Name: ゼブラフィッシュにおける単一の細胞運命のマッピング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 学ぼう、ゼブラフィッシュ胚の単一細胞を2光子吸収で光活性化し、免疫組織化学で運命マッピングする方法。発生生物学における細胞系譜追跡と組織局在解析に応用可能です。

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ケージド・フルオレセイン・デキストランの合成プロトコルを提供していただいたJ. Chen氏に感謝いたします。本研究は、March of Dimes賞（5-FY09-78）、アメリカ心臓協会（American Heart Association）賞（09BGIA2090075）、およびS.S.へのNIH/NHLBI賞（R01 HL107369-01）の支援を受けて行われました。また、顕微鏡観察のサポートをいただいたC. Closson氏に深く感謝いたします。

1. ケージドフルオレセインデキストランの合成（参考文献14より改変）
<ol>
<li>ddH₂Oで希釈した0.1 Mホウ酸ナトリウム溶液を調製する。2O.</li>
<li>10 kDaアミノデキストランを4 mg量り取り、CMNBケージドフルオレセインのチューブに加える。</li>
<li>追加 500 μL 調製したホウ酸ナトリウム溶液（ステップ1.1）を、CMNB-ケージドフルオレセインが入ったチューブに加える。チューブにキャップをし、30秒間ボルテックスして混合物を溶解させる。</li>
<li>混合物を室温のニューテーター上で一晩反応させる。周囲の光にさらされないよう、チューブをアルミホイルで遮光する。</li>
<li>Zeba脱塩スピンカラムを用意し、底部のキャップをひねって外します。遠心時の方向を確認するための目印として、カラムに印を付けます。カラムを15 mLのFalcon製コニカルチューブに入れます。注：スピンカラム内の溶液はカラムバッファーです。</li>
<li>脱塩スピンカラムの上部キャップを緩めます。脱塩スピンカラムを収納した15 mLコニカルFalconチューブを遠心分離機にセットします。スピンカラムに印されたドット（ステップ1.4）が遠心機ローターの中心を向くように配置してください。室温で10 x g、2分間遠心分離します。</li>
<li>遠心分離後、Falconチューブから脱塩スピンカラムを取り出す。回収したフロースルーと15 mLコニカルチューブの両方を廃棄する。新しい15 mLコニカルFalconチューブを用意し、そこに脱塩スピンカラムを設置する。注：遠心分離後、カラムのレジンベッドは圧縮された状態に見えるはずである。カラムは直ちに使用すること。</li>
<li>ステップ1.3で得られた反応混合物（ケージドフルオレセイン-デキストラン）を用意します。スピンカラムからキャップを取り外し、反応混合物を吸引して、脱塩スピンカラムの中央にゆっくりと加えます。反応混合物の添加後、スピンカラムのキャップを再度閉めます。</li>
<li>脱塩スピンカラムを収容したFalconチューブを遠心分離機にセットします。ステップ1.5と同様に、スピンカラムのマークされた点が遠心機ローターの中心を向くように配置してください。室温にて10 x gで2分間遠心分離します。</li>
<li>遠心分離後、黄色い混合物（ケージドフルオレセインデキストラン）を回収します（約 400 μL）を15 mL Falconチューブに入れます。ケージドフルオレセイン-デキストラン混合液を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。</li>
<li>混合物が周囲の光にさらされるのを防ぐため、直ちにチューブをアルミホイルで覆います。スピードバック（SpeedVac）を用いて、ケージドフルオレセイン-デキストラン混合物を凍結乾燥させます。の凍結乾燥により 350 μL 所要時間は約4時間です。</li>
<li>完全な凍結乾燥後、粉末（約3 mg）をnuclease-free water（ddH2O）に再懸濁させる。2最終濃度が約1% w/vになるように〇を加える。短時間ボルテックスして粉末を懸濁させ、混合する。</li>
<li>ケージドフルオレセイン-デキストランを、個別の金属箔で覆ったチューブに分注し、-20 °C.</li>
</ol>
2. 胚の回収およびケージドフルオレセイン-デキストランのマイクロインジェクション
* この手順では、動物モデルシステムとしてゼブラフィッシュを使用します。
<ol>
<li>注射の前日に、区切り板のある繁殖タンクで、オスとメスの比率を1:1または2:1にしてゼブラフィッシュの交配セットアップを行う。</li>
