ハイスループットマイクロカプセル化シングルセルと複数セル

小さなピコリットルサイズの液滴に封入された細胞を利用するアプリケーションは、液滴あたりの細胞数を制御できないことでしばしば制限されてきました。このプロトコルは、流体動的細胞秩序化とフローフォーカシングマイクロノズルでの液滴生成という2つの異なるマイクロ流体現象を組み合わせることにより、細胞のカプセル化を制御する方法を示しています。上流のチャネルでは、懸濁したセルまたは粒子を含む十分に高い流量の水溶液が提供され、下流の流れ方向に等間隔の列車が形成されます。

フローフォーカシングドロップ生成ノズルは、界面活性剤安定化許容オイルキャリア流体中にキロヘルツ速度で水性ドロップを形成するために使用されます。次に、順序付けられた細胞粒子列は、水性および油の流量を調整することにより液滴生成と組み合わされ、縦方向に順序付けられた細胞または粒子が液滴生成ノズルに到着すると同期する液滴生成速度が得られ、粒子は細胞の代用として使用されます。このプロトコルを実証するには、流量が流体を制限するほど十分に小さくなければなりません。

生物学的細胞への大きなストレス、細胞秩序の重複、ドロップ生成、細胞生存率。水性流量制約は、単一および複数のセルの制御されたカプセル化に理想的な運用体制を提供します。ビデオ顕微鏡データの解析では、シングルセルとダブルセルまたは粒子のカプセル化効率は、ランダムカプセル化効率を上回り、必要な数の細胞または粒子を含まない液滴の数を大幅に減らすことが示されています。

細胞と滴の閉じ込めは、細胞分泌物の希釈を制限し、細胞の不均一性を強調し、バルク懸濁液と比較して細胞間シグナルも制御します。これらの細胞を液滴にカプセル化するための効率的な手段は、生物学研究者がこの手順を開始するための貴重なツールを提供します。この図に示すように、AutoCAD ソフトウェアでマイクロチャネル パターンを設計します。

長チャネルセクションは、幅27ミクロンの水性流れ秩序チャネルを表します。拡大されたノズルの概略図は、水性秩序チャネルとオイルチャネルのチャネル幅が等しい27ミクロンを示し、続いてノズルが22ミクロンの収縮とより広い61ミクロンチャネルへの突然の拡張を示しています。デバイスの高さは52ミクロンです。

水性入口とオイル入口の両方に、このオイル入口の拡大図に示されているように、順序チャネル幅のオーダーにギャップがある大きなデブリフィルターがあります。表示。これは、染料を注入したオーダーチャネルとノズルの真のイメージです。サードパーティのメーカーを使用して、暗い背景でチャネルが透明なマイラーフィルムまたはクォーツに高解像度の透明マスクを印刷します。

その後、レプリカ成形用のシリコンとSU 8フォトレジストマスターを作成します。マスターモールドをペトリ皿の底にテープで貼り付けて、PDMSレプリカ成形します。レプリカ成形が完了し、デバイスの輪郭が切り取られたら、外径0.75ミリメートルの生検パンチを使用して、この図に示す3つの丸い領域に流体ポートをパンチし、親愛なるスコッチテープをPDMSのパターン側に打ち抜き、プラズマボンディング後に剥がしてほこりを取り除きます。

PDMSをきれいなガラス顕微鏡スライドに。デバイス全体をオーブンに入れ、オーブンを摂氏120度まで徐々に温めます。デバイスを摂氏120度のオーブンに一晩置いて、接着を完了し、PDMSを元の疎水性状態に戻します。

チャネルのガラス表面を疎水性にする別の方法は、アクアエなどのコーティングを流体ポートに注入し、次に空気でパージすることです。1ミリリットルのシリンジとシリンジの針を使用して、数百マイクロリットルの空気を吸い込み、続いて金属製のシリンジチップだけを満たすのに十分な量のアクイルを慎重に、しかししっかりとアクアを注入し、その後にパージする空気を流体ポートに注入します。PDMSをガラスに積極的に接着することなく

乾燥時にチャネルを詰まらせる可能性のある堆積物を避けるために、余分なアクアを拭き取りながら、すべての入口ポートと見通しポートでエアパージを繰り返します。細胞濃度の制御は、適切な細胞数を適切な滴数にするために不可欠です。これには、2つの難しい要素があります。

