Name: シンプルな攪拌槽を用いたアルギン酸ビーズにおける哺乳類細胞のカプセル化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 学ぶ アルギン酸ビーズを用いた哺乳類細胞のカプセル化法。攪拌槽によるエマルジョン法で細胞を固定し、細胞治療やin vitro培養への応用を実現します。スケーラブルで堅牢な技術です。

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乳化プロセスに関する彼女の敷設作業と技術サポートのためのLauren Wilkinsonに感謝します。 IgorLaçik博士、Timothy J. Kieffer博士、James D. Johnson博士のご協力とご協力に感謝いたします。 DiabèteQuébec、JDRF、ThéCell、CQMF、自然科学および工学研究評議会（NSERC）、ヒト膵島移植センターおよびベータ細胞再生センター、カナダの幹細胞ネットワーク、健康研究のためのマイケルスミス財団、財政的支援のためのCOST 865、そして自然保護技術のための財団法人である。

アルギネート溶液、CaCO 3懸濁液および酸性化された油を調製する<ol><li> プロセスバッファーと培地を準備する。 <ol><li> 10 mM HEPES、170 mM NaClを使用して高濃度アルギン酸ビーズを生成するために使用される典型的なプロセスバッファーを調製します。 pHを7.4に調整する。 </li><li> 10％ウシ胎仔血清（FBS）、6mMグルタミン、100U / mLペニシリンおよび100mg / mLストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）を用いて典型的な培地を調製する。 </li></ol></li><li> ビーズ中の最終所望濃度の1.17倍でアルギン酸ストック溶液を調製する。 <ol><li>まず、適切な量のアルギン酸塩粉末を計量する。例えば、50:50のLVMおよびMVGアルギン酸塩を含む5％アルギネートの最終濃度を得るために、0.583gのLVMアルギネート粉末および0.583gのMVGアルギネート粉末を合わせることによって、合計1.17gのアルギン酸ナトリウムを計量する。 </li><li> 20 mLのプロセスバッファをautoc磁気攪拌プレート上でガラス張りガラス容器に入れ、約200rpmで攪拌する。溶液にアルギン酸ナトリウム粉末を徐々に加える。 </li><li>溶液を一晩低速で撹拌したままにします。必要に応じて、フラスコを攪拌プレートに固定します。 </li><li>溶液が完全に溶解していない場合は、ボトルを回転ミキサーに固定し、さらに24時間37℃で混合を続けます。 </li><li>半分以下の容量の容器で30分間溶液をオートクレーブすることによりアルギン酸塩溶液を滅菌する。溶液を回収する前に、温度を60℃以下に下げてください。 </li><li>必要に応じて、室温に達する前にオートクレーブ直後にアルギン酸溶液をろ過することにより粒子を除去するが、粘度は十分に低いままである。 </li></ol></li><li> 内部ゲル化のための最終的な所望の濃度の21倍で炭酸カルシウム懸濁液を調製する。 <ol><li> CaCO 3粉末を秤量する。たとえば、広告d 1 g CaCO 3を20 mLプロセス緩衝液に添加して、最終ゲル化剤濃度として24 mM CaCO 3を得る。 </li><li> CaCO 3懸濁液を30分間オートクレーブ処理する。 注：CaCO 3濃度は、重炭酸塩-CO 2平衡のために経時的に変化する。同じストックCaCO 3サスペンションを10回以上のカプセル化手順に使用することは避けてください。 </li></ol></li><li>乳化プロセスのために使用された撹拌容器をオートクレーブする。使用する前に、スピナーフラスコ内に残っ​​ている凝結水の痕跡を取り除いてください。 </li><li>乳化プロセスの直前に、酸性化油を調製する。 50mLコニカルチューブに入れた11mLの鉱油あたり44μLの酢酸を溶解する。 注記：一般的な間違いは、酢酸の溶解が不完全であることです。少量の酢酸をピペッティングすることを避け、ボルテックスを繰り返して酢酸が完全に油に溶解するようにしてください。 