treatment+of+Activated+Proinflammatory+Microglia%2FMacrophages+in+Spinal+Cord+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury.</a> ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).</li>
<li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+the+Sigma-1+receptor+%28S1R%29+agonist+PRE-084%2C+in+a+mouse+model+of+motor+neuron+disease+not+linked+to+SOD1+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation.</a> Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).</li>
<li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+polymeric+nanoparticles+administered+in+the+cerebrospinal+fluid%3A+Brain+biodistribution%2C+preferential+internalization+in+microglia+and+implications+for+cell-selective+drug+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release.</a> Biomaterials. 209, 25-40 (2019).</li>
<li>Meng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD73-derived+adenosine+controls+inflammation+and+neurodegeneration+by+modulating+dopamine+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling.</a> Brain. 142 (3), 700-718 (2019).</li>
<li>Nedeljkovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+regulation+of+ecto-5%27-nucleotidase%2FCD73+and+A2AR-mediated+adenosine+signaling+at+neurovascular+unit%3A+A+link+between+acute+and+chronic+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Complex regulation of ecto-5'-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation.</a> Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

ここでは、マウス脳および脊髄からの最も関連性の高いCNS細胞の共精製および同時フローサイトメトリック分析のためのプロトコルについて説明する。従来、組織学的解析は、CNS5、13におけるナノ粒子の分布またはウイルスベクターの伝達効率を記述するために適用されてきたが、病理学または薬理学的治療14の間に特定の細胞型で起こる形態学的および分子変化に関する洞察を提供する。しかし、組織学はプロセス性に欠けており、同時に分析できるマーカーの数が限られているため、同じ組織学的サンプル内の複数の特徴を包括的に検査することはできません。当社のアプローチは、従来の組織学的分析を補完するものであり、複数の下流アプリケーション(ソート、一次培養、生化学的または次世代シーケンシング分析)と組み合わせることで、個々のサンプルから得られる情報のコンパイルを拡大することができます。ただし、このアプローチの成功に重大な影響を与える可能性があるため、以下に示す主な要因を考慮する必要があります。
<ol>...

遺伝子および薬物送達技術(ウイルスベクターやナノ粒子など)は、神経変性疾患で変化した特定の分子経路に関するより良い洞察を得るために、および革新的な治療アプローチの開発のために適用することができる強力なツールとなっています。これらのツールの最適化は、定量化に依存します: (1) 管理の異なる経路上の CNS の浸透の程度と (2) 特定の細胞集団のターゲティング.組織学的解析は、通常、異なるCNS領域および異なる細胞型にわたって蛍光レポーター遺伝子または蛍光タグ付きナノ粒子を可視化するために適用され、特定の細胞マーカー4、5に対する免疫染色によって同定される。このアプローチは、投与された遺伝子または薬物送達ツールの生体分布に関する貴重な情報を提供しますが、(1)組織固定、凍結保存またはパラフィン埋め込みおよびスライスが必要なため、この技術は時間がかかり、手間がかかがあります。(2)特定の細胞マーカーの染色は、時には抗原検索を必要とする;(3)蛍光顕微鏡による取得は、通常、同じ実験内の限られた数の異なるマーカーの分析を可能にする。(4)画像処理により、目的の信号を適切に定量化できるようにする。
フローサイトメトリーは、非常に特異的な蛍光マーカーを利用して、表面または細胞内抗原の発現に基づいて細胞懸濁液中の異なる細胞表現型の迅速な定量的評価を可能にするだけでなく、機能的測定(例えば、アポトーシスの速度、増殖、細胞周期分析など)を可能にする広く使用されている技術となっています。蛍光活性化細胞選別による細胞の物理的分離も可能であり、さらなる下流用途(例えば、細胞培養、RNAseq、生化学的分析など)6、7、8。
組織均質化は、信頼性が高く再現性のある下流フローサイトメトリック評価を可能にするために、単一細胞懸濁液を得るために必要な重要なステップです。成人脳組織均質化には、主にミクログリア細胞9、10、11を単離することを目的として、異なる方法が記載されている。それらは、(1)ダウンスホモジナイザー(DH)を介して粉砕またはせん断力を使用してニッチから細胞を分離し、比較的均質化された単一細胞懸濁液を形成する機械的解離の2つの主要なカテゴリーに分類することができ、 (2)酵素消化は、トリプシンまたはパパインなどのタンパク質分解酵素の存在下で37°Cでのミンチ組織塊のインキュベーションに依存し、細胞外マトリックスの分解を支持し、かなり均質化された細胞懸濁液12を作成する。
どの方法が利用されているかに関係なく、組織均質化後に精製工程を行い、密度勾配の遠心分離を通してミエリンを除去するか、磁気選択9、12を経下流アプリケーションに移すことをお勧めします。
ここでは、パパイン消化(PD)に基づく組織処理方法を説明し、続いて密度勾配を精製し、マウス脳または脊髄から生存可能な異種細胞懸濁液を時間感受性の方法で得るように最適化し、フローサイトメトリーに適した。さらに、9色のフローサイトメトリーパネルと、我々は、異なるCNS集団、生死細胞または緑色蛍光タンパク質やロダミン色素などの蛍光レポーターのための陽性の同時判別を可能にするために実験室で採用したゲーティング戦略を説明します。このフローサイトメトリック分析を適用することにより、異なる細胞の生存率および異なる細胞タイプの収率の保存の観点から、組織処理の異なる方法、すなわちPD対DHを比較することができる。
本明細書で提供される詳細は、目的の特定の細胞タイプと下流分析(例えば、温度感受性)に基づいて、フローサイトメトリーパネルで使用する均質化プロトコルと抗体の組み合わせに関する決定を指示することができますアプリケーション、特定の蛍光マーカーの追跡、インビトロ培養、機能分析)。