<li>翌朝、繁殖タンクの水を換え、区切り板を取り除く。直ちに、1 X Danieau培地（「溶液の調製」を参照）またはddH2Oを用いて、ケージドフルオレセイン-デキストランの1/10希釈作業溶液を5 μL調製する。光への曝露を防ぐため、作業溶液のチューブをアルミホイルで覆う。</li>
<li>調製したケージドフルオレセイン-デキストラン溶液（ステップ2.2）をニードルにピペットで吸い取る。解剖顕微鏡下でニードルの先端を適切なサイズにカットする前に、白色光源の前に透明なイエローフィルターを配置する。このイエローフィルターにより、注射中のフルオレセイン-デキストランの不随意な脱ケージングを防ぐことができる。接眼レンズを通して見たとき、光源が黄色に見えることを確認する。</li>
<li>胚を回収し、マイクロインジェクション用モールドトレイにピペットで移す。3から4 nLのケージドフルオレセイン-デキストランを注入するようにマイクロインジェクションの時間を設定する。解剖顕微鏡下でピンセットを用いて胚の向きを整え、（3から4 nLの）ケージドフルオレセイン-デキストランを割球の基部（割球と卵黄の界面）に注入する。注射を行う胚のステージは1〜2細胞期であること。</li>
<li>注射後、胚をマイクロインジェクション用モールドトレイから取り出し、新鮮な魚用水が入った清潔なペトリ皿に移す。真菌の増殖を防ぐため、最終濃度0.02 % w/vとなるようにメチレンブルーを魚用水に添加してもよい。注入したケージドフルオレセイン-デキストランの脱ケージングを防ぐため、ペトリ皿をアルミホイルで覆う。</li>
<li>注入した胚を、目的の細胞を光活性化させる必要があるステージまで育成する。光活性化のために、ddH2Oを用いて0.6 %低融点アガロース溶液を調製する。胚のステージに応じて、低融点アガロースにトリカイン（MS2）を添加することができる。添加する場合、0.02 %トリカインを低融点アガロースで希釈し、最終濃度を0.0014 %とする。</li>
<li>胚が適切な発生段階に達しだい、1 X Danieau培地中でピンセットを用いて胚の卵膜を取り除く。卵膜除去を行う際は、白色光源の経路に透明なイエローフィルターが配置されていることを確認する（ステップ2.3参照）。</li>
<li>0.6 %低融点アガロース溶液を37 °Cに加熱する。LabTekチャンバー付きカバーガラススライドのウェルに、低融点アガロースを1 mLピペットで入れる。3〜4個の胚を慎重に低融点アガロースに固定し、光活性化させる細胞が底面のカバーガラス側を下に向くようにピンセットで向きを調整する。</li>
<li>アガロースを凝固させる。凝固後、アガロースの上に1 X Danieau培地を1 mLピペットで加える。</li>
<li>さらに多くの胚に対して、ステップ2.8から2.9を繰り返す。</li>
</ol>
3. ケージドフルオレセインデキストランの2光子活性化
* この手順は、胚がレポーターGFPを発現していることを前提としています。胚は、LSM 510 META NLO顕微鏡に搭載されたアルゴンイオン（48 nm）レーザー光源を用いて観察します。GFP陽性の単一細胞を選択し、LSM 510に接続されたMai Taiレーザー（フェムト秒レーザー）を用いて光活性化させます。非蛍光胚の場合も手順は同様です。あるいは、白色光を使用して活性化させる細胞を特定し、その後Mai Taiレーザー光源を用いて活性化させることも可能です。
<ol>
<li>LSM 510ソフトウェアを起動します。白色光ビームパスに透明な黄色フィルターを配置します。</li>
<li>Scan New Imageを選択し、Start Expert Modeをクリックします。</li>
<li>Laserタブを選択します。アルゴンイオン（48 nm）およびMai Tai（フェムト秒）レーザー光源をオンにします。</li>
<li>Mai Taiの波長を740 nmに設定します。</li>
<li>configタブを選択し、アルゴンイオンおよびMai Taiレーザーの光路構成を設定します。</li>
<li>Scanタブを選択し、対物レンズを20X/0.8に変更します。</li>
<li>Maxをクリックして最大走査速度を設定します。</li>
<li>Mode、Method、NumberをそれぞれLine、Mean、1に設定します。</li>
<li>Channelsタブで、Mai Tai以外のすべてのレーザー光源の選択を解除します。</li>
<li>光ビームパスにパワーメーターを配置します。</li>
<li>Contボタンを選択して連続走査を有効にします。</li>