注意：酢酸は有毒であり、<html>揮発性酸。この試薬はフュームフードの下で取り扱い、乳化ステップまで酢酸/油溶液を密閉容器に入れてください。詳細については、この試薬に関するMSDSの情報を参照してください。 </li><li>細胞のカプセル化に進む前に、すべての溶液が室温に達するようにしてください。 </li></ol> 2.乳化および内部ゲル化によるアルギン酸ビーズの生成<ol><li>スピンナーフラスコに軽い鉱物油10 mLを入れ、低回転速度（ 例：このビデオで使用したスピナーフラスコの場合は250 rpm）で攪拌を開始します。 </li><li> プロセスに使用される細胞が接着性培養由来である場合、細胞を懸濁させるためにトリプシンを適用する。 FBS含有培地またはトリプシンインヒビターを添加して反応を終了させ、細胞計数のためのサンプルを収集する。 <ol><li>トリパンブルー染色後の細胞濃度および生存率を、前述したように、血球計または自動セルカウンターを用いて決定するass = &quot;xref&quot;&gt; 32。 </li></ol></li><li>細胞を300xgで7分間遠心分離し、細胞固定化のために所望の培地で1回それらを洗浄する。この培地にFBSやウシ血清アルブミン（BSA）などの乳化剤が含まれていることを確認してください。たとえば、10％FBSを含むDMEMを使用します。 </li><li>ビーズ中の所望の最終濃度の10.5倍を得るために、同じ培地中で細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li> 9.9mLのアルギン酸溶液に1.1mLの10.5倍濃縮細胞ストックを加える。次に、550μLのCaCO 3懸濁液を添加し、CaCO 3の均一な分布を確実にするために滅菌スパチュラを用いて攪拌することによって混合する。 </li><li>直ちに、アルギン酸塩、細胞およびCaCO 3混合物10.5mLをシリンジを用いて撹拌油に移す。 注意：粘性の高い溶液の場合、気泡を避けるために非常にゆっくりと混合物を吸引して排出してください。ある場合には、混合物をフラスコに添加しながら撹拌を停止してアルギン酸塩の羽根車軸への同伴。 </li><li>アルギン酸塩、細胞およびCaCO 3混合物を油に添加した直後に、撹拌速度を増加させる。 注：ここで使用した5％LVM：MVGアルギン酸塩については、1025rpmの回転速度を適用して、in vitro培養に適した約900μmのビーズを生成させた35 。以前の刊行物25,32に記載されているように、より高い回転速度およびより低いアルギン酸塩濃度は、平均ビーズ直径を低下させる。インペラーおよび血管の幾何学的形状のわずかな変化、ならびにアルギン酸塩の特性は、平均ビーズ直径に大きく影響し得る。血管構成またはアルギン酸塩ロットの各変化について、表面積モーメント平均ビーズ直径と回転速度とを関連付ける標準曲線を生成する必要がある32 。 </li><li>タイマーをスタートさせ、アルギン酸塩を12分間乳化する。 </li><li> 10mLのtエマルジョンを酸性化し、CaCO 3を溶解させ、したがってアルギン酸塩をゲル化したビーズに物理的に架橋させる。この酸性化工程では8分を要する。 </li></ol>ビーズの回復<ol><li>撹拌速度を400 rpmに下げる。 10％培地と混合したプロセス緩衝液40mLを添加してpHを上昇させ、転相を起こさせる。 </li><li> 1分後に攪拌を停止し、混合物を50mLの遠心管に移す。スピナーフラスコをさらに20mLの培地ですすぎ、これをチューブに加える。ビーズと油相との接触を最小限にするために、油相を吸引する前にスピナーフラスコからできるだけ多くの水相を吸引する。 注：ビーズの損傷を避けるために、この段階で大口径ピペット（ 例： 25 mLピペット）を使用してください。小容量の場合、ビーズ懸濁液を切断ピペットチップで操作することもできます。このようなヒントを得るには、ハサミでピペットチップの端を切る眼の保護具を着用してください。 </li><li>ビーズの沈降および相分離を加速するために、チューブを630xgで3分間遠心分離する。 </li><li>パスツールピペットで吸引して油分と過剰の水溶液を除去する。 </li><li>ビーズを培地で少なくとも1回洗浄する。