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我々は、この研究で利用さPFPE-PEG系界面活性剤の例については、レインダンスの技術に感謝し、我々はPDMSチャネルのレプリカを作成するために使用されるシリコンウェハモールド用バイオMEMSリソースセンター（メフメットトナー、ディレクター）に感謝。

<ol><li>Zagnoni, M., Lain, G. L. e, Cooper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrocoalescence+mechanisms+of+microdroplets+using+localized+electric+fields+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Electrocoalescence mechanisms of microdroplets using localized electric fields in microfluidic channels.</a> Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 26, 14443-14449 (2010).</li>
<li>Niu, X. Z., Gielen, F., Edel, J. B., deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microdroplet+dilutor+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">A microdroplet dilutor for high-throughput screening.</a> Nat. Chem. 3, 437-442 (2011).</li>
<li>Vincent, M. E., Liu, W., Haney, E. B., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+stochastic+confinement+enhances+analysis+of+rare+cells+by+isolating+cells+and+creating+high+density+environments+for+control+of+diffusible+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+reviews%22%5BJournal%5D)">Microfluidic stochastic confinement enhances analysis of rare cells by isolating cells and creating high density environments for control of diffusible signals.</a> Chemical Society reviews. 39, 974-984 (2010).</li>
<li>Huebner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+detection+of+protein+expression+in+single+cells+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+communications%22%5BJournal%5D)">Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics.</a> Chemical communications. , 1218-1220 (2007).</li>
<li>Love, J. C., Ronan, J. L., Grotenbreg, G. M., van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microengraving+method+for+rapid+selection+of+single+cells+producing+antigen-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies.</a> Nature biotechnology. 24, 703-707 (2006).</li>
<li>Bradshaw, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+detection+of+secreted+products+from+human+lymphocytes+by+microengraving%3A+Cytokines+and+antigen-reactive+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: Cytokines and antigen-reactive antibodies.</a> Clin. Immunol. 129, 10-18 (2008).</li>
<li>Liu, W. S., Kim, H. J., Lucchetta, E. M., Du, W. B., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+incubation%2C+and+parallel+functional+testing+and+identification+by+FISH+of+rare+microbial+single-copy+cells+from+multi-species+mixtures+using+the+combination+of+chemistrode+and+stochastic+confinement%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Isolation, incubation, and parallel functional testing and identification by FISH of rare microbial single-copy cells from multi-species mixtures using the combination of chemistrode and stochastic confinement.</a> Lab on a chip. 9, 2153-2162 (2009).</li>
<li>Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+bacteria+and+determining+their+susceptibility+to+antibiotics+by+stochastic+confinement+in+nanoliter+droplets+using+plug-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics.</a> Lab on a chip. 8, 1265-1272 (2008).</li>
<li>Koster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drop-based+microfluidic+devices+for+encapsulation+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells.</a> Lab on a chip. 8, 1110-1115 (2008).</li>
