ハイスループットマイクロカプセル化シングルセルと複数セル

ピコリットルサイズの微小液滴に細胞を封入して利用するアプリケーションでは、液滴あたりの細胞数を制御できないことがしばしば制限となってきました。本プロトコルでは、流体力学的細胞整列とフローフォーカシングマイクロノズルでの液滴生成という2つの異なるマイクロ流体現象を組み合わせることで、細胞封入を制御する方法を実証します。上流チャネルにおいて、細胞または粒子を懸濁させた水溶液を十分に高い流速で供給することで、下流の流れ方向に等間隔に並んだ列（トレイン）を形成させます。

フローフォーカシング液滴生成ノズルを用いて、界面活性剤で安定化させた許容オイルキャリア流体中に、キロヘルツ単位の速度で水相液滴を形成します。次に、水相とオイルの流速を調整して液滴生成を制御し、縦方向に整列した細胞または粒子が液滴生成ノズルに到達するタイミングと同期した液滴生成速度を実現することで、整列した細胞粒子のトレインと液滴生成を組み合わせます。なお、ここでは粒子を細胞の代用品として使用します。このプロトコルを実証するには、流体による制限を抑えるために、流速を十分に低く設定する必要があります。

生物学的細胞にかかるせん断応力、細胞の整列に伴う液滴生成の重複、および細胞の生存率について検討します。水相の流速制約により、単一細胞および複数細胞の制御された封入に適した理想的な動作領域が得られます。ビデオ顕微鏡データの解析により、単一および二重の細胞または粒子の封入効率は、ランダム封入効率を上回り、目的の数の細胞または粒子を含まない液滴の数を大幅に減少させることが示されました。

細胞や液滴を閉じ込めることで、細胞分泌物の希釈を抑制し、細胞の不均一性を際立たせるとともに、バルク懸濁液と比較して細胞間シグナルを制御することが可能になります。これらの細胞を液滴に効率的に封入する手段は、生物学研究者にとって非常に有用なツールとなります。この手順を開始するために、AutoCADソフトウェアを使用して、この図に示すようなマイクロチャネルパターンを設計してください。

長いチャネル部分は、幅 27 µm の水相流整列チャネルを表しています。拡大したノズル概略図では、水相整列チャネルとオイルチャネルがともに 27 µm の等しいチャネル幅であり、それに続いて 22 µm のノズル収縮部があり、その後 61 µm のより広いチャネルへと急拡大しています。デバイスの高さは 52 µm です。

水相および油相の両方の入口には、この油相入口の拡大概略図に示されるように、秩序化チャネル幅と同程度のギャップを持つ大きなデブリフィルターが備わっています。ここでは、染料を注入した秩序化チャネルとノズルの実像を示します。チャネル部分が暗い背景に対して透明になるよう、マイラーフィルムまたは石英上に高解像度透過マスクを印刷し、外部メーカーに依頼してください。

続いて、レプリカ成形用のシリコンおよびSU-8フォトレジストマスターを作製します。PDMSレプリカ成形のため、マスターモールドをペトリ皿の底にテープで固定します。レプリカ成形が完了し、デバイスの外形を切り出した後、外径0.75 mmのバイオプシーパンチを用いて、図に示す3つの円形領域に流体ポートを穿孔します。プラズマ接合後、PDMSのパターン側にスコッチテープを貼り、剥がして埃を除去します。

PDMSを洗浄したガラス製顕微鏡スライドに貼り付けます。デバイス全体をオーブンに入れ、徐々に120 °Cまで昇温させます。ボンディングを完了させ、PDMSを元の疎水状態に戻すため、デバイスを120 °Cのオーブンに一晩保持します。

チャネルのガラス表面を疎水化する別の方法として、Aquapelなどのコーティング剤を流体ポートに注入し、その後空気でパージする方法があります。1 mLのシリンジとシリンジ針を用いて、数百 µLの空気を吸い込み、続いてシリンジの金属製チップ部分のみを満たす少量のAquapelを吸い込みます。慎重に、かつ確実にAquapelを注入し、続けてパージ用の空気を流体ポートに注入してください。この際、PDMSとガラスの接着面を過度に破壊しないように注意してください。