ビーズ懸濁液を40μmナイロンセルストレーナーで濾過し、ビーズに付随する余分な液体をストレーナーの下から吸引する。滅菌スパチュラを使用してビーズを既知量の培地に移す。 注：目標最小ビーズ径に応じて、この段階でより小さいまたはより大きい孔径のフィルターを使用することができます。しかし、ビーズの損傷を避けるために、サブミクロンの孔サイズのフィルターによる圧力駆動による濾過ではなく、重力濾過が推奨されます。 </li><li>ビーズの容量を容積変位（ビーズ添加後の容量からビーズを添加する前の容量から引いた量）で測定し、媒体を上にして、所望のビーズ：全容量比（典型的には1：5）またはビーズ培地4mL。この時点から、大きなビアピペットを使用してビーズを損傷しないようにしてください。 </li><li> インビトロ培養または移植実験のために 、カプセル化された細胞をTフラスコに移す。 </li></ol> 4.品質管理とアプリケーション注：カプセル化された細胞およびビーズの品質を確実にするために、ビーズサイズ分布およびプロセス後の細胞生存を定量化する必要があります。さらなる分析のためにビーズ内から細胞を回収するためにゲルを逆転させるのが一般的に行われる。 <ol><li> ビーズサイズ分布を評価するために、ビーズをトルイジンブルーOで染色する。 <ol><li> 10％完全培地を含む4mLのプロセス緩衝液に0.5mLのビーズを入れる。 </li><li>プロセスバッファーで調製した1 g / Lトルイジンブルー溶液500μLを加えます。 </li><li> 50rpmの回転シェーカー上のコニカルチューブ中で60分間インキュベートする。 </li><li> 10％完全培地を含有する5mLのプロセス緩衝液を添加し、ビーズおよび溶液をペトリ皿に移し、低倍率顕微鏡または手持ち式デジタルカメラを用いて画像を取得する。必要に応じて、ライトボックスにペトリ皿を置き、手持ち式のカメラで画像を取得してコントラストを向上させ、影を避けます。 </li><li>前述の32のように、例えば画像解析フリーウェア36を使用して、ビーズサイズ分布を定量化するために画像解析を行う。 </li></ol></li><li> 細胞生存を定性的に評価するために、エチジウムホモダイマーを用いて細胞を染色し、死細胞およびカルセインAMを同定して生細胞を同定する。 <ol><li> 10容量％の完全培地を含む4容量のプロセス緩衝液に1容量のビーズを加える。 </li><li>適切な量​​のカルセインAMおよびエチジウムホモダイマー原液を加えて、それぞれ4μMおよび2μMの濃度を得る。いくつかのビーズサンプルに試薬の1つだけを加えることによって、単一染色コントロールを生成します。</li><li>ビーズを氷上で20分間インキュベートする。 </li><li>ビーズの圧縮を避けるために、Oリングなどのスペーサーを使用してスライドとカバーガラスの間に溶液を置きます。 </li><li>蛍光顕微鏡に進む。蛍光ブリースルーを評価するために、単一の染色コントロールを使用します。カルセインAM（494/517 nm）およびDNAに結合したエチジウムホモダイマー（528/617 nm）に関連する励起/発光波長に基づいて、適切な蛍光フィルターを選択する。 </li></ol></li><li> さらなる分析のためにビーズから細胞を回収するために、クエン酸塩または別のキレート化溶液を用いてアルギン酸塩を脱気する。 <ol><li> pH7.4で55mMのクエン酸塩、10mMのHEPESおよび95mMのNaClを含有する脱ゲル溶液を調製する。 </li><li>この溶液を10％培地と混合し、次いで混合物9mLにアルギン酸ビーズ1mLを加える。 </li><li>ビーズを75rpmで20分間氷上で脱ゲルする。 注：細胞は、分析のために使用することができ、またはアルギネート溶菌液から取り出すことができますイオンを遠心分離により除去する。例えば、脱泡後の細胞生存率は、トリパンブルー染色によって定量することができる。あるいは、細胞を遠心分離し、洗浄し、続いてmRNA、DNAおよび/またはタンパク質のサンプリングおよび分析を行うことができる。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者は何も開示することはない。