<li>パワーメーターの平均レーザー出力が47 mWになるまで透過率（%）を調整します。</li>
<li>Stopボタンを選択して走査を停止します。</li>
<li>ChannelsタブでMai Taiレーザー光源の選択を解除し、アルゴンイオン（48 nm）を選択します。</li>
<li>Fast xyボタンを選択します。Channelsタブで、最高の画質を得るためにアルゴンイオンレーザーのピンホール、検出器ゲイン、アンプリファイアオフセット、およびアンプリファイアゲインを調整します。</li>
<li>ステージコントローラーを使用して、活性化させる細胞を探し、フォーカスを合わせます。</li>
<li>Stopボタンをクリックします。</li>
<li>ズームツールを使用して、Modeタブのズーム倍率が50から70になるまで、活性化させた細胞を拡大します。</li>
<li>Stopボタンを選択して走査を停止します。</li>
<li>Channelsタブでアルゴンイオンレーザー（48 nm）の選択を解除し、Mai Taiレーザーを選択します。</li>
<li>Modeタブで走査速度を31.46 secに設定します。</li>
<li>Singleボタンを選択し、選択した細胞のケージドフルオレセインデキストランの二光子活性化のための走査を開始します。</li>
<li>活性化後、ChannelsタブでMai Taiレーザーの選択を解除し、再度アルゴンイオンレーザー（48 nm）を選択します。</li>
<li>Modeのズーム倍率を1に設定し、Speed項目のMaxボタンをクリックして最速の走査速度に設定します。</li>
<li>Fast xyを選択して、光活性化領域を確認します。光活性化領域にレーザーアブレーションが生じていないことを確認してください。レーザーアブレーションの詳細については、考察セクションを参照してください。</li>
<li>他の胚についても、以上の手順を繰り返します。</li>
</ol>
4. ケージ解除済みフルオレセイン-デキストランの免疫検出（文献16より改変）
<ol>
<li>光活性化後、白色光源の前に透明な黄色フィルターを置き、鋭いピンセットを用いて低融点アガロースから各胚を manually に取り出す。取り出したすべての胚を、新鮮な 1 X Danieau 培地を含む新しいペトリ皿に入れる。胚が光にさらされるのを防ぐため、ペトリ皿を金属箔で覆う。</li>
<li>必要に応じて、胚を希望の発育段階まで育成させる。その間に、4 % パラホルムアルデヒド溶液を調製する（「溶液の調製」を参照）。調製したパラホルムアルデヒド 1.5 mL をマイクロセントリフュージチューブに分注する。</li>
<li>胚が目的の発育段階に達した後、胚をマイクロセントリフュージチューブ（ステップ 4.2）にピペッティングして移す。光への露出を防ぐため、チューブを金属箔で覆う。</li>
<li>チューブを 4°C で一晩ニューテート（緩慢回転）させる。翌日に、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）および ddH2O を用いて段階的なエタノール（EtOH）溶液（30 % EtOH:PBS、50 % EtOH:PBS、70 % EtOH:ddH2O、および 100 % EtOH）を調製する。</li>
<li>翌日、胚を 4°C から取り出す。チューブを覆っている金属箔を取り除き、パラホルムアルデヒドを素早く吸引して除去する（胚を覆うのに十分な少量を残す）。チューブに 30 % EtOH:PBS 1.5 mL をピペッティングして加える。チューブを再び金属箔で覆う。室温で 10 分間ニューテートさせる。</li>
<li>50 %、70 %、および 10 % の段階的 EtOH 溶液を用いて、ステップ 4.5 を繰り返す。10 % EtOH での洗浄後、さらに 100 % EtOH で 10 分間胚をすすぐ。</li>
<li>洗浄後、胚を -20 °C で一晩保存する。翌日に、リン酸緩衝Tween（PBT；「溶液の調製」を参照）、5 X ブロッキングバッファー（調製については製造元のプロトコルを参照）、マレイン酸（調製プロトコルはブロッキングバッファーのプロトコルにある）、10 mg/ml プロテイナーゼ K、および 10 X 抗体溶液（Anti-fluorescein-AP；「溶液の調製」を参照）を調製する。</li>
<li>また、PBT で希釈した 2 % ラム血清（LS；「溶液の調製」を参照）を調製する。抗体をニューテーターで揺らしながら 4 °C で一晩保存する。2 % LS は 4 °C で保存可能である。</li>