<table><tbody><tr><td>10X HBSS (カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムフリー)</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>70 mm Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>ACSA/ACSA2 抗マウス抗体</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-117-535</td><td>APC 標識</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CD11b ラット抗マウス抗体</td><td>Invitrogen</td><td>47-0112-82</td><td>APC-eFluor 780 標識</td></tr><tr><td>CD31 ラット抗マウス抗体</td><td>BD Bioscience</td><td>562939</td><td>BV421 標識</td></tr><tr><td>CD45 ラット抗マウス抗体</td><td>Biolegend</td><td>103138</td><td>Brilliant Violet 510 標識</td></tr><tr><td>CD90.1/Thy1.1 ラット抗マウス抗体</td><td>Biolegend</td><td>202518</td><td>PE/Cy7 標識</td></tr><tr><td>CD90.2/Thy1.2 ラット抗マウス抗体</td><td>Biolegend</td><td>1005325</td><td>PE/Cy7 標識</td></tr><tr><td>コニカルチューブ (15 mL)</td><td>CellTreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ (50 mL)</td><td>CellTreat</td><td>229422</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinder set (乳鉢と乳棒 A および B を含む)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9063-1SET</td><td></td></tr><tr><td>Fc (CD16/CD32) ブロックラット抗マウス抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ベンチマーク</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>神経組織解離キット (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>O4 抗マウス/ラット/ヒト抗体</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-895</td><td>ビオチン結合</td></tr><tr><td>パーコール</td><td>GEヘルスケア</td><td>10266569</td><td>無菌試薬として販売</td></tr><tr><td>パーコール</td><td>シグマ</td><td>65455529</td><td>滅菌試薬(無菌性が必要なアプリケーションに使用する)</td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>Sigma</td><td>GE17-5445-01</td> 微<td>量のエンドトキシン</td></tr><tr><td>ストレプトビジン</td>を含む <td>Invitrogen</td><td>S3258</td><td>Alexa Fluor 680 コンジュゲート</td></tr></tbody></table>