内部ゲル化反応中の様々なステップ（ 図2に図示）は、全体的な反応速度を制限する可能性がある。 〜2.5μmより大きい炭酸カルシウムの場合、炭酸塩の溶解速度は速度制限26,44であることが示されている。内部のカルシウム放出をもたらす酸性化段階もまた、細胞生存に影響を及ぼす重要なプロセス変数であることが示されている32 。したがって、内部ゲル化をもたらす条件は、ビーズ品質および細胞生存の両方にとって決定的に重要である。ビーズの最終用途に応じて、異なる最適プロセス条件を選択することができる。例えば、ビーズの長期安定性が重要である移植用途には、より高いpH低下（ 例えば 、アルギン酸塩溶液を緩衝するための10mM HEPESの使用）が望ましいことがある。一方、より低いpHの低下（ 例えば 、60mMのMOPSを用いてバフアルギン酸塩溶液）は、インビトロの用途には好ましい可能性がある。 酸性化のレベルおよび持続時間を調整することに加えて、他のプロセス改変も想...

哺乳動物細胞のカプセル化は、免疫拒絶1から移植された細胞を保護する手段として、または固定化された細胞培養のための三次元支持体を提供するための手段として広く研究されている2,3,4 。アルギン酸ビーズ中の膵島封入は、同種異系の5,6または異種7,8,9,10,11,12齧歯類における糖尿病を逆転させるために使用されている。 1型糖尿病を治療するためのカプセル化された膵島移植の前臨床試験および臨床試験が進行中である13,14,15。移植用途またはより大きいスケールのためにインビトロで固定化された細胞生産では、ノズルベースのビーズ発生器が一般に使用される。典型的には、アルギン酸塩と細胞との混合物をノズルを通してポンプ輸送して、二価カチオンを含有する攪拌溶液に落ちる液滴を形成し、液滴の外部ゲル化をもたらす。同軸ガス流16,17 、ノズル振動18 、静電反発力19または回転ワイヤ20は、ノズル先端での液滴形成を容易にする。 従来のビーズ発生器の主な欠点は、スループットが限られていることと、十分なビード形成をもたらす溶液粘度の限定された範囲であることである21 。高い流速では、ノズルを出る流体は、ノズル直径よりも小さい液滴に砕かれ、サイズ制御を減少させる。スループットを向上させるためにマルチノズルビードジェネレータを使用できますが、ノズル間の流れの均一な分布と溶液&gt; 0.2 Pasの使用は問題である22 。最後に、使用されるノズルの直径が100μmと500μmの間であり、人間の島の〜15％が200μmより大きくてもよいため、ノズルベースのデバイスのすべてが島にいくらかの損傷を与えると予想される。 このビデオでは、1滴ずつではなく、1回の乳化ステップで液滴を形成することによって、哺乳動物細胞をカプセル化する別の方法について説明します。ビーズ製造は単純な撹拌容器で行われるため、この方法は、設備コストが低くても、小（〜1mL）から大規模（10 3L範囲）のビーズ製造に適しています。この方法は、ビーズ生成時間が短い（ 例えば、 20分間）広範囲のアルギン酸塩粘度を用いて、高い球形度を有するビーズの製造を可能にする。この方法はもともとPoncelet et all。 DNA27 、インスリン29を含むタンパク質28 、および細菌30を固定化するために使用された。私たちは、最近、これらの方法を、膵β細胞株31,32および一次膵臓組織32を用いた哺乳動物細胞のカプセル化に適用した。 この方法の原理は、鉱油中のアルギネート液滴からなる油中水型エマルジョンを生成し、続いてアルギン酸塩液滴を内部でゲル化させることである（ 図1 ）。最初に、封入剤（ 例えば、細胞）を、初期プロセスpHにおいて低い溶解度を有する微粒子カルシウム塩を含有するアルギン酸塩溶液に分散させる。次いで、アルギン酸塩混合物を撹拌した有機相に添加して、通常は界面活性剤。哺乳類細胞のカプセル化の場合、血清中に存在する成分は界面活性剤として作用することができる。次に、水相に分配する油溶性酸を添加することによってカルシウム塩を可溶化するためにpHを低下させる。鉱物油/水分配係数&lt;0.005〜33を有する酢酸は、油中に予め溶解され、次いで乳濁液に添加され、油相中で混合され、水相34に急速に分配される。 図2は、酸性化および内部ゲル化工程中に起こる化学反応および拡散を示す。最後に、カプセル化された細胞は、転相、遠心分離によって加速された相分離、繰り返し洗浄工程および濾過によって回収される。次いで、これらの工程の後に、品質管理分析、 インビトロ細胞培養および/またはカプセル化細胞の移植のためのビーズおよび細胞サンプリングを行うことができる。 図1：哺乳動物細胞をカプセル化するための乳化に基づくプロセスの概略図。ビーズは、鉱油中のアルギン酸塩、細胞およびCaCO 3混合物を乳化させることによって（酢酸塩を添加することにより内部ゲル化を誘発する（工程3））、最初に製造される（工程1および工程2）。次いで、ゲル反転ビーズを水性緩衝液を添加して転相（工程4）、次に遠心分離および油吸引（工程5）、次いで濾過（工程6）を加えることにより、油から分離する。最後に、フィルター上に集められたビーズは、インビトロ培養または移植のために細胞培養培地に移される。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55280/55280fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <imgalt = &quot;図2&quot; class = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55280 / 55280fig2.jpg&quot; /&gt; 図2：内部ゲル化中に起こる反応および拡散ステップ。 （1）酢酸を有機相に添加し、対流によってアルギン酸塩小滴に輸送する。 （2）酢酸が水相に分配される。 （3）水の存在下では、酸が解離して拡散して濃青色のCaCO 3粒子に達する。 （4）H +イオンはCaCO 3中のCa 2+イオンと交換され、Ca 2+イオンを放出する。 （5）カルシウムイオンは、未反応アルギン酸塩に遭遇するまで拡散し、アルギン酸鎖のイオン化架橋をもたらす。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55280/55280fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> 従来のノズルベースの細胞カプセル化装置とは対照的に、広いビーズサイズ分布が達成される攪拌乳化における液滴形成のメカニズムのために、このプロセスから生じる。アプリケーションのサブセットでは、このビードサイズの分布に問題がある可能性があります。例えば、細胞のより大きな部分が、より小さいビーズのビーズ表面に露出され得る。栄養素（ 例えば酸素）の制限が懸念される場合、これらの制限は、より大きなビーズで悪化する可能性がある。撹拌乳化法の利点は、平均ビーズサイズが、乳化工程の間の撹拌速度を変えることによって容易に調節できることである。広範なビーズサイズ分布は、カプセル化された細胞性能に対するビーズサイズの影響を研究するために利用することもできる。 乳化および内部ゲル化による哺乳動物細胞のカプセル化は、ビーズ発生器を備えていない研究室にとって興味深い代替物である。さらに、この方法は、処理時間を短縮するか、非常に低いまたは非常に高いアルギネート濃度でビーズを生成するという選択肢をユーザに与えるations。 10mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）緩衝液中で調製した10.5mLの5％アルギン酸溶液中に細胞をカプセル化する方法を下記に概説する。アルギン酸塩は、移植グレードLVM（低粘度高マンヌロン酸含量）およびMVG（中粘度高グルロン酸含量）アルギン酸塩の50:50混合物からなる。物理的架橋剤として、最終濃度24mMの炭酸カルシウムを使用する。軽質鉱物油は有機相を構成し、酢酸はエマルジョンを酸性化し、内部ゲル化を誘発するために使用される。しかしながら、選択されるアルギン酸塩の種類および組成、ならびにプロセス緩衝液は、所望の用途32に依存する。このプロトコールを用いて様々なアルギネート型（表の表を参照）を使用してビーズを作製した。