<li>翌日、胚を -20 °C から取り出す。チューブを覆っている金属箔を取り除き、10 % EtOH を素早く吸引して除去する。チューブに 70 % EtOH:ddH2O 1.5 mL を加える。チューブを再び金属箔で覆う。室温で 10 分間ニューテートさせる。</li>
<li>50 % および 30 % の段階的 EtOH 溶液、および 10 % PBT を用いてステップ 4.8 を繰り返す。10 % PBT での洗浄後、さらに 10 % PBT で 10 分間、3 回胚をすすぐ。</li>
<li>胚が 24 時間以上経過している場合は、プロテイナーゼ K 処理を行う。そうでない場合は、ステップ 4.13 に進む。処理を行うには、調製したプロテイナーゼ K（ステップ 4.7）を PBT で 1:10 に希釈する。胚をプロテイナーゼ K 中で 10 分間、胚がより成熟している場合はさらに長くインキュベートする。光への露出を防ぐため、胚を金属箔で覆ったままにする。</li>
<li>プロテイナーゼ K 処理後、PBT で 10 分間、5 回胚を洗浄する。洗浄後、ニューテーターを用いて室温で 30 分間、4 % パラホルムアルデヒドで胚を固定する。その後、直ちに PBT で 10 分間、5 回胚を洗浄する。光への露出を防ぐため、胚を金属箔で覆ったままにする。</li>
<li>5 X ブロッキングバッファーをマレイン酸バッファーで 1 X に希釈して、ブロッキングバッファーを作成する。胚を PBT から取り出し、1 X ブロッキングバッファーに入れる。胚を金属箔で覆い、室温で 5 ～ 6 時間ニューテートさせる。</li>
<li>5 ～ 6 時間のブロッキング後、65 °C で 15 ～ 20 分間、胚にヒートショックを与える。</li>
<li>前日に調製した抗体溶液と 2 % LS を用意する。抗体溶液を最大 rpm で遠心分離する。水相を 2 % LS チューブに移す。チューブを反転させて混合する。</li>
<li>胚をブロッキングバッファーから LS-抗体混合液に移す。光への露出を防ぐため、胚を金属箔で覆ったままにする。4 °C で一晩ニューテートさせる。</li>
<li>翌日、室温で PBT を用いて 15 分間、6 回胚を洗浄する。AP バッファー（「溶液の調製」を参照）を調製する。</li>
<li>室温で AP バッファーを用い、10 分間 2 回胚を洗浄する。NBT/BCIP 発色溶液（「溶液の調製」を参照）を調製する。</li>
<li>胚を NBT/BCIP に移す。暗所で染色を発色させる。</li>
<li>PBT で 5 分間ずつ 3 回胚を洗浄し、発色を停止させる。</li>
<li>画像取得のため、0.6 % 低融点アガロースまたは 3 % メチルセルロースで胚を封入し、倒立または正立の複合顕微鏡を用いて画像を撮影する。</li>
<li>光活性化サンプルは、段階的な EtOH 洗浄で脱水することで、今後の解析のために保存できる（染色は安定したままである）。サンプルの脱水については、ステップ 4.4 から 4.7 に従う。</li>
</ol>
5. 代表的な結果：
<img src="/files/ftp_upload/3172/3172fig1.jpg" alt="ゼブラフィッシュ胚顕微鏡観察；標的遺伝子発現を示す蛍光、トランスジェニック解析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="図1"> 図1. ケージドフルオレセイン-デキストランの光活性化。(A,B) 光活性化前における、13/14体節期のゼブラフィッシュ胚の側面像（明視野像および蛍光像）。(C,D) 13/14体節期の胚の体節の一つ（矢印）を、波長740 nm、スキャン時間31秒、平均レーザー出力47 mWで光活性化した。活性化後、(D) 脱ケージ化されたフルオレセイン-デキストランによる蛍光が観察される。方向：背側（右）、腹側（左）。スケールバー 100 μm.
<img src="/files/ftp_upload/3172/3172fig2.jpg" alt="矢印で示された遺伝子発現を示す胚切片。発生研究用の顕微鏡画像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="図2"> 図2。 ケージドフルオレセインデキストランの免疫検出。図2は、受精後18/19時間のゼブラフィッシュ胚におけるアンケージドフルオレセインデキストランの免疫染色を示している。10ソマイト期に、図1に記載されたものと同じレーザーパラメータを用いて、側板中胚葉の胚の一部を活性化した。免疫検出法を用いることで、矢印で示す活性化領域が、背景染色の極めて少ない状態で特定されている。方向：背面（上）、腹面（下）。スケールバー 100 μm.