異なる均質化法を通じてマウス脳/脊髄から取り出された複数の細胞型の同時フロー細胞特性評価

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

ウイルスベクターおよびナノマテリアル科学の最近の進歩は、中枢神経系(CNS)を調査または操作するための新しい最先端のアプローチの道を開きました。しかし、これらの技術のさらなる最適化は、体内のウイルスベクターまたはナノ粒子の投与におけるCNSおよび細胞特異的ターゲティングの程度の迅速かつ合理化的な決定を可能にする方法から利益を得るであろう。ここでは、フローサイトメトリーの高スループットと多重化機能を利用して、マウス脳または脊髄から分離された異なる細胞サブタイプ、すなわちミクログリア/マクロファージ、リンパ球、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロンおよび内皮細胞を簡単に定量することを可能にするプロトコルを提示する。このアプローチを適用して、細胞収率、生存率、組成の観点から2つの組織均質化方法間の重要な違いを強調する。これにより、対象のセルの種類と特定のアプリケーションに応じて最適な方法を選択するようにユーザーに指示できます。この方法は、組織が単細胞懸濁液を生成するために均質化されているので、解剖学的分布の分析には適さない。しかし、それは生存可能な細胞と組み合わせることができ、それは、純粋な細胞集団に由来する一次培養の確立から、神経変性疾患の文脈でよく定義された細胞サブタイプに対する遺伝子発現解析や生化学的または機能的アッセイに至るまで、神経科学者の手でツールのレパートリーを拡大することができるいくつかのアプリケーションのための道を開く、細胞ソートと組み合わせることができます。

マウスの脳と脊髄に適用される2つの異なる均質化方法(DH対PD)を比較し、下流のアプリケーションに適した異なる生存細胞タイプを取得する際の効率をテストしました。そのために、ミクログリア、リンパ球、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、内皮を含む異なるCNS細胞型を特徴付けるように設計された9色フローサイトメトリーパネルを利用しました。
脳および脊髄組織を異なるマウスから取り出し(n≥6)、縦方向に2つの半分に分割し、Dounceホモジナイザー(DH法)を用いて機械的破壊を適用するか、またはパパイン(PD法)に基づく市販のNTDKを用いて穏やかにミンチおよび消化した酵素を用いて並行して処理した(図1A)。破片除去後、脳または脊髄からの細胞をそれぞれ1/10または1/2−1/5に希釈し、トリパンブルーでノイバウアーチャンバーで細胞収率および生存率を決定した(図1B,C)。DH法は、全体的に...

マウスの脳や脊髄から取り出した異なる細胞の種類を同時に同定するためのフローサイトメトリー法を提示する。この方法は、神経変性疾患における純粋な細胞集団を単離または特徴付けたり、ウイルスベクターまたはナノ粒子の生体内投与を標的とする細胞の程度を定量化するために利用され得る。

