Name: 滴タイトルセルのカプセル化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T13:09:54.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: 学ぶ3Dバイオプリンティングにおける細胞カプセル化技術。ソレノイドバルブを用いた精密な細胞射出と培地・ゲルによる細胞生存性の維持方法を解説。組織工学への応用可能性を探る。

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NIH3T3細胞の準備： イジェクト用A.セル<ol><li>細胞をトリプシン処理し、細胞培地で1:1に希釈し、T75フラスコから15mlのファルコンチューブに移す</li><li>遠心分離によってペレットに細胞をスピンダウン、上清を吸引し、DPBSで細胞を洗浄</li><li>再びペレットに細胞をスピンダウンし、上清を吸引除去する</li><li>メディアに懸濁し</li><li>血球計（〜200 T75フラスコあたりのX 10 4細胞/ mL）で細胞密度を決定する</li><li> 、細胞溶液を遠心上清を吸引除去し、細胞濃度を変化させるためのメディアの適切な量で再懸濁します。 </li></ol> B.セルの取り出し<ol><li>取り出しのために使用する前に渦細胞</li><li>シリンジに細胞溶液200μLを転送する</li><li>パルス発生器で適切なモードを設定します。 <ol><li>イジェクト単一の液滴と、複数の液滴のために（バースト）、&quot;E. BUR&quot;モードにパルスジェネレータを設定する</li><li>連続的な液滴の吐出の場合は、&quot;NORM&quot;モードにパルスジェネレータを設定する</li></ol></li><li>信号の設定を変更する<ol><li>ハイレベルとローレベルの出力電圧を設定する：5 VまでとLOL 0 VにHILと&quot;LIM&quot;LEDが点灯していることを確認してください</li><li>方形パルスとして信号を設定します。 </li><li> （&quot;DUTY&quot;）電磁弁は、&quot;WID&quot;の値を変更するか、デューティサイクルを変更することにより、液滴吐出用に開いている時間の量を変更</li><li> &quot;PER&quot;の値を変更することにより、放出の周波数を変更する</li><li> &quot;BUR&quot;の値を変更することにより、バーストで放出された液滴の数を変更する</li></ol></li><li>顕微鏡でイメージングするため、プリペアド基板上に細胞液を取り出します</li></ol> C.染色<ol><li> DPBSのmL当たり0.5μLカルセイン- AM、2μLのエチジウムホモ二量体と色素溶液を作る</li><li>色素溶液に浸します調製した基質</li><li>サンプルは37℃で10分間インキュベートすることができます·イメージングの前にC </li></ol>実験の検証<ol><li>ニコンのEclipse TE - 2000 U蛍光顕微鏡で<ol><li>スポット高度なソフトウェア（診断、（株）） </li><li> LIVE / DEADアッセイ</li></ol></li></ol>

著者に開示すべき事項はありません。

<table><tbody><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td></td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse TE-2000 U</td><td></td></tr><tr><td>ソレノイドバルブ式細胞イジェクタ</td><td></td><td></td><td></td><td>動作周波数: 1 KHz, 30psi, 50nl~0.5ul. 12V バルブドライバー: ドライブ電流 2.5 Amp</td></tr><tr><td>5ガロン携帯用エアタンク</td><td></td><td>Coleman</td><td>Powermate CT5</td><td>加圧空気: 30 PSI</td></tr><tr><td>圧力レギュレーター</td><td></td><td>Marsh Bellofram</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パルスジェネレーター</td><td></td><td></td><td>HP8112A</td><td>駆動周波数生成: 50 MHz</td></tr><tr><td>XYZステージ</td><td></td><td>Newmark Systems</td><td></td><td>ステッピングモーター付き: 6インチ移動xyステージ(NLS4-6-25), 2.5インチ移動zステージ(NLS4-2.5-25), 3軸コントローラー(NSC-G3), 分解能 0.1um</td></tr><tr><td>NIH 3T3</td><td>細胞株</td><td></td><td></td><td>線維芽細胞</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td></td><td></td><td></td><td>0.05% 溶液</td></tr><tr><td>NIH 3T3細胞培地</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>緩衝液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75</td><td></td><td></td><td></td><td>組織培養フラスコ</td></tr><tr><td>プラスチック製コニカルチューブ</td><td></td><td></td><td></td><td>15 ml, 組織培養用</td></tr></tbody></table>