乾燥時にチャネルを閉塞させる可能性のある堆積物を避けるため、余分な水分を拭き取りながら、すべての入口および出口ポートでエアパージを繰り返します。適切な数のドロップに適切な数の細胞を配置するためには、細胞濃度の制御が不可欠です。これには、困難な2つの要素があります。

一つ目は事前に適切な濃度を推定することであり、二つ目は実験中にその濃度を維持することです。本研究で使用した特定のデバイスでは、制御されたカプセル化を行うために、8～15 µmの細胞または粒子が適切であると考えられます。このデモンストレーションでは、細胞の代用として9.9 µmのポリ（スチレン）マイクロクロスフィアを使用します。理想的なカプセル化を実現するための水性粒子懸濁液の濃度を調製するには、完全な充填に関する先行データに基づき、マイクロスフィアのストック濃度を重量比1%固形分から開始します。目安として、ストックサンプル1 mLを緩やかに遠心分離し、上清液250 µLを除去した後、ボルテックスミキシングまたはより穏やかな攪拌で粒子を再懸濁させることで、濃度を1.5%固形分まで上昇させます。

このビデオでは示していませんが、細胞を使用する場合、細胞とポリスチレン粒子の両方の比重は1より大きくなります。数分から数時間という長時間にわたる実験では、粒子には塩化カルシウム、細胞にはOptiPrepなどの溶質を添加することで、溶液の浮力を調整して一致させることができます。細胞または粒子の懸濁液が準備できたら、15 mL centrifuge tubeに10 mLの連続相フルオロカーボンオイル試料を用意し、ボルテックスしてください。

界面活性剤とフルオロカーボンオイルを重量比で約2.5%になるように混合します。ここでは、マイクロカプセル化実験のセットアップに許容される重量比2.4%の混合液を得ています。まず、倒立光学顕微鏡と高速カメラの電源を入れます。

マイクロチャネル層に焦点を合わせ、チャネル内に詰まりや、脱落して流出する可能性のある破片がないか確認します。大きな破片や明らかな詰まりのないチャネルを選択してください。デッドボリュームを最小限に抑えるため、水相入口、オイル入口、およびエマルション出口用に、半透明のTigon PVCチューブを3本、適切な長さに切断します。

シリンジポンプから顕微鏡まで届く分だけチューブを切断します。流体ポートへの挿入を容易にするため、チューブの端を45度の角度にカットしてください。ピンセットを使用して、チューブ端を流体ポートに押し込み、固定します。次に、水系入口チューブの空いている端に、30ゲージの鈍端ステンレス製シリンジ針を押し込んで固定します。

オイル入口チューブについても同様に繰り返します。装置を移動させ、チューブを顕微鏡ステージに取り付け、20倍の対物レンズを使用して装置のノズルに合わせてアライメントとフォーカスを行います。顕微鏡を手動で調整してケーラー照明を行い、焦点面で最適な照明が得られるようにします。

高速カメラのソフトウェアを使用して、より高いフレームレートを可能にするためにノズル周囲の視野をクロップし、次に、最適な録画に必要なフレームレート、露光時間、およびその他のカメラ設定を行います。続いて、あらかじめ準備し十分に混合させた水相溶液を1 mLシリンジに充填します。また、油相溶液を3 mLシリンジに充填します。

充填したシリンジの1本を垂直に傾け、軽く叩いて気泡をシリンジの出口に移動させます。シリンジを垂直に保持したまま、プランジャーをゆっくりと押し下げ、空気がシリンジの先端まで押し出されるようにします。シリンジを、装置に既に装着されている対応するシリンジ針に接続します。

プランジャーを押し下げ、シリンジ針の死腔に空気を強制的に通し、液体がチューブを通ってデバイスの直前まで到達するようにします。シリンジをシリンジポンプにしっかりと固定し、プランジャーブロックを係合させます。2本目のシリンジについても同様に接続を行い、2台目のシリンジポンプに固定します。各シリンジポンプの電源を入れ、プログラムを設定します。製造元のプロトコルに従い、初期流量をオイル相で50 µL/min、水相で5 µL/minに設定します。

水相の開始において、ポンプは各液体がデバイスに入り、チャネル内を満たして残りの気泡を押し出すまで待機します。初期流量を使用する場合、これには数分かかることがあります。ノズルでの液滴の形成を確認してください。