<ol><li>Mathur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mEosFP-based+green-to-red+photoconvertible+subcellular+probes+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">mEosFP-based green-to-red photoconvertible subcellular probes for plants.</a> Plant physiology. 154, 1573-1587 Forthcoming.</li>
<li>Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 15905-15910 (2004).</li>
<li>Subach, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature. 6, 153-159 (2009).</li>
<li>Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+using+a+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature protocols. 1, 960-967 (2006).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).</li>
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<li>Vogeli, K. M., Jin, S. W., Martin, G. R., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+progenitor+for+haematopoietic+and+endothelial+lineages+in+the+zebrafish+gastrula%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A common progenitor for haematopoietic and endothelial lineages in the zebrafish gastrula.</a> Nature. 443, 337-339 (2006).</li>
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<li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein and gene expression.</a> Methods in cell biology. 59, 63-85 (1999).</li>
</ol>

利益相反はありません。

本論文では、ケージ化フルオレセインデキストランの光活性化に基づいた、汎用性の高い単一細胞運命マッピング法について述べる。単一細胞内におけるケージ化フルオレセインデキストランの脱ケージ化は、Zeiss LSM 510 META共焦点顕微鏡に接続されたMai Taiフェムト秒レーザーによる二光子吸収を用いて行う。光活性化された細胞内の脱ケージ化フルオレセインデキストランは、簡便な免疫組織化学的手法を用いて迅速に可視化される。
本プロトコルでは、ケージドフルオレセインデキストランを光活性化するための2光子吸収波長として740 nmを使用しています。この波長は、ケージドフルオレセインデキストランを注入した野生型胚を光活性化させることで実験的に決定されました。レーザー励起波長を600 nmから800 nmまで変化させ、活性化後にフルオレセインの蛍光が認められるかどうかを定性的に判定しました。その結果、740 nmで活性化後のフルオレセイン信号が最も強く得られることがわかりました。理想的には、740 nmがすべてのモデルシステムで有効であるはずですが、ご使用のサンプルにとって最適な2光子励起波長を決定するために、範囲を変えて波長をテストすることをお勧めします。
ケージドフルオレセインデキストランを注入した野生型胚において、テストした各2光子励起波長に対して平均レーザー出力も変化させました。励起波長740 nmの場合、47 mWの平均レーザー出力では、より低い平均レーザー出力と比較して、活性化領域でより強いフルオレセイン信号が得られました。平均レーザー出力をさらに高くしても、フルオレセイン信号は強くなりませんでしたが、組織のアブレーションが誘導されました。フェムト秒レーザーパルスは生物学的組織のアブレーション効率が高いため15、組織のアブレーションを回避する光活性化の閾値となる平均レーザー出力を決定することを推奨します。
2光子吸収は小さな相互作用体積内で起こります。ケージドフルオレセインデキストランを適切に活性化させるには、細胞を正しくフォーカスさせる必要があります。上記のプロトコルでは、細胞のフォーカスを確認するために、GFP陽性細胞を白色光下で同時にイメージングしました。したがって、他のチャンネルに加えて白色光を取得することが推奨されます。細胞のフォーカスを確認した後、本プロトコルでは活性化させる細胞を拡大することを提案しています。ズーム倍率は50〜70倍が推奨されますが、この値は選択した細胞のサイズによって異なります。ズームを上げることで、活性化させる細胞を隣接する細胞から分離し、2光子活性化の走査領域を制限することができます。理想的には、走査領域は細胞の広い範囲をカバーするように設定してください。
単一の活性化細胞を検出するには、背景染まりを最小限に抑える必要があります。上述の免疫検出プロトコルでは、サンプルをブロッキングバッファーで5〜6時間ブロッキングすることが重要です（ステップ4.13）。NBT/BCIPで発色させた場合、ケージ解除されたフルオレセイン-デキストランが10〜20分で可視化されるはずです。背景染まりが強い場合は、ブロッキング時間を延長し、抗体を除去するための洗浄回数を増やすことを推奨します（ステップ4.17）。