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

神経変性疾患を治療するための選択的遺伝子および薬物送達ツールの開発には、細胞標的化の定量化および特性評価、再投与時、またはウイルスベクター、またはナノ粒子が必要である。それらは流れのサイトメトリーの多重性および多重化機能を有し、マウスの脳および脊髄からの複数の細胞タイプの簡単で、同時の識別を可能にする。手順を実証するフランシスコ・ハビエル・モリーナ・エステベス, アレクサンダー研究所のポストドキュメント.生後8週間のC57ブラック6マウスから脳と脊髄を採取した後、氷の上の井戸あたり2ミリリットルの氷冷HPSSを含む6ウェルプレートの個々の井戸に組織を入れる。収穫した各組織を2つの等しい部分に分けます。そして、各組織サンプルの半分を1〜2ミリメートルの厚さにミンチするためにはさみを使用してください。すべての組織が断片化されたら、HPSSで改変された1,000マイクロリットルピペットチップをプレリンスし、ピペットを使用して各組織懸濁液を個々の15ミリリットルの円錐管に移す。井戸ごとにHPSSの追加の2ミリリットルで井戸をすすい。そして、対応する15ミリリットルの円錐管でのすきを引っ張ります。遠心分離によりサンプルを沈下する。そして、サンプル当たりのキットから1,900マイクロリットルのバッファXと神経組織解離キットから酵素Pの50マイクロリットルを混合します。酵素ミックスを摂氏37度で少なくとも10分間温めます。そして各組織採取管から上清を吸引する。酵素混合物の準備ができたら、各サンプルに溶液の1.95ミリリットルを追加します。そして、ペレットを再中断するために穏やかに渦。次に、ホイール上のサンプルを摂氏37度で15分間インキュベートし、10マイクロリットルの酵素Aを1サンプル当たり20マイクロリットルのバッファーYと混合します。2番目の酵素溶液を摂氏37度で予熱し、振盪インキュベーションの終わりに各組織溶液に30マイクロリットルの溶液を加える前に。HPSSでプレリンスした1,000マイクロリットルのピペットチップを使用して、各サンプルを穏やかに混合します。そして、37°Cで15分間ホイールに標本を戻します。インキュベーションの終わりに、氷冷HPSSの10ミリリットルで酵素反応を逮捕する。そして遠心分離によってサンプルを沈下する。遠心分離の終わりに、チューブあたり7ミリリットルの氷冷HPSSでペレットを再懸濁する。そして、氷の上にチューブを保持する前に、各サンプルを穏やかに渦。組織均質化の場合は、冷やしたHPSSを、日当りのある組織グラインダーの前チルガラスモルタルに3ミリリットル加え、収穫された脳または脊髄組織サンプルの1つの後半をモルタルに移す。10ストロークのペスレAで組織を穏やかに浸漬し、続いて10ストロークのペストルB.を新しい15ミリリットル円錐形チューブに移します。チューブを10ミリリットルの最終体積に、遠心分離のためにあらかじめ冷やしたHPSSで満たします。そして、氷の上にサンプルを保持する前に、渦を持つ新鮮なHPSSの7ミリリットルでペレットを再中断します。破片除去の場合は、消化または均質化されたサンプルごとに、冷やされた等張性パーコール溶液を3ミリリットル加えます。そして、サンプルが均一に混合されていることを確認するために、サンプルを穏やかに渦巻きます。次に、サンプルを遠心分離し、溶液の表面に浮かぶ破片およびミエリンの白っぽい円盤を慎重に取り除く。破片が廃棄されたら、ペレットを邪魔することなく、各チューブから上澄みの最後の100マイクロリットルを除くすべてを収集します。個々の1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移すFACS BL溶液の1ミリリットルの各ペレットを再中断します。Percollソリューションとの統合後、サンプル損失を避けるために細胞ペレットを取り外すことなく、非常に慎重に破片ディスクと上澄を除去することが重要です。遠心分離後、各チューブから上清を慎重に吸引し、1管当たり350マイクロリットルの新鮮なFACS BLでペレットを再懸濁します。単離された細胞タイプのフローサイトメトリック解析の場合、表に概説されている定常プロトコルに従って各チューブに適切な抗体を加える前に、チューブ当たりFCブロック当たり5マイクログラムのFCブロックを摂氏4度で10分間インキュベートします。各チューブを5秒間渦を混ぜ合わせます。そして、光から保護された15分間、サンプルを摂氏4度に置きます。インキュベーションの終わりに、チューブあたり1ミリリットルのPBSと遠心分離機でサンプルを洗浄します。チューブ当たりのストレプトアビジンの適切な量でペレットを再中断します。混合するボルテックスの後、光から保護された摂氏4度で10分間サンプルをインキュベートします。そして、実証されているように、チューブあたりPBSの1ミリリットルで細胞を洗います。上清を捨て、チューブあたり300マイクロリットルの新鮮なFACS BLでペレットを再懸濁します。そして、各サンプルに7-AADの5マイクロリットルのラベルを付けます。次に、光から保護された4°Cで、細胞蛍光測定分析までサンプルを保存します。ホモジナイゼーション法は、脳と脊髄の両方からより高い細胞収量を生成するが、取り出される細胞の大部分は、典型的には死んでしまい、その結果、脳から生じる細胞の治癒は約14%であり、約10%は脊髄から治癒する。対照的に、パパイン消化法は、細胞生存率の全体的により良い保存をもたらす。9色のバイフローサイトメトリーを用いた脳および脊髄細胞懸濁液の分析は、CD45+CD11b+ミクログリア、およびマクロファージの存在を明らかにする。そして、両方の組織のCD45 +CD11bリンパ球。CD45細胞集団は、その後、アストロサイト、オリゴデンドロサイトマーカー、またはフェリオンおよび内皮表面マーカー発現の陽性に従って識別することができる。均質化法を用いて、生存細胞の32〜38%が造血起源である。酵素消化法は非造血性CD45細胞の非常に大きな割合の取得をもたらす一方で.驚くべきことに、CD45+CD11b+ミクログリアおよびマクロファージは、均質化法を用いた最も豊富な生存細胞分率を表す。しかし、消化法は、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、内皮細胞、ニューロンを含む細胞タイプのより異種的な表現を生み出す。このプロトコルは汎用性が高く、特定の細胞の亜集団の定量化または単離、一次培養、生化学的、RNAシーケンシング分析など、いくつかの下流アプリケーションに利用される可能性があります。我々は、この進行の間、または内視鏡的側索硬化症のマウスモデルにおける治療後に、異なるCNS集団の遺伝子発現および機能的シグネチャを評価するためにこのプロトコルを実施した。

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現在の記事は、効率的効果的にフローサイトメトリー分析に利用することができる脳や脊髄の組織から単核細胞を分離するために迅速なプロトコルを記述します。...

