マウス脳スライス中の化合物に対するミクログリアプロセス引力を研究するための2光子顕微鏡

マウスの脳スライスを、aCSFを含む灌流室に2光子顕微鏡下で置きます。

このマウスはミクログリアでGFPを発現するように遺伝子操作されており、ミクログリアの動きの追跡が可能です。

スライスをホルダーで固定します。

明視野照明を使用して、関心のある領域を見つけます。

蛍光照明に切り替えて、ミクログリアを視覚化します。

マイクロピペットに試験化合物を充填し、シリンジホルダーに取り付け、スライスに触れるように下げます。

2光子イメージングモードをアクティブにし、低エネルギーの近赤外光を組織に集束させます。

レーザーの焦点では、2 つの光子がエネルギーを結合して GFP を励起し、蛍光を放出します。

複数のZ平面で画像をキャプチャして、ミクログリア突起に焦点を当てます。

ベースライン活性を記録し、化合物を注入して記録を続行します。

この化合物はミクログリア受容体に結合し、ミクログリアプロセスの拡張を化合物源に向かって推進するシグナル伝達経路を引き起こします。

注射部位付近の蛍光の増加を経時的に監視して、動きを追跡します。

記録を開始する30分前に、蠕動ポンプを上下灌流を備えたカスタマイズされた記録チャンバーに接続して、組織スライスの酸素化と生存率を最適化し、灌流システム全体を50ミリリットルの超純水で洗浄します。洗浄サイクルの最後に、一定の炭素生成下でガラスビーカー内の50ミリリットルのaCSFで記録チャンバーの灌流を開始し、使い捨ての広口トランスファーピペットを使用して、画像化される最初のスライスをビーカーに移し、レンズペーパーを取り除きます。

セクションがビーカーの底に沈んだら、セクションを記録チャンバーに移し、スライスホルダーをスライスに配置して、灌流流によって誘発される動きを最小限に抑えます。明視野照明を使用して、5〜10倍の倍率で関心のある脳領域をターゲットにします。次に、25倍の対物レンズと0.35倍の水浸レンズを使用して、視野の位置を調整します。

蛍光照明を使用して蛍光ミクログリア細胞を特定し、最終濃度で目的の化合物を含む10マイクロリットルのaCSFをピペットに埋め戻します。チップを軽く振って下に向け、チップに閉じ込められた気泡を取り除き、充填されたピペットを5ミリリットルのシリンジに接続されたピペットホルダーに取り付け、プランジャーを5ミリリットルの位置に配置し、3軸マイクロマニピュレーターに取り付けます。

ピペットチップがスライスの表面に軽く触れるまで、ピペットをスライスに向かってゆっくりと下げ、対物レンズの制御と調整を同時に行います。次に、レーザーを調整し、顕微鏡を多光子モードに切り替えます。チャンバーが光源から遮蔽されていることを確認し、デスキャンされていない検出器のスイッチを入れます。ゲインを設定し、画像内のピクセルが飽和しないように、色分けされた上限を持つルックアップ テーブルを使用します。

次に、合計少なくとも30分間記録を開始し、5分後にシリンジプランジャーを5〜1ミリリットルの位置からゆっくりと押し下げて、5秒間にわたってコンパウンドを切片に適用します。画像解析では、まず目的のファイルに対してImageJでZ投影とドリフト補正を行います。次に、変更したファイルを Icy で開き、注射部位を中心とする直径 35 マイクロメートルの円形の関心領域を描画します。

ROI を使用してムービーを再度実行し、適切な位置にあることを確認します。次に、関心領域のIntensity Evolutionプラグインを使用して、関心領域の経時的な平均強度を測定し、結果を.xlsファイルとして保存します。