ラットモデルにおける第2高調波発生イメージングによるチューブリン欠損の研究

スライドガラスに取り付けられ、バッファーに浸したラットの脳組織スライスから始めます。

ラットは、微小管の構成要素であるチューブリンの欠陥によって引き起こされる状態である尿細管症に苦しんでおり、微小管の異常な蓄積と破壊を引き起こします。

これは、中枢神経系におけるミエリン産生にも影響を与えます。

ライスを覆われた2光子励起顕微鏡の下に置いて、詳細なイメージングを行います。

ライスの完全性を維持するために、定期的にスライスに水分を補給してください。

顕微鏡を非デスキャンイメージングモードに設定し、弱い信号を検出するためのラベルフリーの技術です。

組織をパルス赤外線レーザーにさらします。

微小管は、第2高調波発生またはSHG信号として知られる検出可能な信号として光を放出します。

微小管蓄積のある領域はこれらの信号を増幅し、検出可能性を高めます。

光学フィルターを適用して、これらの信号を微細化します。

キャプチャされた画像は微小管の密度と異常を明らかにし、SHG 強度とクラスタリングが高い場合は、チューブリンの欠損とミエリン産生の減少を示します。

サンプルを顕微鏡下に置き、透過光で接眼鏡を通して直接観察して対物レンズの下に適切に配置します。余分なHBSSを除去して、薄い液膜がサンプル全体を覆うようにします。サンプルの過度の蒸発や乾燥を避けるために、数分ごとに液膜を目視でチェックしてください。

暗いインキュベーションチャンバーのすべてのドアを閉めるか、インキュベーションチャンバーを黒いナイロンポリウレタンコーティングされた布で覆うなど、非デスキャンイメージング用の顕微鏡ステージを準備します。伝送経路に沿って、非デスキャンイメージングモードを選択します。このようにして、チューブリンの弱いSHシグナルの捕捉が最適化されます。

次に、目標を選択します。次に、ピクセル滞留時間を12.6マイクロ秒にするレーザー出力を設定します。512 x 512ピクセル以下の画像を、平均取得時間15秒の速度5、平均2で撮影します。まず、485ナノメートルのショートパスフィルターを使用して画像をキャプチャします。そして2番目のステップでは、シャープな405ナノメートルのバンドパスフィルターを追加します。