<li>Kelly, R. T., Page, J. S., Marginean, I., Tang, K., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dilution-free+analysis+from+picoliter+droplets+by+nano-electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 48, 6832-6835 (2009).</li>
<li>Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-electrospraying+and+droplet-based+microfluidics%3A+control+of+cell+numbers+within+living+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+materials%22%5BJournal%5D)">Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues.</a> Biomedical materials. 5, 21001(2010).</li>
<li>Edd, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+encapsulation+of+single-cells+into+monodisperse+picolitre+drops%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Controlled encapsulation of single-cells into monodisperse picolitre drops.</a> Lab on a chip. 8, 1262-1264 (2008).</li>
<li>Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+dispersions+using+%22flow+focusing%22+in+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels.</a> Applied Physics Letters. 82, 364(2003).</li>
<li>Utada, A., Fernandez-Nieves, A., Stone, H., Weitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dripping+to+Jetting+Transitions+in+Coflowing+Liquid+Streams%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Dripping to Jetting Transitions in Coflowing Liquid Streams.</a> Physical Review Letters. 99, (2007).</li>
<li>Chabert, M., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+high-throughput+encapsulation+and+hydrodynamic+self-sorting+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3191-3196 (2008).</li>
<li>Segrí, G., Silberberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+Particle+Displacements+in+Poiseuille+Flow+of+Suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Radial Particle Displacements in Poiseuille Flow of Suspensions.</a> Nature. 189, 209-210 (1961).</li>
<li>Carlo, D. D. i <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Inertial microfluidics.</a> Lab on a chip. 9, 3038-3046 (2009).</li>
<li>Carlo, D. D. i, Edd, J., Humphry, K., Stone, H., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+Segregation+and+Dynamics+in+Confined+Flows%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Particle Segregation and Dynamics in Confined Flows.</a> Physical Review Letters. 102, (2009).</li>
<li>Humphry, K. J., Kulkarni, P. M., Weitz, D. A., Morris, J. F., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+and+lateral+particle+ordering+in+finite+Reynolds+number+channel+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+of+Fluids%22%5BJournal%5D)">Axial and lateral particle ordering in finite Reynolds number channel flows.</a> Physics of Fluids. 22, 081703(2010).</li>
<li>Lee, W., Amini, H., Stone, H. A., Carlo, D. D. i <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+self-assembly+and+control+of+microfluidic+particle+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamic self-assembly and control of microfluidic particle crystals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22413(2010).</li>
<li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+microfluidic+systems+in+poly%28dimethylsiloxane%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane.</a> Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).</li>