滴タイトルセルのカプセル化

Title Cell Encapsulation by Droplets

私の名前はHang Moonです。私はコンドームの研究をしている教授とともに研究を行っています。私たちはXYJステージを用いて、細胞の3D構造を作成しています。こんにちは、PEとLynnです。細胞のカプセル化、培地、およびゲルを用いた細胞プリンティングプロジェクトに取り組んでいます。これは、細胞培地上に細胞および細胞混合物を噴射するためのソレノイドバルブです。このソレノイドバルブは2本の信号線によって作動します。信号線は、こちらのドライボードから来ています。信号はここから送られてきます。このラインを通って、関数信号発生器へと繋がっています。まず、プログラムされた方法で生成されます。パルスを変更したい場合は、スイッチの行でプログラムを変更するか、コンピューターでプロセスジェネレーターを制御してください。電磁弁は電気信号によって開閉されますが、セルはそのラインを通じて供給されます。細胞および培地またはアグロゲルは、シリンジを介して供給されます。水の中にあるシリンジの内部は、空気によって軽く加圧されています。加圧空気は、こちらのラインのようなタンクから供給されます。このように、細いラインを通ったイオン化空気はエアフィルターを通過します。エアフィルターは、埃やその他の汚れを分離します。圧力発生器と呼ばれる装置は、ソーラーエアバルブを開閉するために使用される信号を生成します。コンピューターはP-I-B-U-S-Vコネクタを通じて接続されています。USBポートを使用して、コンピューター（ノートパソコン）に直接接続できます。こちら側で接続し、こちらの制御用ノートパソコンで操作を行います。ステージの移動とベルの開閉の動作を同期させたい場合、ラップトップなどの同一のコントローラーで制御することが可能です。これにより、開閉のタイミングや、移動および停止のタイミングを制御できるため、動作とベルの開閉を同期させることができます。このステージは電動ステージです。デッド信号線とモーターによって自動的に移動します。モーターの分解能は0.1 micrometersです。これにより、理想的には最大100 mmの線を描くことができます。ジェット軸がこのように上下に移動することで、基板とソーラーベルトの間のギャップを制御します。これにより、射出の高さを制御することが可能です。基板は、こちらのXステージおよびあちらのYステージに接続されており、XY平面上を移動します。したがって、いくつかの機能デモの右側のステージは、X、Y、およびZの3軸で構成されています。ジェットコンジェット軸またはXY軸は、ここにある信号によって制御されています。信号線はこのモーションコントローラーに接続されています。このモーションコントローラーは、手動で制御することができないため、マニュアルスイッチは一切備わっていません。ノートパソコンで制御します。ノートパソコンが接続されています。コントローラーの背面には、プリンティングセルXYジェット用の3つのxがあります。これにより、3種類の異なる信号が独立して生成されます。その後、モーションコントローラーはRF 2, 3, 2コネクタを介してUSVに直接接続され、通信が行われます。そして、USVはノートパソコンに接続されます。ノートパソコンで制御されるボロウアーを使用します。AutoCADプログラムを用いて、このようにツールパスを作成します。そして、それがこのように機械言語に変換されます。このように、マシン言語は単純な文字や数値として転送されます。ここでは、X、Y、Zステージの各位置に対応しています。このように、該当するプログラムを含むファイルを選択し、プログラムをダウンロードして開きます。そして、同様にファイルからテキストファイルを選択します。テキストファイルのみをダウンロードし、そのファイルを選択すると、ラップトップからCom Motionコントローラーのエグゼクティブへ自動的にダウンロードされます。その後、前述の通りBAMキャラクターへと移行します。このフラスコにはNIH 3T3マウス線維芽細胞が入っています。まず、古い培地を吸引します。この工程は細胞を継代させるためのものであり、細胞はフラスコの底に接着しています。そのため、培地を吸引した後、酵素であるトリプシンを 6 µL 加えます。トリプシンをフラスコに注入した後、細胞がフラスコ底面から剥離するまで 3〜5 分間待ちます。それでは、培地を加え、細胞を遠心チューブへ継代します。希釈倍率は1対1です。