<table><tbody><tr><td><ストロング>試薬および消耗品</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LVMアルギン酸塩(移植グレード)</td><td>ノバマトリックス</td><td>適用不可</td><td>結果では「アルギン酸塩#1」と呼ばれています。</td></tr><tr><td>MVGアルギン酸塩(移植グレード)</td><td>Novamatrix</td><td>適用不可</td><td>結果では「アルギン酸塩#2」と呼ばれています。</td></tr><tr><td>アルギン酸塩(細胞培養グレード)</td><td>Sigma</td><td>A0682(低粘度)またはA2033(中粘度)</td><td>A2033は、結果では「アルギン酸塩#3」と呼ばれています。</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、特徴付け、カナダ原産</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SH3039603</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンおよびストレプトマイシン</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES、細胞培養試験</td><td>済み Sigma</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>細粒CaCO3</td><td>Avantor Materials</td><td>1301-01</td><td>CaCO3懸濁液を調製した後、超音波処理して1ヶ月以内に使用してください。</td></tr><tr><td>軽鉱物油</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>O121-4</td><td>滅菌フィルターを0.22 &mu;使用前にM孔径の膜。</td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A38-500</td><td>取り扱いには注意が必要です:MSDSを参照してください。</td></tr><tr><td>滅菌ヘラ</td><td>シグマ</td><td>CLS3004-100EA</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ナイロンセルストレーナー、40 & マイクロ;m</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット (2 mL、5 mL、10 mL、25 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>トルイジン Blue-O</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mLマイクロキャリアスピナーフラスコ</td><td>Bellco</td><td>1965-00100</td><td>最近のモデルのインペラ構成は、適切な乳化には適していない可能性があります。フラスコの底から0.5cmまでオイルをスイープできるブレードは、テフロンシートからカスタムメイドできます。</td></tr><tr><td>速度調整可能な磁気攪拌板</td><td>Bellco</td><td>7760-06005</td><td>回転速度は、使用前に校正する必要があります(例:タコメーターを使用)。</td></tr><tr><td>セルカウンター</td><td>Innovatis</td><td>Cedex AS20</td><td>このシステムは、ロシュ社から販売されています。この自動セルカウンターは、血球計算盤を使用したトリパンブルー染色後の手動細胞列挙に置き換えることもできます。</td></tr><tr><td>LEDライトボックス</td><td>Artograph</td><td>LightPad&reg;長所</td><td>このアイテムは、他のタイプのイルミネーターと交換できます。</td></tr><tr><td>ハンドヘルドカメラ</td><td>Canon</td><td>PowerShot A590 IS</td><td>さまざまなハンドヘルドカメラを使用して、トルイジンブルー-oの染色ビーズ画像をキャプチャできます。画像を取得する前に、ビーズが入ったペトリ皿の隣に定規を配置する必要があります。</td></tr><tr><td>位相差と適切な蛍光フィルターを備えた蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX81</td><td>ビーズのイメージングには、いくつかの顕微鏡システムを使用しました。ここに示す結果は、GFPおよびTRITC蛍光フィルターを装備したIX81顕微鏡で得られたものです。ビーズ全体を捕捉するために、攪拌速度に応じて4倍から20倍の対物レンズを使用しました。生/死染色画像は、通常、20倍から40倍の対物レンズで撮影されました。</td></tr><tr><td>画像取得ソフトウェア</td><td>Molecular Devices</td><td>Metamorph</td> 位相<td>差や蛍光画像を取得するために、様々な画像取得ソフトウェアを利用することができます。</td></tr><tr><td>画像解析フリーウェア</td><td>CellProfiler</td><td>該当なし</td> ビーズ<td>をオブジェクトとして識別し、ビーズサイズを解析するために、さまざまな画像解析ソフトウェア(ImageJなど)を使用することができます。</td></tr></tbody></table>