<li>Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+Device+Fabrication+and+Surface+Modification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">PDMS Device Fabrication and Surface Modification.</a> J. Vis. Exp. (8), e319(2007).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).</li>
<li>Hatch, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1-Million+droplet+array+with+wide-field+fluorescence+imaging+for+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR.</a> Lab on a chip. , 3838-3845 (2011).</li>
<li>Holtze, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+surfactants+for+water-in-fluorocarbon+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions.</a> Lab on a chip. 8, 1632-1639 (2008).</li>
<li>Garstecki, P., Stone, H., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+Flow-Rate+Controlled+Breakup+in+Confined+Geometries%3A+A+Route+to+Monodisperse+Emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Mechanism for Flow-Rate Controlled Breakup in Confined Geometries: A Route to Monodisperse Emulsions.</a> Physical Review Letters. 94, (2005).</li>
<li>Garstecki, P., Fuerstman, M. J., Stone, H. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+droplets+and+bubbles+in+a+microfluidic+T-junction-scaling+and+mechanism+of+break-up%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Formation of droplets and bubbles in a microfluidic T-junction-scaling and mechanism of break-up.</a> Lab on a chip. 6, 437-446 (2006).</li>
<li>Nie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulsification+in+a+microfluidic+flow-focusing+device%3A+effect+of+the+viscosities+of+the+liquids%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Emulsification in a microfluidic flow-focusing device: effect of the viscosities of the liquids.</a> Microfluidics and Nanofluidics. , (2008).</li>
<li>Holt, D. J., Payne, R. J., Chow, W. Y., Abell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorosurfactants+for+microdroplets%3A+interfacial+tension+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+colloid+and+interface+science%22%5BJournal%5D)">Fluorosurfactants for microdroplets: interfacial tension analysis.</a> Journal of colloid and interface science. 350, 205-211 (2010).</li>
<li>Holt, D. J., Payne, R. J., Abell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+novel+fluorous+surfactants+for+microdroplet+stabilisation+in+fluorous+oil+streams%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fluorine+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of novel fluorous surfactants for microdroplet stabilisation in fluorous oil streams.</a> Journal of Fluorine Chemistry. 131, 398-407 (2010).</li>
<li>Hatch, A. C., Fisher, J. S., Pentoney, S. L., Yang, D. L., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+3D+droplet+self-assembly+for+ultra-high-density+digital+micro-reactor+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Tunable 3D droplet self-assembly for ultra-high-density digital micro-reactor arrays.</a> Lab on a chip. 11, 2509-2517 (2011).</li>
<li>Baret, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactants+in+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a chip. 12, 422-433 (2012).</li>
</ol>

