シンプルな攪拌槽を用いたアルギン酸ビーズにおける哺乳類細胞のカプセル化

このビデオでは、単純な攪拌容器を使用して、膵島などの哺乳類細胞をアルギン酸ビーズに固定する方法について説明しています。この方法の原理は、水と油のエマルジョンによってアルギン酸液滴を生成し、続いてアルギン酸液滴の内部ゲル化を行うことです。手順の最初のステップは、アルギン酸細胞と炭酸カルシウムを含む水相が鉱油有機相に分散しているエマルジョンを生成することにあります。

第2のステップは、酢酸などの油溶性酸を添加してエマルジョンを酸性化し、水相に急速に分配することです。pHの低下は、炭酸カルシウムの溶解と、アルギン酸液滴のビーズへの内部ゲル化につながります。最後のステップは、水溶液を添加してエマルジョンからビーズを回収し、遠心分離によって相を分離し、続いてビーズを洗浄してろ過することです。

固定化された細胞は、その後、in vitroで培養するか、移植に使用できます。ここで説明した方法は、ノズルベースのセルカプセル化器を使用してアルギン酸ビーズを生成する方法に代わるものです。これは、1992年にポンスレットらによって最初に報告された酵素と微生物細胞の固定化の方法に由来しています。

私たちが最も関心を持っているアプリケーションは、移植された細胞を免疫隔離する手段としてのアルギン酸塩カプセル化であり、拒絶反応抑制薬の必要性を減らしたり、さらには排除したりします。ノズルベースのデバイスに対するエマルジョンベースのプロセスの主な利点は、そのスケーラビリティと堅牢性です。液滴はほぼ同時に生成されるため、非常に希薄なアルギン酸溶液または非常に濃縮されたアルギン酸溶液から、非常に大量のビーズを非常に短時間で生成できます。

さらに、プロセスは非常に堅牢で、ノズルを遮る可能性のある粒子が存在する場合でも失敗する傾向がなく、最終的にプロセス機器はかなり単純であるため、ほとんどのラボでアクセス可能で、非常に比較的低コストです。主な処理ステップは、アルギン酸液滴を形成するための乳化と、内部カルシウム源を放出するための酸性化です。液滴のサイズは、主にインペラの設計、攪拌速度、攪拌時間の影響を受けます。

ビーズの機械的特性と細胞の生存は、酸性化の程度と持続時間によって影響を受けます。このビデオでは、移植のために細胞を5%アルギン酸ビーズにカプセル化する方法を紹介します。これらのパラメーターは、他の潜在的なアプリケーションの最適化が必要になる可能性があります。

LVMとMVGアルギン酸の半分と半分の混合物を含む5%アルギン酸ビーズを生成するには、583ミリグラムのLVMと583ミリグラムのMVGアルギン酸粉末を秤量します。20ミリリットルのプロセスバッファーをマグネチックスタープレート上に置きます。移植用途には、pH 7.4 の 170 ミリモル塩化ナトリウムを含む 10 ミリモルの HEPES バッファーを使用します。

アルギン酸粉末を溶液に徐々に加えます。溶液を低速で一晩攪拌したままにします。必要に応じて、フラスコを攪拌板に固定します。

翌日、アルギン酸塩が不完全に溶解している場合は、ジャーをロータリーミキサーに固定し、摂氏37度で一晩混合を続けます。アルギン酸塩が完全に溶解したら、溶液を30分間オートクレーブして滅菌します。オートクレーブを開く前に、温度が摂氏50度を下回るのを待ちます。

炭酸カルシウム懸濁液を20ミリリットルのプロセスバッファーに1グラムの炭酸カルシウムを加えて調製します。炭酸カルシウム懸濁液とエマルジョンプロセスに使用される攪拌容器をオートクレーブします。使用する前に、容器から凝縮した水の痕跡をすべて取り除

エマルジョンプロセスの直前に、44ミリリットルの氷酢酸を50ミリリットルの円錐管に入れた11ミリリットルの鉱油に溶解します。よくある間違いは、酢酸の溶解が不完全であること、10マイクロリットル未満のピペッティング量を避け、ボルテックスを繰り返すことで酸が完全に溶解するようにすることです。すべての溶液が室温に達するのを待ってから、細胞のカプセル化に進みます。