図1および図2に、光活性化および免疫検出の代表的な結果を示す。図1では、野生型の1〜2細胞期の初期胚にケージ化フルオレセインデキストランを注入した。胚を分節形成中期まで成長させ、側方から低融点アガロースに固定した。図1(a,b)は、光活性化前の胚の明視野像および蛍光像である。図1(b)においてフルオレセインの蛍光が認められないことから、胚が非ケージ化状態に維持されていたことが示されている。分節の中の狭い領域を、平均レーザー出力47 mW、波長740 nmで31秒間照射して活性化した（図1(c)；矢印）。活性化後、活性化領域からの蛍光に見られるように、フルオレセインデキストランの2光子脱ケージ化が起こった（図1(d)；矢印）。分節組織が損なわれていないことから、活性化に伴うレーザーアブレーションは発生しなかった（図1(c)）。図2は、脱ケージ化されたフルオレセインデキストランの免疫検出結果である。10分節期の胚の側板中胚葉の狭い領域を、図1で述べたものと同じレーザーパラメータを用いて光活性化した。胚を成長させ、ステップ4.1から4.20の手順に従って処理した。図2の矢印は、青色の沈殿物の蓄積によって示される活性化領域の位置を示している。干渉する背景染色はなく、活性化した部位のみが明確に検出されている。
溶液の調製：
1 X PBT (1 L) 
10 X PBS 100 mL 
BSA 2 g 
20 % Tween 10 mL
10 X PBS (1 L) 
80 g NaCl 
2 g KCl 
6.1 g Na2HPO4 
1.9 g KH2PO4 
ddH2Oで1 Lにする 
pH 7.3に調整
4 % パラホルムアルデヒド (160 mL) 
32 % パラホルムアルデヒド (10 mL バイアル 2本) 
8 mL 20 X PBS 
132 mL ddH2O
APバッファー ( 50 mL) 
1 mL 5 M NaCl 
2.5 mL 1 M MgCl2 
5 mL 1 M Tris pH 9.5 
250 μL 20 % Tween 
41.25 mL ddH2O
抗体溶液（サンプル1検体分） 
5.5 μL アセトンパウダー 
40 μL PBT 
0.8 μL LS 
0.1 μL 抗フルオレセインAP抗体
2 % LS (サンプル1つにつき360 μL) 
100 % LS 7.2 μL 
PBT 352.8 μL
1 X Danieau培地 (1 L)‡ 
5 M NaCl 11.6 mL 
1 M KCl 700 μL 
1 M MgSO4 400 μL 
1 M Ca(NO3)2 600 μL 
1 M HEPES 5 mL 
ddH2Oで1 Lまで調整 
pH 7.6に調整
‡ Danieau溶液は、卵膜除去後のゼブラフィッシュ胚を飼育するための理想的な塩溶液です。適切に浸透圧が調整された（ゼブラフィッシュの場合、約 300 mOsm）等張溶液であれば、他の培地を使用することも可能です。
NBTストック溶液 (1 mL) 
50 mg Nitro Blue Tetrazolium 
0.7 mL 無水ジメチルホルムアミド 
0.3 mL ddH2O
BCIPストック溶液 (1 mL) 
5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate 50 mg 
無水ジメチルホルムアミド 1 mL
NBT/BCIP 発色溶液 
1 mL AP バッファー 
4.5 μL NBT ストック溶液 
3.5 μL BCIP ストック溶液
アセトンパウダー
<ol>
	<li>成魚を20匹選び、液体窒素で凍結させる。</li>
	<li>凍結した魚を乳鉢と乳棒で粉末状にすり潰す。</li>
	<li>魚の粉末を50 mLコニカルチューブに移す。</li>
	<li>コニカルチューブに100 %アセトンを満たし、ボルテックスミキサーで攪拌する。</li>
	<li>最大回転数で10分間遠心分離し、上清を捨てる。</li>
	<li>ペレットをさらに100 %アセトンで3回洗浄し、その都度最大回転数で10分間遠心分離する。最後の洗浄までに上清が透明になるはずである。</li>
	<li>ペレットに再び100 %アセトンを加え、チューブを室温で静置する。これにより、密度の高い粒子は沈殿し、微細な粒子は懸濁液中に留まる。</li>
	<li>微細粒子の懸濁液を新しいチューブにデカンテーションで移す。粉末溶液を個別のチューブに分注し、-20 °Cで保存する。</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>CMNB-ケージドフルオレセイン SE</td><td>Invitrogen</td><td>C20050</td><td></td></tr><tr><td>10 kDa アミノデキストラン</td><td>Invitrogen</td><td>D1860</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Desalt Spin Column</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89889</td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>Amresco</td><td>0815-100G</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸ナトリウム</td><td>Amresco</td><td>1131117-100G</td><td></td></tr><tr><td>トリカインメチルスルホナート/ MS222</td><td>Research