長い水相溶液チャネル内で粒子の整列を観察するため、水相の流速をゆっくりと上げます。流速を上げる際、この例（別の液滴生成ノズルを使用したもの）に示されるように、ノズルで水相流のジェッティングが誘発されるまで流速を上げないでください。ここでは、不安定な流れと不揃いな液滴が生じています。粒子の濃度が低すぎて、欠損粒子の比較的少ない交互の列が得られない場合で、かつサンプルが浮力調整されていない場合は、粒子がシリンジ出口に向かって緩やかに沈降するように、シリンジポンプをシリンジ出口側へ物理的に傾けてください。

適切な整列が確認されたら、オイルの流量を調整して、液滴の生成頻度とサイズを調整します。カプセル化率と液滴容量を希望の値にするため、両方の流量を繰り返し調整してください。安定した整列カプセル化が確認されたら、出口チューブを廃棄容器から回収容器に移し、後で使用できるようにします。

単一または二重の粒子あるいは細胞の封入を高効率で実現できます。本プロトコルを用いた代表的な結果として、オイル流速 60 µL/min、水相流速 9 µL/min での単一粒子封入を示します。液滴あたりの平均粒子数である Lambda は 0.95 です。

完全に整列した交互粒子の場合、流れ方向の粒子間隔は約17～18 micronsです。この例における液滴生成速度は6.1 kilohertzであり、平均液滴サイズは24.4 picolitersです。ヒストグラムは、単一粒子封入のオーダーとプラスの液滴封入粒子効率を比較したものです。

統計について、サンプルサイズ517液滴におけるランダム封入では、1つの粒子を含む液滴の平均割合は79.5%であり、予測されるランダム封入割合の36.7%とは対照的であった。正しく封入された液滴に含まれる粒子の割合は、サンプルサイズ491粒子で83.7%と観察された一方、ランダム封入割合は37.3%であった。水相の流量を9 µL/minに維持したまま、油相の流量を30 µL/minに下げるだけで、2粒子封入が達成される。ここでの液滴あたりの平均粒子数であるlambdaは1.8であり、これは単一粒子封入と同様である。

完全に規則的に交互に配置された粒子の流れ方向の間隔は約17〜18 µmです。大きな液滴の平均サイズは39.8 pLであり、ランダム封入と比較して3.8 kHzの速度で形成されました。383個の液滴のサンプルサイズにおいて、2つの粒子を含む規則的封入液滴の平均割合は71.5%であり、これは予測されるランダム封入の割合である26.8%とは対照的です。正しく封入された液滴に含まれる粒子の割合は、689個の粒子のサンプルサイズにおいて79.5%と観察されましたが、ランダム封入の割合は33.4%でした。

以上の結果から、単一粒子および二重粒子の封入効率はともに、ランダム封入効率を2倍以上上回り、目的の細胞数または粒子数を含まないドロップ数を大幅に減少させることが示されました。高い封入効率を得るために適切な粒子または細胞濃度が重要であることが、この実験ランで示されています。オイルおよび水相の流量は、前述の二重粒子封入ランと同じですが、ドロップあたりの平均細胞数 lambda は 1.57 に減少させています。

その結果、完全な秩序化は起こらず、トレインに空隙が生じるため、予想よりも少ない粒子を含むサンドロップが発生します。このヒストグラムは、Lambdaの値が低いために、2つの粒子を封入する効率が低下していることを示しています。サンプルサイズ324滴において、2つの粒子を含む液滴の平均割合は55.9%であり、単一粒子の液滴が2粒子液滴とほぼ同数存在していました。

これは、正しく封入された粒子または細胞を最大化するためには、1ドロップあたりの希望細胞数に応じてlambdaの値を適切に選択し、Lambdaをその数と同等または近似させる必要があることを示しています。本デモンストレーションでは、浮力の不一致を利用して、実験中の濃度をリアルタイムで制御しています。しかし、より長期的な実験では、細胞を水相ドロップに封入した後に、より一貫した結果を得るために浮力を一致させることが推奨されます。

時間依存性試験は、遠心分離チューブ内で行うか、あるいはマイクロ流路アレイに液滴を再注入して顕微鏡下で実施することができます。