JEは、この原稿で利用技術に基づく特許出願中の発明です。

発注の比較的高い程度にもかかわらず、すべてのドロップは、粒子または細胞の適切な数が含まれています。カプセル化効率は、その総数で割った望ましい占有と滴にカプセル化されたようになる細胞または粒子の数として計算することができる。これらの生データを収集し、エマルジョンのサンプル自動化された高速ビデオ·アルゴリズムから、またはイメージングのいずれかから取得することができます。これは、P kは k個の粒子とk個の粒子を含んでいるでしょうが値下がりしましたD kの画分を含むドロップダウンにカプセル化された粒子の割合と比較することができます。 図3から、両方のシングルとダブルの粒子のカプセル化効率は2倍以上で、ランダムなカプセル化の効率を上回る大幅粒子の所望の数より多いと液滴の数を減らす図4は、高効率のための適切な濃度の必要性を示しています。つまり、＆lambd<html> 、、粒子濃度とドロップボリュームの両方の機能は、正しくカプセル化粒子または細胞を最大限にするには、ドロップ当たり所望...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> AutoCADの</td><td>オートデスク</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透明マスク</td><td>のFineLineイメージング株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td> SU-8フォトレジスト</td><td>マイクロケム</td><td> 2050 </td><td></td></tr><tr><td> Dektakプロフィル</td><td> Veeco社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td> BDファルコン</td><td> 351058 </td><td></td></tr><tr><td> PDMSシリコーンエラストマーキット</td><td>ダウコーニング（株） </td><td> Sylgard 184、材質番号（240）4019862 </td><td></td></tr><tr><td>減圧デシケーター</td><td> Jencons </td><td> 250から030 </td><td></td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>アルカテル·バキューム·テクノロジー</td><td> 2010 C2 </td><td></td></tr><tr><td>真空レギュレータ</td><td>コー​​ル·パーマー</td><td> EW-00910から10 </td><td></td></tr><tr><td>オーブン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>リンドバーグブルーM、OV800F </td><td></td></tr><tr><td>生検パンチ、0.75ミリメートル</td><td>ハリス</td><td>ユニコア15072 </td><td></td></tr><tr><td>実験室コロナ処理機</td><td>エレクトロ·テクニック·プロダクツ株式会社</td><td> BD-20AC、SKU 12051A </td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>ゴールドシール</td><td> 3010 </td><td></td></tr><tr><td> Aquapel </td><td> PPGインダストリーズ</td><td></td><td>代替戦略</td></tr><tr><td>ポリスチレンマイクロスフェア、9.9μmの</td><td>サーモ</td><td> G1000 </td><td></td></tr> &lt;TR&gt; <td> OptiPrep </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> D1556 </td><td>示されていません</td></tr><tr><td>ルアーロックシリンジ</td><td> BD </td><td> 1 ML：309628 3 ML：309585 </td><td></td></tr><tr><td> FC-40フッ素オイル</td><td> 3M社</td><td>シグマアルドリッチ、F9755 </td><td></td></tr><tr><td> PFPE-PEGのフッ素系界面活性剤</td><td>レインダンステクノロジーズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>軽油</td><td> PTIプロセスケミカル</td><td> 08042-47-5 </td><td>代替戦略</td></tr><tr><td>ミネラルオイルの界面活性剤</td><td>エボニックゴールドシュミット社</td><td> ABIL EM 90 </td><td>代替戦略</td></tr><tr><td>タイゴンPVCチューブ</td><td> SmallParts </td><td> TGY-010 </td><td></td></tr><tr><td> 30ゲージルアーロックシリンジニードル、1/2 &quot; </td><td> SmallParts </td><td> NE-301PL-C </td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>カールツァイスイメージング</td><td>アクシオObserver.Z1 </td><td></td></tr><tr><td>ハイスピー​​ドカメラ</td><td>ビジョン研究</td><td>ファントムV310 </td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ（2） </td><td> Chemyx株式会社</td><td>ネクサス3000 </td><td></td></tr><tr><td>シリコーンオイル</td><td>ダウコーニング</td><td> 200流体、10 cStの</td><td>エマルジョンストレージ用のオプション</td></tr></tbody></table>

ハイスループットマイクロカプセル化シングルセルと複数セル

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

マイクロ流体カプセル化法は、ピコリットスケールの単分散水相液滴内に細胞を捕捉するためにこれまで利用されており、バルク流体環境からの隔離を実現することで、ハイスループットスクリーニング、サイトメトリー、および質量分析への応用を可能にしています。本稿では、単一細胞をカプセル化するだけでなく、一定数の細胞（ここでは1細胞および2細胞のカプセル化を実証）を繰り返し捕捉し、単離状態および制御された集団サイズにおける細胞間相互作用の両方を研究する方法について記述します。液滴生成技術と細胞および粒子の配列化を組み合わせることで、効率的かつ連続的なカプセル化に向けた、細胞サイズの粒子の制御されたカプセル化を実証します。水相粒子懸濁液と不混和なフルオロカーボンオイルを用い、フローフォーカシングノズルによってオイル中に水相液滴を生成します。水相の流速を十分に高くすることで、液滴生成頻度の整数倍の周波数でノズルに到達する粒子の配列化を形成し、各液滴に制御された数の細胞をカプセル化します。代表的な結果として、細胞の代替として9.9 μmのポリスチレン粒子を使用します。本研究では、単一粒子カプセル化効率Pk=1が83.7%、二粒子カプセル化効率Pk=2が79.5%であり、それぞれのポアソン効率である39.3%および33.3%と比較して向上したことを示します。効率的なカプセル化には、一定の細胞および粒子濃度を維持することが極めて重要であることが実証され、また、ドリッピングからジェッティングへの遷移についても取り上げています。