シンプルな攪拌槽を用いたアルギン酸ビーズにおける哺乳類細胞のカプセル化

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

アルギン酸ビーズにおける細胞のカプセル化は、インビトロでの固定培養およびインビボでの免疫隔離のために用いられてきた。膵島のカプセル化は、同種異系移植または異種移植における膵島生存を増加させる手段として広範囲に研究されている。アルギン酸塩カプセル化は、一般に、ノズル押出および外部ゲル化によって達成される。この方法を使用して、ノズルの先端に形成された細胞含有アルギン酸液滴は、液滴中に拡散する際にイオン性アルギン酸ゲル化を引き起こす二価カチオンを含む溶液に落ちる。ノズルチップにおける液滴形成の要件は、達成可能な容積スループットおよびアルギン酸塩濃度を制限する。このビデオでは、哺乳類の細胞を70％〜90％の細胞生存率で0.5％〜10％のアルギン酸塩にカプセル化するスケーラブルな乳化方法について説明します。この代替の方法により、細胞および炭酸カルシウムを含有するアルギネート液滴を鉱油中で乳化し、内部カルシウム放出およびイオノトロピックアルギン酸塩ゲル化をもたらすpHの低下によって低下した。現在の方法は、乳化の20分以内にアルギン酸ビーズの生成を可能にする。カプセル化工程に必要とされる装置は、大部分の実験室で利用可能な単純攪拌容器からなる。