Organics</td><td>1347A</td><td></td></tr><tr><td>抗フルオレセイン-AP抗体</td><td>Roche Group</td><td>11376622</td><td></td></tr><tr><td>ブロッキングバッファー</td><td>Roche Group</td><td>11 096 176 001</td><td></td></tr><tr><td>マレイン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MO375-500G</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8377-250mg</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-34040</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクター</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-2000</td><td></td></tr><tr><td>LabTek チェンバー付きカバーガラススライド</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>Invitrogen</td><td>AM2544</td><td></td></tr><tr><td>羊血清</td><td>Invitrogen</td><td>16070096</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 META NLO</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20X 0.8 NA 空気アポクロマート対物レンズ</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透明黄色フィルター</td><td>Theatre House Inc.</td><td>Roscolux filter sheet Color: 312</td><td></td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュにおける単一の細胞運命のマッピング

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

単一細胞を特異的に標識する能力は、発生生物学において重要な意味を持ちます。例えば、発達中の胚において造血系、リンパ系、および血管系がどのようにして生じるかを決定するには、未分化な前駆細胞の運命マッピングおよび系譜追跡が必要です。近年、Eos1, 2、PAmCherry3、Kaede4-7、pKindling8、およびKikGR9, 10を含む光活性化タンパク質が、細胞追跡プローブとして広く関心を集めています。これらの光感受性タンパク質の蛍光スペクトルは、UV励起によって容易に変換でき、これにより特定の細胞集団を隣接する細胞から区別することが可能です。しかし、活性化タンパク質の光効率が、長期的な細胞追跡を制限する可能性があります11。光活性化タンパク質の代替として、ケージドフルオレセインデキストランが胚モデルシステムで広く利用されてきました7, 12-14。従来、フルオレセインデキストランを脱ケージングするには、蛍光ランプハウスからのUV励起または単一光子UVレーザーが使用されてきましたが、これらの光源は光活性化の空間分解能を制限します。本稿では、運命マッピング、系譜追跡、および単一標識細胞の検出を行うためのプロトコルを報告します。ケージドフルオレセインデキストランを注入した胚内の単一細胞を、チタンサファイアフェムト秒レーザーから生成される近赤外レーザーパルスで光活性化させます。このレーザーは、本論文で使用したLSM 510 META NLO顕微鏡のような、あらゆる2光子共焦点顕微鏡で一般的に使用されています。生体組織は近赤外線照射に対して透過性を持つため15、選択した焦点面の上方または下方の細胞を脱ケージングすることなく、レーザーパルスを胚の深部まで集光させることができます。したがって、幾何学的な焦点においてのみ非線形2光子吸収が誘導され、単一細胞内のフルオレセインデキストランが脱ケージングされます。脱ケージングされたフルオレセインデキストランを含む細胞を検出するために、活性化細胞を迅速に視覚化する簡便な免疫組織化学プロトコル16について説明します。本論文で提示する活性化および検出プロトコルは汎用性が高く、あらゆるモデルシステムに適用可能です。
注記： 本プロトコルで使用する試薬は、記事末尾に添付された表に記載されています。

Ti:Sapphireフェムト秒レーザー発振器による2光子吸収を用い、ケージド蛍光タンパク質を含む単一細胞を光活性化させる方法について記述します。光活性化された細胞の運命地図（フェイトマッピング）を作成するために、免疫組織化学法を用います。この手法は、あらゆる細胞型に適用可能です。

単一細胞を差別に標識できる能力は、発生生物学において重要な意味を持ちます。例えば、造血細胞がどのようにして……