はじめに
連続的な培地中の細胞懸濁液は共通の流体環境を共有しており、これにより細胞が並行して相互作用することが可能となり、また培地からの測定における特定の細胞の影響を均質化することができます。ピコリットルスケールの液滴への細胞の高スループット封入は、サンプルを閉じ込めることで液滴のクロスコンタミネーションを防ぎ、サンプル内の細胞多様性の測定を可能にし、試薬や発現バイオマーカーの希釈を防止し、バイオリエクター産物からの信号を増幅させます。また、液滴を用いることで、液滴をより大きな水性サンプルに再統合させたり、他の液滴と統合させたりすることができ、細胞間シグナリングの研究に活用できます1,2。希釈の低減は、より精度の高い測定のためのより強い検出信号を意味すると同時に、コストがかかる可能性のあるサンプル量や試薬量を削減できる能力をもたらします3。液滴への細胞封入は、高スループットスクリーニングにおけるタンパク質発現4、抗体5,6、酵素7、および代謝活性8の検出向上に利用されており、高スループットサイトメトリーの向上にも利用できる可能性があります9。さらに、質量分析のための細胞含有液滴のバイオエレクトロスプレー10や、標的表面への細胞コーティング11への応用に関する研究も報告されています。しかし、いくつかのアプリケーションでは、液滴に封入される細胞数を制御する能力が不足していることが制限となってきました。ここでは、1個および2個の細胞に対する封入効率を向上させ、より多くの細胞の封入へと展開可能な、秩序ある封入法12を提示します。
単分散の液滴生成を実現するために、マイクロ流体「フローフォーカシング」を用いれば、流路が収束するノズルを使用して、別の流体（連続油相）の中に、制御可能なサイズの液滴（水系細胞混合液）を生成することが可能です。13 特定のノズル形状において、液滴の生成周波数 f および液滴サイズは、油相と水相の流量 Qoil および Qaq を調整することで変更できます。流量が増加すると、液滴生成から、ノズルからの水系流体の不安定なジェッティングへと移行する場合があります。14
水溶液に懸濁粒子が含まれている場合、粒子はノズルにおいてカプセル化され、互いに隔離されます。ランダムに分布した水性細胞懸濁液を用いて液滴を生成する場合、k個の細胞を含む液滴 Dk の平均割合はポアソン統計に従い、Dk = λk exp(-λ)/(k!) と表されます（ここで λ は液滴1個あたりの平均細胞数です）。「正しく」カプセル化された液滴に含まれる細胞の割合は、Pk = (k x Dk)/Σ(k' x Dk') を用いて算出されます。これら2つの指標のわずかな違いは、Dk が水相液の利用効率およびカプセル化後に必要となる液滴分別の量に関連するのに対し、Pk は細胞サンプルの利用効率に関連している点です。例として、希釈した細胞懸濁液（低い λ）を用いて、細胞を含む液滴のほとんどが単一細胞のみを含むようにカプセル化することが考えられます。この場合、効率指標である Pk は高くなりますが、大部分の液滴は空（低い Dk）となり、空の液滴を除去するための分別のメカニズムが必要となり、スループットも低下します。15
液滴生成と慣性整列を組み合わせることで、ランダムなカプセル化よりも予測可能な液滴あたりの細胞数で、かつより高いスループットでの液滴カプセル化が可能になります。慣性フォーカシングはSegreとSilberbergによって初めて発見され16、有限サイズの粒子がチャネル流中の側方平衡位置に移動する傾向を指します。慣性整列とは、粒子や細胞が受動的に、等間隔で千鳥状の一定速度の列に組織化される傾向を指します。フォーカシングと整列の両方には、十分に高い流速（高いレイノルズ数）と粒子サイズ（高い粒子レイノルズ数）が必要です。17,18 ここで、レイノルズ数は Re =uDh/ν、粒子レイノルズ数は Rep =Re(a/Dh)2であり、uは特性流速、Dh [=2wh/(w+h)]は水力直径、νは動粘度、aは粒子径、wはチャネル幅、hはチャネル高さを表します。経験的に、完全に整列した列を形成するために必要な長さは、ReおよびRepが増加するにつれて減少します。なお、高いReおよびRepの要件（本研究ではそれぞれ5および0.5のオーダー）は、液滴生成ノズルでのジェッティングを避けるために水相の流速を低く保つ必要があることと相反する可能性があります。さらに、高流速は細胞へのせん断応力の増大を招きますが、本プロトコルではこれについて言及しません。先行する整列カプセル化の研究では、本研究と同様の流動条件下において、単一カプセル化されたHL60細胞の90%以上が細胞膜の完全性を維持したことが示されています。12 しかし、異なる細胞種や流動パラメータに外挿する場合は、せん断応力の大きさと時間スケールの影響を慎重に検討する必要があります。細胞の整列、液滴生成、および細胞生存率に関する水相流速の制約が重なる領域が、単一および複数細胞の制御されたカプセル化にとって理想的な動作条件となります。
粒子列間の間隔に関する研究は非常に少ないため、19,20間隔の決定は経験的に行うのが最も容易であり、チャンネルの形状、流量、粒子径、および粒子濃度に依存します。それにもかかわらず、粒子列間の側方間隔が等しいことは、細胞が予測可能で一定の時間間隔で到達することを意味します。整列した細胞がノズルに到達する速度と同じ速度で液滴生成が行われると、細胞は制御された方法で液滴内にカプセル化されます。この技術は、15 kHzオーダーのスループットで単一細胞をカプセル化するために利用されており、12これは60-160 Hzオーダーのカプセル化速度を報告していた previous studies4,15から大幅に向上しています。この制御されたカプセル化の検討において、80%以上の液滴にただ一つの細胞のみが含まれており、これは平均効率が40%未満と予測されるポアソン（ランダム）統計に比べて、効率が大幅に改善されています。12
以前の制御カプセル化の研究では、12単一細胞のカプセル化を実現するために、液滴あたりの平均粒子数 λ を調整しました。私たちは、流速を調整することで、λ が液滴あたりに希望する細胞数と同等またはそれに近い場合に、任意の数の細胞を効率的にカプセル化できると仮定しています。単一細胞のカプセル化は、刺激に対する個々の細胞の応答を決定する上で有用ですが、多細胞のカプセル化は、制御された数と種類の細胞の相互作用に関する情報を提供します。ここでは、受動的な慣性整列チャネルと液滴生成ノズルを用いて多細胞を制御的にカプセル化するためのプロトコル、ポリスチレン微小球を用いた代表的な結果、および考察を提示します。

細胞と粒子の慣性順序を持つ単分散ドロップ生成を組み合わせることで、我々は、kHzのレートで一滴の細胞または粒子の所望の数をカプセル化する方法を説明します。我々は、二回のシングルとダブルの粒子降下を順不同カプセルのものを超えて効率を示しています。

マイクロ流体カプセル化法は、細胞をピコリットルスケールの水相単分散液滴内に捕捉するためにこれまで利用されており、これにより閉じ込め...