スピナーフラスコに10ミリリットルの鉱油を入れ、250RPMで攪拌を開始します。β-tc3細胞などの接着細胞を使用する場合は、細胞をトリプシンしてください。完全な培地を追加して反応を終了し、細胞計数用のサンプルを採取します。

細胞濃度は、手動または自動セルカウンターで測定します。細胞を300gで7分間遠心分離し、その後、細胞パレットを完全な培地に再懸濁します。遠心分離ステップを繰り返し、次に細胞を適切な容量の完全培地に再懸濁して、ビーズ中の所望の最終濃度の10倍と1/2倍を得ます。

9.9ミリリットルのアルギン酸溶液を平底チューブに移し、次に1.1ミリリットルの細胞ストックと550マイクロリットルの炭酸カルシウム懸濁液を追加します。アルギン酸、炭酸カルシウム、細胞懸濁液を穏やかなボルテックスで混合します。すぐに注射器を使用して、この混合物の10.5ミリリットルを攪拌油に移します。

攪拌速度を上げてから、タイマーを始動します。攪拌速度を決定するには、まずビーズサイズを攪拌速度に関連付ける標準曲線を生成する必要があります。12分後、10ミリリットルの油と酢酸溶液を加えてエマルジョンを酸性化し、炭酸塩からカルシウムを放出し、ゲル化ビーズを得ます。

この内部ゲル化ステップに8分かかります。フェノールレッドのpH指示薬を含む乳化液滴の色の変化に注意してください。攪拌速度を400 RPMに下げ、10%の培地と混合した40ミリリットルのプロセスバッファーを追加して酸を中和します。

1分後に攪拌を停止し、混合物を円錐形のチューブに移します。スピナーフラスコを追加の20ミリリットルのメディウムですすぎ、これをチューブに加えます。油相を吸引する前に、できるだけ多くの水溶液を吸引してください。

チューブを630gで3分間遠心分離し、ビーズの沈降と相分離を促進します。パスツールピペットで吸引することにより、オイルと余分なプロセスバッファーを除去します。ビーズを少なくとも1回は、630 gの遠心分離を使用して培地で洗浄します。

ビーズ懸濁液を40ミクロンのナイロンセルストレーナでろ過し、ストレーナー内の余分な液体を下から吸引します。ヘラを使用して、ビーズを既知の量の培地に移します。ビーズの量を測定し、培地を補充して、目的のビーズ濃度を取得します。

一般的な濃度は、総体積5ミリリットルあたり1ミリリットルのビーズです。これ以降は、ビーズを傷つけないように、必ず大口径のピペットで取り扱ってください。カプセル化された細胞は、Tフラスコに移し、in vitro培養または移植に使用できます。

エマルジョンプロセスの最後に、固定化された細胞を含むアルギン酸ビーズが得られるはずです。プロセス後、ビーズサイズの分布と細胞の生存率を定期的に評価する必要があります。ビーズのサイズ分布を決定するために、ビーズをトルイジンブルーで染色し、続いて画像分析を行います。

このプロセスから、幅広いビードサイズの分布が期待されます。細胞の生存率を評価するために、ビーズをcalcein-AMやethidium homodimerなどの生きた死染色物とインキュベートすることができます。このビデオで説明したプロセスを使用して、76%β-tc3細胞の生存率を測定しました。

このビデオを見た後、単純な攪拌システムを使用して哺乳類細胞をアルギン酸ビーズに固定する方法を十分に理解しているはずです。このビデオに示されている基本的なプロトコルは、幅広いアルギン酸タイプと石灰化を使用して、さまざまな細胞タイプを固定化するのに適しているはずです。アルギン酸塩またはオイルの新規ロットごとに、平均ビーズサイズと攪拌速度を関連付ける標準曲線を生成することをお勧めします。

私たちが説明した乳化プロセスは、ノズルベースのセルカプセル化器の有望な代替品です。これは、哺乳類細胞をアルギン酸ビーズに固定するための堅牢で簡単な方法です。私たちをはじめ、世界中の人々がノズル細胞治療を開発する中で、何千人もの糖尿病患者に対して、このような規模の方法が必要となるでしょう。

私たちは、β細胞株を5%アルギン酸ビーズに移植した有望な結果を発表しており、この改善された移植拒絶反応に対するバリアのin vivo性能を引き続き調査しています。