本実験の全体的な目的は、ゼブラフィッシュ胚における選択された単一細胞の運命マッピングおよび系統追跡を行うことです。これは、ケージドフルオレセインを高分子量のデキストランに化学的に結合させることで達成されます。次に、調製したケージドフルオレセインデキストランをゼブラフィッシュ胚にマイクロインジェクションし、その後、二光子吸収を用いて選択した細胞内で光活性化させます。胚の光活性化後、活性化された細胞の運命マップを作成するために、免疫組織化学的解析を行い、アンケージド・フルオレセインデキストランを検出します。最終的に、この手法を用いることで、光活性化された単一細胞の系統寄与と組織内局在を特定することが可能です。標準的な蛍光顕微鏡法などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、運命マップ作成のために単一細胞を差別的に標識できることです。この手法は、未分化の前駆細胞がいかにして異なる組織型に寄与するかといった、発生生物学における重要な問いに答えるのに役立ちます。胚のマウンティングと光活性化のステップは、テキストによる説明だけでは習得が困難であるため、視覚的な実演が不可欠です。開始する前に、ケージドフルオレセインデキストランを合成し、アルミホイルで覆ったチューブに保存してください。その後、1〜2細胞期の胚に、合成したケージドフルオレセインデキストランをマイクロインジェクションします。胚が適切な発生段階に達した後、コーティングを行います。次に、光活性化のため、コーティングした胚を低融点アガロースに封入します。アガロースが凝固したら、LSM 510 ソフトウェアをロードしてください。白色光の光路に透明な黄色フィルターを配置し、「scan new image」を選択してから「start expert mode」をクリックします。「laser」タブを選択し、アルゴンイオンレーザーおよびMi.Taiレーザー光源をオンにします。Mi.Taiの波長を740 nmに設定します。次に、「config」タブを選択します。アルゴンイオンおよびmi taiレーザーの光路構成を設定します。その後、「scan」タブを選択します。対物レンズを20倍の0.8に切り替えます。Channelsタブで、「max set mode」メソッドをクリックして最大スキャン速度を設定し、数値をそれぞれ「line mean」と「one」に設定します。mi tai以外のすべてのレーザー光源の選択を解除してください。次に、パワーメーターを光ビーム光路に配置し、「con」ボタンを選択して連続スキャンを有効にします。パワーメーターの平均レーザー出力が47 milliwattsとなるまで、透過率を調整します。次に、channelsタブにある停止ボタンを選択してスキャンを停止します。mi taiレーザー光源の選択を解除し、argonne ironを選択します。次に、チャンネルタブにあるfast XYボタンを再度選択し、ピンホールを調整します。アルゴンイオンレーザーで最高の画質を得るために、検出ゲイン、アンプリファイア、オフセットを調整し、再度増幅させます。ステージコントローラーを使用して、活性化させる細胞を探してフォーカスを合わせ、停止ボタンをクリックします。クロップツールを使用して活性化細胞をクロップし、モードタブのクロップ係数が50から70の間になるように調整します。次に、チャンネルタブにある停止ボタンを選択してスキャンを停止させます。モードタブでアルゴンイオンレーザーの選択を解除し、My Taiレーザーを選択します。スキャン速度を31.46 secondsに設定します。次に、選択した細胞のケージドフルオレセインデキストランの2光子活性化スキャンを開始するために、シングルボタンを選択します。活性化後、「channels」タブに移動し、マルチタイレーザーの選択を解除して、アルゴンイオンレーザーを再度選択します。次に、「mode」の下で、ズーム係数を1に設定します。次へ。「speed」の見出しにある「max」ボタンをクリックし、最高スキャン速度に設定します。光活性化領域を確認するには、「fast xy」を選択します。次に「channels」タブを選択してピンホールを調整し、再度検出を行い、光活性化領域がレーザーアブレーションされていないことを確認してください。付属論文に記載されたプロトコルに従って、アンケージド・フルオレセイン・デキストラン免疫検出用の光活性化胚を調製します。胚をPBTで6回、APバッファーで2回洗浄します。その後、胚をAPバッファーが入った9ウェルプレートに移します。次に、APバッファーを吸引し、N-B-T-B-C-I-Pを添加します。N-B-T-B-C-I-P溶液を吸引して、N-B-T-B-C-I-P染色の発色を停止させます。その後、胚をPBTで洗浄します。次に胚を回収し、回転プラットフォーム上で室温で5分間振盪します。その後、PBTによる洗浄をさらに2回繰り返します。最後に、胚を0.6%低融点アガロースに封入し、正立型複合顕微鏡を用いて光活性化細胞の画像を撮影します。この図では、光活性化前のケージドフルオレセインデキストラン鎖を微小注入したゼブラフィッシュ胚の明視野像（左）と蛍光像（右）を示しています。ここで示されているように、左の明視野像で矢印で示された体節の一つを、波長 740 nm、スキャン時間 31 s、平均レーザー出力 47 mW で光活性化させました。右の図では、光活性化後、ケージから解放されたフルオレセインデキストランによる蛍光が観察されます。ケージド・フルオレセインデキストランの免疫染色の様子が、10ソマイト期の胚の側板中胚葉の狭い領域に示されています。前図と同様のレーザーパラメータを用いて光活性化を行い、免疫検出手順を実施しました。矢印で示された活性化領域は、本手順に従うことで、バックグラウンド染色を最小限に抑えて同定することが可能です。ラベル化された細胞の局在や運命をより詳細に特性評価するために、異なる組織特異的マーカーを用いた免疫染色などの追加解析を行うことができます。この手法を用いることで、血管生物学分野の研究者が、発生中のゼブラフィッシュ胚における静脈前駆細胞から動脈への分化の起源を研究するための道が開かれます。NBTやBCIPなどの化学試薬を取り扱う際は、極めて有害な可能性があるため、常に手袋を着用することを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Biology

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ゼブラフィッシュにおける単一の細胞運命のマッピング

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