ピコリットルサイズの微小液滴に細胞を封入するアプリケーションでは、液滴あたりの細胞数を制御できないことがしばしば制限となってきました。本プロトコルでは、流体力学的な細胞の整列と、フローフォーカシング・マイクロノズルでの液滴生成という2つの異なるマイクロ流体現象を組み合わせることで、細胞封入を制御する方法を実証します。上流チャネルにおいて、細胞または粒子を懸濁させた水溶液を十分に高い流速で供給することにより、下流方向に向かって等間隔に並んだ列（トレイン）を形成させます。フローフォーカシング液滴生成ノズルを用いて、界面活性剤で安定化された許容油キャリア流体中に、kHz単位の速度で水相液滴を形成します。次に、水相と油相の流速を調整して液滴生成を制御し、縦方向に整列した細胞または粒子が液滴生成ノズルに到達するタイミングと同期させた液滴生成速度を実現することで、整列した細胞粒子の列と液滴生成を組み合わせます。なお、ここでは粒子を細胞の代用として使用します。このプロトコルを実証するためには、流速を十分に低く設定し、流体を制限する必要があります。生物学的細胞へのせん断応力、細胞配列の重複、液滴生成、および細胞生存能について検討します。水相の流れ速度の制約により、単一および複数の細胞を制御してカプセル化するための理想的な動作領域が提供されます。ビデオ顕微鏡データの解析により、単一および二重の細胞または粒子のカプセル化効率は、ランダムなカプセル化効率を上回り、目的の数の細胞または粒子を含まない液滴の数を大幅に減少させることが示されました。細胞や液滴を閉じ込めることで、細胞分泌物の希釈を抑制し、細胞の不均一性を明確にするとともに、バルク懸濁液と比較して細胞間シグナルを制御することが可能になります。これらの細胞を液滴内に効率的に封入する手法は、生物学研究者にとって有用なツールとなります。本手順を開始するために、AutoCADソフトウェアを用いて、この図に示すようなマイクロチャネルパターンを設計してください。長いチャンネル部分は、幅 27 µm の水相フロー整列チャンネルを表しています。拡大したノズルの概略図では、水相整列チャンネルとオイルチャンネルの幅がともに 27 µm であり、それに続いて 22 µm のノズル収縮部があり、その後 61 µm のより広いチャンネルへと急拡大しています。デバイスの高さは 52 µm です。水相および油相の両方の入口には、この油相入口の拡大模式図に示されているように、 ordering channel の幅と同程度のギャップを持つ大きなデブリフィルターが備わっています。ここでは、色素を注入した ordering channel とノズルの実像を示します。チャネル部分が暗い背景の中で透明になるように、マイラーフィルムまたは石英に高解像度の透過マスクを印刷し、外部メーカーに委託してください。続いて、レプリカ成形用のシリコンおよびSU-8フォトレジストマスターを作成します。PDMSレプリカ成形のため、マスターモールドをペトリ皿の底にテープで固定します。レプリカ成形が完了し、デバイスの外形を切り出した後、外径0.75 millimeterのバイオプシーパンチを使用して、図に示す3つの円形領域に流体ポートを開けます。プラズマ接合後、PDMSのパターン側にスコッチテープを貼り、剥がしてほこりを除去します。PDMSを洗浄済みのガラス顕微鏡スライドに貼り付けます。デバイス全体をオーブンに入れ、徐々に120 °Cまで加熱します。ボンディングを完了させ、PDMSを元の疎水状態に戻すため、デバイスを120 °Cのオーブン内に一晩放置します。チャネルのガラス表面を疎水化するための代替法として、Aquapelなどのコーティング剤を流体ポートに注入し、その後空気でパージする方法があります。1 mLシリンジとシリンジ針を用い、数百 µLの空気を吸引し、続いて金属製のシリンジチップを満たす程度の少量のAquapelを吸引します。慎重に、かつ確実にAquapelを注入し、続けてパージ用の空気を流体ポートに注入してください。この際、PDMSとガラスの接合部を激しく破壊しないように注意してください。乾燥時にチャネルを詰まらせる可能性のある沈殿物を避けるため、余分な水を拭き取りながら、すべての流入ポートおよび流出ポートでエアパージを繰り返します。適切なドロップ数に対して適切な細胞数を確保するためには、細胞濃度の制御が不可欠です。