ここに培地を6 mL加え、細胞を軽く洗い流して、すべての細胞が確実に回収されるようにします。これで、細胞をこのチューブで遠心分離する準備が整いました。次に、これらの細胞を1,000 RPMで3〜5分間遠心分離します。細胞がペレットとして沈殿したので、上清を吸引します。次に、PBSで細胞を洗浄します。これは細胞を染色するためです。使用する染料はエステラーゼ基質です。それでは、もう一度遠心分離を行い、細胞をペレット状に集めます。PBSを吸引した後、細胞をカウントするための培地に再懸濁します。サンプルを採取した際にチューブ全体で濃度が均一になるよう、細胞を混合しています。次に、細胞密度を測定するために、細胞液を100 µL採取します。そして、染色剤であるトリパンブルーを100 µL加えます。死細胞の細胞膜に染色剤を浸透させるため、3～5分間待機します。細胞をカウントする際、青く染まった細胞はカウントしません。ヘモサイトメーターでカウントする準備が整いましたので、細胞懸濁液を50 µLずつヘモサイトメーターの両側に転移します。それでは、カバーガラスで覆います。血球計数器には2つの側があります。まず一方をカウントし、両側をカウントした後に平均を出し、トリパンブルーで1対1の希釈を行ったため、それを2倍にします。したがって、細胞密度は135 × 10⁴ cells/mLとなります。本実験では、濃度が5 × 10⁵ cells/mLの細胞懸濁液を使用します。細胞総数が13.5 × 10⁶ cellsであるため、27 mLの培地で細胞を再懸濁します。2種類の異なる染色剤を使用します。これはMolecular Probes社の生死判定アッセイ（live dead assay）です。1つ目の染色剤はcalcium amと呼ばれています。2つ目の染色は、AUMホモ二量体と呼ばれます。これは死細胞を染色します。青色励起で緑色蛍光を、緑色励起で赤色蛍光を得ます。これら2つの染色において、イメージングを行う際の溶液はPBSで調製します。まず、5 mLのPBS（リン酸緩衝生理食塩水）をチューブに移します。これは生理食塩液です。次に、0.5 µLのcalcium am per milを添加します。次に、チューブに2.5 µLのcalcium amと、PBS 1 mLあたり2 µLのathe homodimerを添加します。こちらがbtexマシンです。これにより、細胞と培地が全量にわたって均一に分散されます。ここで、200 µLの細胞懸濁液をここにロードします。次に、キャップを被せます。このようにしっかりと密閉します。バルブを開くと、圧力がかかり空気が入り、そこでこのようにベルトを調整します。これにより圧力が変化します。そこで調整を行います。圧力は5 PSIです。チューブ内部の圧力は5 PSIです。ここからここまで、穴の中のこれを通じて接続されています。ここでベルを開き、5 PSIの圧力で細胞を注入して、開放を開始します。その後、ソレノイドバルブが作動し始めます。次に、基板を転がします。基板には単純なスライドガラスを使用します。そして適切な量を載せ、このように基板を固定するためにスケッチテープを貼ります。そして、単純にこれを固定します。このように、セル、aryバルブ、および基板のすべてをセットし、aryの動作を開始させます。すべてをセットアップした後、aryバルブを開いて開始します。次に、このようにステージを移動させますね？そして、基板上にパターンを形成し、文字を作成します。先に作成しておいたこの染料溶液の中に、プリントしたこれらの液滴を浸します。次に、液滴を10分間インキュベートし、その後にイメージングを行います。まず、接眼レンズを通して画像を調整します。最初の画像は、単純な明視野像です。照明を消してフィルターを切り替え、青色励起光を用いて緑色蛍光を観察します。そして3枚目の画像として、Thm Homodimer染色による死細胞を撮影します。こちらは緑色光を用いて赤色蛍光を観察します。

Research

JoVE Journal

Biology

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学ぶ3Dバイオプリンティングにおける細胞カプセル化技術。ソレノイドバルブを用いた精密な細胞射出と培地・ゲルによる細胞生存性の維持方法を解説。組織工学への応用可能性を探る。

滴タイトルセルのカプセル化

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