パーコール勾配を用いて脳と脊髄単核細胞の単離

フローサイトメトリーによる負傷者/病理学的な中枢神経系における細胞性炎症の定量は感度/精度を低下させる、細胞に類似した大きさと造粒を持つことができる脂質/ミエリン破片によって複雑になる。我々は、ミエリン破片を除去し、損傷した脊髄のフローサイトメトリーによって細胞の検出を向上させるために細胞の調製法を進めてきた。...

フローサイトメトリーによって負傷した脊髄組織における免疫細胞の定量的評価：セルの精製方法のための新しい使用法

このビデオは、マウスの脳組織から複数の種類の細胞が分離されることを示しています。ティッシュは、まずティッシュグラインダーを塩溶液中で機械的に剪断し、浸透圧バランスを維持します。次に、組織ホモジネートを密度勾配遠心分離にかけ、細胞の破片を除去します。その後、細胞を溶液に再懸濁して、さらなる分析を行います。...

機械的均質化によるマウス脳からの複数細胞タイプの単離

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一時的または恒久的な脳虚血モデルにおける白血球亜集団の立体解析とフローサイトメトリーキャラクタリゼーション

炎症は虚血性脳卒中の病因において中心的な役割を果たします。証拠の増加は、それが初期の脳損傷を悪化させるだけでなく、後の修復にも寄与する両刃の剣として機能することを示唆しています。このプロトコルは、虚血性脳からの免疫細胞の単離と、その後のフローサイトメトリー表現型について記述しています。...

虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

このプロトコールは、成体マウス中枢神経系におけるマクロファージ亜集団のフローサイトメトリーによる分析を提供し、これらの細胞によって発現される複数のマーカーの研究に有用である。...

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

マウスの坐骨神経内のセルのコンテンツの定量的解析は組織の欠乏のために困難です。このプロトコルでは、組織の消化と個々...

単一の坐骨神経とフローサイトメトリーを使用して単一のマウスの後根神経節における免疫系細胞の解析

この神経細胞解離プロトコルは、出発物質の量が少ないサンプルを対象としており、オプションの固定および染色ステップで、下流分析用の生存率の高い単一細胞懸濁液を生成します。...

マウス脳海馬組織の機械的解離と酵素的解離の複合

これまでのところ、すべての主要な中枢神経系常在細胞タイプを同じマウスから同時に単離するためのプロトコルは、満たされていない需要です。プロトコルはneuroinflammationの間に複雑な細胞ネットワークを調査し、同時に必須のマウス数を減らすために素朴で、実験的な自己免疫の脳脊髄炎のマウスで適当なプロシージャを示す。...

成体自己免疫性脳脊髄炎マウスからの主要な中枢神経系常在細胞型の同時単離

脳疾患に対する免疫応答を調べるために、免疫細胞の変化を解析するアプローチが一般的です。ここでは、マウスの脳組織と頭蓋骨骨髄から免疫細胞を単離するための2つの簡単で効果的なプロトコルが提供されています。...

マウスの脳と頭蓋骨からの免疫細胞の単離

このプロトコルは、フローサイトメトリーとシングルセルRNAシーケンシングを組み合わせて、出生後早期マウス脳の小脳におけるミクログリア細胞の状態を単離し、特徴付けます。酵素解離、パーコール遠心分離、免疫染色を使用してミクログリアの不均一性を明らかにし、小脳の発達と疾患におけるミクログリアの役割の理解を深めます。...

出生後早期マウス脳発生におけるミクログリア活性化を特徴付けるためのフローサイトメトリーと単一細胞解析

学ぶマウス脳と脊髄から複数細胞型を同時に同定するフローサイトメトリー法。神経変性疾患における細胞集団の分離と標的評価に応用可能です。

異なる均質化法を通じてマウス脳/脊髄から取り出された複数の細胞型の同時フロー細胞特性評価

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