<html>乳化および内部ゲル化プロセスの終わりに、最初のアルギネートおよび細胞混合物の体積と同様のビーズ容量を回収する必要がある。ビーズは非常に球状であり、欠陥はほとんどありません（ 図3 ）。ビーズは、大口径ピペットを介したピペッティングに耐えるほど十分に強くなければなりません。高いアルギン酸塩濃度では、カプセル化された油または空気小滴がビーズ中に観察され得る。これは、乳化段階（油/水/油の二重乳濁液）中のアルギン酸塩小滴への油の捕捉のために起こりそうである。本発明者らの手では、これらのビーズはビーズ体積の小さい部分（&lt;5％）を表し、これらのビーズの大部分は、その低い密度のためにビーズ回収段階の間に油を吸引しながら除去された。 <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55280/55280fig3.jpg" /><br...

このビデオと原稿は、簡単な撹拌容器を用いて大きなバッチで製造することができるアルギン酸ビーズ0.5％〜10％の哺乳動物細胞をカプセル化するエマルジョンベースの方法を記載しています。カプセル化された細胞は、インビトロで培養され得るか、または細胞治療用途のために移植され得る。

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet ...

このビデオでは、シンプルな撹拌容器を用いて、膵島などの哺乳類細胞をアルギン酸ビーズ内に固定化する方法について解説します。本手法の原理は、水と油の乳化によってアルギン酸液滴を生成し、次いでその液滴を内部ゲル化させることです。手順の最初のステップでは、アルギン酸、細胞、および炭酸カルシウムを含む水相を、ミネラルオイルの有機相に分散させてエマルションを生成します。第2ステップでは、酢酸などの油溶性酸を添加してエマルションを酸性化させ、酸を水相に急速に分配させます。pHが低下することで炭酸カルシウムが溶解し、アルギン酸液滴が内部ゲル化してビーズとなります。最終ステップでは、水溶液を添加してエマルションからビーズを回収し、遠心分離で相分離させた後、ビーズの洗浄およびろ過を行います。固定化された細胞は、その後in vitroで培養するか、移植に使用することができます。今回説明した手法は、アルギン酸ビーズを作成するためのノズルベースの細胞カプセル化装置を使用する代替手法です。これは、1992年にPonceletらによって初めて報告された、酵素および微生物細胞の固定化手法から派生したものです。私たちが最も関心を寄せている応用例は、移植細胞を免疫隔離するための手段としてのアルギン酸カプセル化であり、これにより拒絶反応抑制剤の必要性を低減、あるいは完全に排除することを目指しています。ノズルベースの装置と比較して、エマルションベースのプロセスの主な利点は、その拡張性と堅牢性にあります。液滴がほぼ同時に生成されるため、非常に希薄なアルギン酸溶液または非常に高濃度のアルギン酸溶液のいずれからでも、短期間に極めて大量のビーズを製造することが可能です。さらに、このプロセスは非常に堅牢で失敗しにくく、ノズルを塞ぐ可能性のある粒子が存在する場合でも影響を受けません。また、プロセスに使用する装置は極めてシンプルであるため、多くの研究室にとって導入しやすく、相対的に低コストです。主要な処理工程は、アルギン酸液の液滴を形成する乳化と、内部のカルシウム源を放出させる酸処理の2段階です。液滴のサイズは、主にインペラ（攪拌翼）の設計、攪拌速度、および攪拌時間に影響されます。ビーズの機械的特性および細胞の生存率は、酸処理の程度と時間に影響されます。このビデオでは、移植用に細胞を5%アルギネートビーズに封入する方法を実演します。これらのパラメータは、他の潜在的な応用においては最適化が必要になると考えられます。LVMおよびMVGアルギン酸を等量混合して5%アルギン酸ビーズを作製するには、LVMアルギン酸粉末 583 milligramとMVGアルギン酸粉末 583 milligramを秤量します。マグネチックスターラーの上に20 milliliterのプロセスバッファーを置きます。移植用途には、pH 7.4の

mammalian-cell-encapsulation-alginate-beads-using-simple-stirred

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、合成ハイドロゲル内の細胞の3次元（3D）カプセル化するためのプロトコルを提示する。カプセル化手順は、次の2つの一般的に使用される架橋の方法（マイケル型の加算と光 -...

