覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

定位フレームに固定されたトランスジェニックマウスから始めて、その視覚野の上に頭蓋窓を埋め込みます。

マウスは、ミクログリアでEGFPを発現し、視覚野のニューロンで赤色蛍光カルシウム指示薬であるR-CaMPを発現します。

マウスを二光子顕微鏡下に置き、対物レンズを調整して脳表面に焦点を合わせます。

定位フレームの付いたマウスを対物レンズから移動し、シェーディング装置を取り付けます。

シェーディング装置に水を入れ、顕微鏡下でマウスの位置を変更します。

レンズを黒いホイルで覆います。

シェーディング装置とホイルは外部の光の干渉を遮断し、正確なイメージングを保証します。

マウスの目の前に液晶モニターを置き、視覚的な刺激を与えます。

イメージングパラメータを設定し、イメージングを開始します。

視覚刺激はニューロンの興奮を引き起こし、カルシウムの流入と R-CaMP 蛍光の増加につながります。

一方、ミクログリアは、ライブイメージングで観察されるように、活性化されたニューロンと相互作用しながらプロセスを後退させます。

特注のシェーディング装置と視覚刺激用の液晶モニターを取り付けるには、まずレンズを脳表面にピントを合わせます。そして、このレンズ位置を元のz位置として設定します。x、y座標を一定に保ち、対物レンズを持ち上げます。マウスと定位固定装置を対物レンズから取り外します。ヘッドプレートの上部にシリコンを使用して遮光装置を取り付け、ヘッドプレートと遮光装置の間のスペースがしっかりと密閉されていることを確認します。

遮光装置に蒸留水を入れます。次に、対物レンズの下に定位固定フレームでマウスを固定します。脳表面の焦点面を慎重にリセットし、対物レンズの奥行きを確認します。液晶モニターからの光の汚染を避けるために、対物レンズを黒いアルミホイルで覆います。10インチの液晶モニターをマウスの目の前12.5センチにセットして、視覚刺激を提示します。

EGFPとRCaMP用の蛍光発光収集フィルターと、励起波長を1,000ナノメートルに構成します。ピクセルあたり0.25ミクロンの空間分解能で画像を取得します。レイヤー2/3でRCaMP陽性ニューロンとEGFP陽性ミクログリアを同時に画像化できるイメージング領域を見つけます。

30ヘルツのフレームレートで画像を取得します。同時に、画像取得と同時に、0度から150度までの6方向で12方向、30度ステップでドリフトグレーティング視覚刺激をマウスに提示します。