1つ目は、事前に適切な濃度を推定すること、2つ目は、実験中にその濃度を維持することです。この研究で使用した特定のデバイスでは、8〜15ミクロンの細胞または粒子が制御されたカプセル化のために適切に順序付けられる必要があります。このデモンストレーションでは、9.9ミクロンのポリスダイアリーマイクロスフェアを細胞の代理として使用して、理想的な監査カプセル化を達成するための水性粒子懸濁液濃度を準備します。まず、以前のデータを使用して重量で1%固形分のマイクロスフェアストック濃度をフルオーダーします。目安として、ストックサンプルの1ミリリットルを穏やかに遠心分離し、250マイクロリットルのスーピン酸液体を除去し、Resusがボルテックス混合またはより穏やかな混合によって粒子を懸濁させることにより、濃度を1.5%固形分に増

セルを使用する場合、セルとポリスチレン粒子の両方の比重は1より大きいですが、このビデオには示されていません。数分から数時間のオーダーで長時間続く実験の場合、溶液は、粒子用の塩化カルシウムなどの溶質を添加したり、細胞用のオプティプレップを添加したりすることで浮力が一致している場合があります。細胞または粒子懸濁液の準備ができたら、15ミリリットルの遠心分離管ボルテックスで連続フルオロカーボン油相の10ミリリットルのサンプルを調製します。

界面活性剤とフッ素油を約2.5%の重量で混合します。ここでは、2.4重量の重量混合物が得られ、これはマイクロカプセル化実験の設定に許容されます。まず、倒立光学顕微鏡とハイスピードカメラの電源を入れます。

マイクロチャネル層に焦点を合わせ、チャネルに詰まりや外れる可能性のある破片がないか調べます。大きな破片や明らかな詰まりのないチャネルを選択します。水性インレットオイルインレットとエマルジョンアウトレットの3つの長さの半透明タイゴンPVCチューブをカットして、デッドボリュームを最小限に抑えます。

シリンジポンプから顕微鏡まで届くように、チューブをちょうどカットします。ステージカットチューブの端を45度の角度で 流体ポートへの挿入を容易にするために、ピンセットを使用してチューブの端を流体ポートに圧入します。次に、30ゲージの鈍い先端のステンレス鋼シリンジ針を水性インレットチューブの自由端に圧入します。

オイルインレットチューブについても繰り返します。デバイスを動かし、20倍の対物レンズ位置合わせを使用してチューブを顕微鏡ステージに取り付け、デバイスのノズルに焦点を合わせます。顕微鏡をKohler照明用に手動で調整して、焦点面で最適な照明を提供します。

ハイスピードカメラソフトウェアクロップを使用して、ノズルの周りの視野を広げてより高いフレームレートを可能にし、必要に応じてフレームレート、露出時間、およびその他のカメラ設定を設定して、最適な録画を実現します。次に、1ミリリットルのシリンジに、前に調製したよく混合した相水溶液を入れます。3ミリリットルのシリンジに油相溶液を入れます。

充填されたシリンジの1つを垂直に傾け、フリックして気泡をシリンジ出口に移動します。プランジャーをゆっくりと押し下げて、シリンジを垂直に固定しているシリンジの先端に空気を押し込みます。シリンジを、デバイスにすでに取り付けられているそれぞれのシリンジ針に接続します。

プランジャーを押し下げて、液体がチューブをほぼデバイスまで押し出されるまで、シリンジ針のデッドボリュームに空気を強制的に送り込み、シリンジをシリンジポンプにしっかりと取り付け、プランジャーブロックにかみ合わせます。2番目のシリンジで接続を繰り返し、各シリンジポンプの電源を2番目のシリンジポンプに取り付け、各ポンプをプログラムします。メーカーのプロトコルを使用して、初期流量を油相で毎分50マイクロリットル、毎分5マイクロリットルに設定します。

水相の開始では、ポンプは各流体がデバイスに入るのを待ち、残りのデッドエアを押し出すチャネルを満たします。初期流量を使用すると、これには数分かかる場合があります。ノズルでの液滴の形成を観察します。