これには、困難な2つの要素があります。1つ目は事前に適正な濃度を推定することであり、2つ目は実験中にその濃度を維持することです。本研究で使用した特定の装置では、制御された封入を行うために、細胞または粒子は8～15 µmである必要があります。このデモンストレーションでは、細胞の代用として9.9 µmのポリ（スチレン）ダイアリ・マイクロクロスフィアを使用します。理想的な単一封入を実現するための水性粒子懸濁液濃度を調製するには、完全な封入に関する過去のデータに基づき、マイクロクロスフィアのストック濃度を重量比1%固形分として開始します。目安として、ストックサンプル1 mLを緩やかに遠心分離し、上清液250 µLを除去した後、ボルテックスミキサーまたはより緩やかな混合で粒子を再懸濁させることで、濃度を1.5%固形分まで上昇させます。このビデオでは示していませんが、細胞を使用する場合、細胞とポリスチレン粒子の両方の比重は1より大きくなります。数分から数時間というオーダーの長期的な実験を行う場合は、粒子には塩化カルシウム、細胞にはOptiPrepなどの溶質を添加して、溶液の浮力を調整してください。細胞または粒子の懸濁液が準備できたら、15 mL centrifuge tubeに10 mLの連続相フルオロカーボンオイル試料を用意し、ボルテックスしてください。界面活性剤とフルオロカーボンオイルを、重量比で約2.5%になるように混合します。ここでは重量比2.4%の混合物を得ましたが、マイクロカプセル化実験のセットアップにおいて許容範囲内です。まず、倒立光学顕微鏡と高速カメラの電源を入れます。マイクロチャネル層に焦点を合わせ、チャネル内に詰まりや、剥離して流出する可能性のある不純物がないか確認します。大きな不純物や明らかな詰まりのないチャネルを選択してください。死容量を最小限に抑えるため、水相入口、油相入口、およびエマルジョン出口用に、半透明のTigon PVCチューブを3本、適切な長さに切断します。シリンジポンプから顕微鏡まで届く長さのチューブを切断します。流体ポートへの挿入を容易にするため、チューブの端を45度の角度にカットしてください。ピンセットを使用して、チューブ端を流体ポートに押し込みます。次に、水性液導入チューブの自由端に、30ゲージの鈍針ステンレス製シリンジ針を押し込んで固定します。オイル入口チューブについても同様に繰り返します。装置を移動させ、チューブを顕微鏡ステージに取り付け、20倍の対物レンズを使用してデバイスのノズルに合わせて調整し、フォーカスを合わせます。顕微鏡を手動で調整してケーラー照明を行い、焦点面で最適な照明が得られるようにします。高速カメラのソフトウェアを使用して、フレームレートを高く設定できるようノズルの周囲の視野をクロップし、その後、最適な記録に必要なフレームレート、露光時間、およびその他のカメラ設定を行います。次に、あらかじめ調製し十分に混合した水相溶液を1 mLのシリンジに充填します。また、油相溶液を3 mLのシリンジに充填します。充填したシリンジの1本を垂直に傾け、軽く叩いて気泡をシリンジの出口へ移動させます。シリンジを垂直に保持したまま、プランジャーをゆっくりと押し下げ、空気がシリンジの先端に押し出されるまで操作します。その後、シリンジをデバイスに装着済みの対応するシリンジ針に接続します。プランジャーを押し下げ、シリンジ針のデッドボリューム分だけ空気を押し出し、液体がチューブを通ってデバイスの直前まで到達するようにします。シリンジをシリンジポンプにしっかりと固定し、プランジャーブロックを掛けます。2本目のシリンジについても同様に接続し、2台目のシリンジポンプに固定します。各シリンジポンプの電源を入れ、設定を行います。製造元のプロトコルに従い、初期流量を油相で50 µL/min、水相で5 µL/minに設定します。水相の開始にあたり、ポンプは各液体がデバイスに導入され、チャネル内を満たして残りの気泡を押し出すまで待機します。初期流速を使用する場合、これには数分かかることがあります。ノズルでの液滴の形成を確認してください。水相の流速をゆっくりと上げ、長い水溶液チャネル内での粒子の整列を観察します。流速を上げる際は、この例（異なる液滴生成ノズルを使用）に示されているように、ノズルで水相流のジェット現象が誘発される点まで流速を上げないでください。