組織工学のための3Dハイドロゲルの細胞のカプセル化

以下のセクションでは、我々は、生物医学アプリケーションで使用するためのアルギン酸ミクロスフェアを調製するための手順を概説します。我々は、特に1型糖尿病の潜在的な治療法として細胞やタンパク質のカプセル化という二重の目的のために多層アルギン酸ミクロスフェアを作成するためのテクニックを示しています。...

バイオメディカル応用のためのアルギン酸ミクロスフェアの生成

このビデオでは、神経毒性のあるアミロイドβ分泌細胞をカプセル化するポリマーマイクロビーズの作製方法を紹介しています。細胞-ポリマー懸濁液はマイクロビーズ製造装置で処理され、カルシウム架橋によってポリマーゲル化が達成され、細胞の周囲に球状のマイクロビーズが形成されます。このポリマーは、細胞増殖を可能にすると同時に、制御された長期のアミロイドベータ放出を可能にし、アルツハイマー病におけるその蓄積をシミュレートします。...

アルツハイマー病モデリングのためのアミロイドβ放出ポリマーマイクロビーズの作製

ここでは、腹腔内脂肪組織での熱産生のために脂質を消費し、肥満マウスのエネルギー散逸を増加させる異化細胞のカプセル化のためのプロトコルを提示します。...

移植のためのカプセル化サーモ前脂肪細胞の脂肪組織デポへ

私たちは、多能性幹細胞(PS細胞)を同軸ノズルを用いてアルギン酸ヒドロゲルカプセルに封入する方法を確立しました。 これにより、細胞が過度に凝集するのを防ぎ、浮遊培養で細胞が受けるせん断応力を制限します。...

同軸ノズルを用いて多能性幹細胞のアルギン酸カプセル化

提示例としてL-キシルロースの生産を使用して、補因子再生と改善された再利用のための共固定化全細胞生体触媒のためのプロトコルです。補因子再生の機能的相補酵素を表す2 大腸菌株を結合することによって達成されます。全細胞生体触媒の固定化は、カルシウムアルギネートビーズ中の細胞のカプセル化により達成されます。...

補因子再生と改善された再利用のためのアルギン酸ビーズでマルチ生体触媒の固定化

不均一な細胞集団を持つ耐荷重組織のエンジニアリングと分析は、まだ課題です。ここでは、1つのコンストラクト内で多様な細胞集団を共培養するためのプラットフォームとして、二層アルギン酸ヒドロゲルディスクを作製する方法について説明します。...

階層化アルギン酸構築：異種細胞集団の共培養のためのプラットフォーム

このプロトコルは、細胞を固定化するアルギネートの急速な物理的ゲル化による細胞封入方法を示す。得られたマイクロビーズは、時間をかけてアミロイドβの制御および持続的な分泌を可能にし、インビトロおよびインビボモデルで分泌されたアミロイドβの効果を研究するために使用することができる。...

アルツハイマー病のモデリングに用いられるアミロイドβ分泌アルギン酸マイクロビーズの製造

ここで提示されるは、齧歯類の目への生物学的製剤の長期配信のための不死化細胞のマイクロカプセル化におけるポリマーとしてのアルギン酸塩の使用のためのプロトコルである。...

マウスアイへの生物学的製剤の送達のためのカプセル化された細胞技術

ここでは、3D培養条件でのブタ卵母細胞のカプセル化のための2つのプロトコルを示します。第1に、cumulus-oocyte複合体(COC)はフィブリンアルギン酸ビーズにカプセル化される。第2に、フッ素化エチレンプロピレン粉末粒子(マイクロバイオリアクター)で封入される。両システムは、3D組織を維持するために最適な条件を保証します。...

ポルシン卵母細胞カプセル化のためのタンパク質分解アルギン酸ヒドロゲルおよび疎水性マイクロバイオリアクター

学ぶ アルギン酸ビーズを用いた哺乳類細胞のカプセル化法。攪拌槽によるエマルジョン法で細胞を固定し、細胞治療やin vitro培養への応用を実現します。スケーラブルで堅牢な技術です。

シンプルな攪拌槽を用いたアルギン酸ビーズにおける哺乳類細胞のカプセル化

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