水溶液の流量をゆっくりと増やして、長い水溶液チャネル内の粒子の順序を観察します。流量が増加すると、この例に示すように、ノズルで水系流体の流れの噴射がトリガーされる点まで流量が増加しないように、別の液滴発生ノズルノートを使用すると、非定常流れと一貫性のない液滴がここにあります。粒子濃度が低すぎて、欠落している粒子が比較的少ない交互列を提供できず、サンプルの浮力が一致しなかった場合は、シリンジポンプをシリンジ出口に向かって物理的に傾け、粒子がシリンジ出口に向かって徐々に沈降するようにします。

適切な注文が発生したら、オイルの流量を調整して、液滴の発生頻度とサイズを調整します。両方の流量を繰り返し調整して、目的の封止速度と液滴量を達成します。安定した注文封入が確認されたら、出口チューブを廃棄物リザーバーから収集リザーバーに移動して、将来使用します。

単一および二重粒子または細胞のカプセル化を高効率で実現できます。ここに示すこのプロトコルを利用することは、毎分60マイクロリットルの油流量および毎分9マイクロリットルの水性流量を有する単一粒子カプセル化の代表的な結果である。ラムダの場合、ドロップの平均粒子数は 0.95 です。

流れの方向の粒子間隔は、完全に秩序化された交互粒子に対して約17〜18ミクロンです。この例のドロップ生成レートは 6.1 キロヘルツで、平均ドロップ サイズは 24.4 ピコリットルです。ヒストグラムは、単一粒子カプセル化の次数とプラスのドロップカプセル化粒子効率を比較します。

統計では、517滴のサンプルサイズに対するランダムカプセル化は、1つの粒子を含む滴の平均割合は79.5%であり、予測されたランダムカプセル化率36.7%とは対照的に、正しくカプセル化された液滴に入る粒子の割合は、491粒子のサンプルサイズに対して83.7%であることが観察されました。 ランダムカプセル化率は37.3%でしたが、ダブル粒子カプセル化は、水溶液の流量を毎分9マイクロリットルに維持しながら、オイルの流量を毎分30マイクロリットルに減らすだけで達成されます。ここでラムダは、1滴あたりの平均粒子数は1.8です。単一粒子のカプセル化に似ています。

流れの方向の粒子間隔は、完全に秩序化された交互粒子に対して約17〜18ミクロンです。大きい方の液滴の平均液滴サイズは39.8ピコリットルで、ランダムカプセル化と比較して3.8キロヘルツの割合で形成されています。383滴のサンプルサイズの場合、2つの粒子を含む順序付けられたカプセル化液滴の平均画分は71.5%であり、予測されたランダムカプセル化画分が26.8%であるのとは対照的に、正しくカプセル化された液滴に傾いた粒子の割合は、689粒子のサンプルサイズに対して79.5%であることが観察されたが、ランダムカプセル化画分は33.4%であった。

これらの結果を総合すると、単一粒子と二重粒子のカプセル化効率は、ランダムカプセル化効率を2倍以上上回り、必要な数の細胞や粒子を含まない液滴の数を大幅に減らすことが示されています。高いカプセル化効率のためには、粒子または細胞の適切な濃度が重要であることが、この実験で明らかになりました。オイルと水性の流量は、前に示した 2 粒子カプセル化実行と同じですが、一滴ラムダあたりの平均セル数は 1.57 に減少します。

その結果、完全な順序付けは行われず、したがって列車に穴が現れ、予想よりも少ない粒子で太陽の滴が残ります。このヒストグラムは、ラムダの値が低いために 2 つの粒子カプセル化の効率が低下していることを示しています。サンプルサイズが 324 滴の場合、2 つの粒子を含む滴の平均画分は 55.9% で、単粒子の滴は二重粒子の滴とほぼ同じでした。

これは、ラムダが1滴当たりの細胞数が少ないか多いかが許容されるかどうかに応じて、選択されたラムダの正確な値で正しくカプセル化された粒子または細胞を最大化するために、ラムダが1滴当たりの所望の細胞数と等しいかそれに近い必要があることを示している。このデモンストレーションでは、浮力のミスマッチを利用して、実験中の濃度のリアルタイム制御を可能にします。ただし、長期間の実験では、細胞を水滴にカプセル化した後、より一貫した結果を得るために浮力を一致させることをお勧めします。

時間依存性実験は、遠心分離管内または顕微鏡下で液滴をマイクロ流体アレイに再注入することにより実行できます。