不安定な流れと不均一な液滴が発生している点に注意してください。粒子濃度が低すぎて、欠損粒子が比較的少ない交互の列が得られない場合で、かつサンプルの浮力が調整されていない場合は、シリンジポンプをシリンジ出口方向に物理的に傾け、粒子がシリンジ出口に向かって徐々に沈降するようにしてください。適切な整列が確認されたら、オイル流速を調整して、液滴の生成頻度とサイズを微調整します。目的のカプセル化率と液滴容量を達成するために、両方の流速を繰り返し調整してください。安定した整列カプセル化が確認されたら、流出チューブを廃棄リザーバーから回収リザーバーへ移動させ、後の使用に備えます。単一粒子または細胞、および二重粒子の封入を高効率で実現できます。本プロトコルを用いた代表的な結果として、オイル流速 60 µL/min、水相流速 9 µL/min での単一粒子封入を示します。液滴あたりの平均粒子数である Lambda は 0.95 です。完全に規則的に交互に配列した粒子の流路方向の間隔は約 17 〜 18 µm です。この例における液滴生成速度は 6.1 kHz であり、平均液滴サイズは 24.4 pL です。このヒストグラムは、単一粒子のカプセル化とそれ以上の粒子をカプセル化した場合の液滴への粒子封入効率を比較したものです。統計的に、サンプルサイズ517液滴におけるランダム封入では、1つの粒子を含む液滴の平均分率は79.5%であり、予測されるランダム封入分率の36.7%とは対照的な結果となりました。サンプルサイズ491粒子のとき、正しく封入された液滴に含まれる粒子の分率は83.7%であったのに対し、ランダム封入分率は37.3%でした。水相の流量を9 µL/minに維持したまま、油相の流量を30 µL/minに下げるだけで、2粒子封入が達成されます。ここでのlambda（液滴あたりの平均粒子数）は1.8であり、単一粒子封入と同様です。完全に規則的に交互に配列した粒子の場合、流れ方向の粒子間隔は約17から18 µmです。大きな液滴の平均サイズは39.8 pLであり、ランダム封入と比較して3.8 kHzの速度で生成されました。383個の液滴のサンプルサイズにおいて、2つの粒子を含む規則的封入液滴の平均割合は71.5%であり、予測されるランダム封入の割合である26.8%とは対照的でした。689個の粒子のサンプルサイズにおいて、正しく封入された液滴に含まれた粒子の割合は79.5%であることが観察されましたが、ランダム封入の割合は33.4%でした。以上の結果から、単一粒子および二重粒子の封入効率は、いずれもランダム封入効率を2倍以上上回り、目的の細胞数や粒子数を含まないドロップの数を大幅に減少させることが示されました。高い封入効率を得るために適切な粒子または細胞濃度が重要であることが、この実験ランで示されています。オイルと水相の流速は前述の二重粒子封入ランと同じですが、ドロップあたりの平均細胞数 lambda は1.57に減少しています。その結果、完全な規則正しさは得られず、トレインの中に空隙が生じ、想定よりも粒子数が少ないサン・ドロップが現れます。このヒストグラムは、Lambdaの値が低いために、2つの粒子の封入効率が低下していることを示しています。324個のドロップのサンプルにおいて、2つの粒子を含むドロップの平均割合は55.9%であり、単一粒子のドロップがほぼ2粒子ドロップと同数存在していました。これは、選択した$\lambda$の値に基づき、1ドロップあたりの許容細胞数が少ないか多いかに応じて、正しく封入された粒子または細胞を最大化するためには、$\lambda$を1ドロップあたりの目標細胞数と同等またはそれに近い値にするべきであることを示しています。本デモンストレーションでは、浮力の不一致を利用して、実験中の濃度をリアルタイムで制御しています。しかし、より長期的な実験においては、細胞を水相ドロップに封入した後の結果をより安定させるために、浮力を一致させることが推奨されます。時間依存的な実験は、遠心管内で行うか、あるいは液滴をマイクロ流体アレイに再注入して顕微鏡下で観察することによって実施できます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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