マウス脳組織における狂犬病ウイルス感染の3次元可視化

狂犬病ウイルスに感染したマウスから固定された厚い脳切片を採取します。

ウイルスはニューロンに感染して複製し、その結果、細胞内にウイルスタンパク質が存在します。

細胞膜を透過性化する界面活性剤と、非特異的結合部位をマスクするブロッキング溶液で処理します。

ウイルスタンパク質を標的とする一次抗体とインキュベートし、続いて一次抗体に結合する蛍光色素結合二次抗体とインキュベートします。

蛍光核酸結合色素で処理して核を標識します。

アルコール濃度を上げて組織を脱水し、透明化溶液を塗布してイメージング用の組織の透明性を高めます。

切片をイメージングチャンバーに取り付け、透明化液で満たし、密封します。

共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して、蛍光標識を使用して組織を個別に画像化し、それらを結合して 2 次元画像を作成します。

組織全体のさまざまな焦点面で画像を取得し、それらを組み合わせて、感染の進行を評価するための3次元表現を生成します。

脳組織切片の免疫染色のために、サンプルを4ミリリットルの0.2%トリトンX-100のPBS中で1時間2回洗浄し、続いて4ミリリットルの0.2%トリトンX-100、20%ジメチルスルホキシド、および0.3モルグリシンのPBSで摂氏37度で2日間透過処理します。4ミリリットルの0.2%Triton X-100、10%ジメチルスルホキシド、および6%正常血清をPBS中で摂氏37度で2日間、非特異的結合をブロックします。

ブロッキングインキュベーションの最後に、サンプルを2ミリリットルの一次抗体溶液で摂氏37度で5日間標識し、2日半後に抗体溶液をリフレッシュします。次に、PBS中の0.2%トゥイーン20および10マイクログラムのヘパリン1ミリリットルでサンプルを1日洗浄し、1日の間に少なくとも4〜5回洗浄バッファーを交換し、最終洗浄を一晩放置します。

翌日、サンプルを2ミリリットルの二次抗体溶液で摂氏37度で5日間インキュベートします。次に、示されているように、4ミリリットルの新鮮な0.2%トゥイーン20および10マイクログラムのヘパリンPBSでサンプルを洗浄します。

サンプルの核染色の場合は、4ミリリットルの核酸染色剤TO-PRO-3で、光から保護してサンプルを5時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、示されているように、サンプルを0.2%トゥイーン20および10マイクログラム/ミリリットルヘパリンPBSで洗浄し、続いて、上昇tert-ブタノール系列で1次2時間、浸漬ごとに2時間脱水します。

90%浸漬後、サンプルを96%tert-ブタノール溶液に一晩移します。翌朝、サンプルを100%tert-ブタノールでさらに2時間脱水してから、新たに調製したBABB-D15で光学的に透明になるまで2〜6時間組織切片を除去します。その後、サンプルをBABB-D15に保管し、取り付けとイメージングまで光から保護することができます。

サンプルの取り付けには、3D プリンターを使用してイメージング チャンバーと蓋を印刷します。直径30mmのカバーガラスを、1つのコンポーネントの室温加硫シリコーンゴムを使用してイメージングチャンバーに取り付けます。同様に、22ミリメートルのカバーガラスを蓋に取り付けます。水で濡らした綿棒を使用して、ゴムを一晩硬化させる前に、両方のリングの余分なシリコーンゴムを取り除きます。

翌日、サンプルをイメージングチャンバーに入れ、蓋を挿入する前に少量のBABB-D15をチャンバーに加えます。皮下注射針を使用して、入口からチャンバーにBABB-D15を充填し、入口を塞いでからイメージングチャンバーをシリコーンゴムで密閉します。

画像取得を設定するには、使用する蛍光色素に適したレーザーラインを選択し、各検出器の検出範囲を調整して、チャネル間の信号の重複を防ぎます。次に、取得パラメータを設定し、スタックの上下の境界線を定義して、画像スタックを取得します。

画像スタックの 3D 投影を生成するには、フィジーで画像ファイルを開き、[画像]、[カラー]、[チャンネル ツール]、[その他]、および [チャンネルの分割] を選択して、結合された画像を個々のチャンネルに分割します。各チャンネルの画像のブリーチ補正を行うには、[画像]、[調整]、[ブリーチ補正]を選択し、[シンプル比率]を選択します。スライダーを使用して各チャンネルの明るさとコントラストを調整し、[画像]、[色]、および[チャンネルの結合]を選択します。オプション「コンポジットの作成」にチェックを入れます。

画像をRGB形式に変換し、[画像]、[スタック]、[3Dプロジェクト]を選択して3D投影を生成します。投影方法として最も明るい点を選択し、取得した画像スタックのZステップサイズに合わせてスライス間隔を設定します。最高の品質を得るには、回転角度の増分を 1 に設定し、補間を有効にします。必要に応じて、Total rotation、Transparency thresholds、Opacity を変更します。次に、3D 投影法を両方として保存します。TIFF および .AVI ファイル形式。