ゼブラフィッシュにおける単一の細胞運命のマッピング

次の実験の全体的な目標は、ゼブラフィッシュ胚の選択された単一細胞の運命マッピングと系統追跡を行うことです。これは、ケージに入れられたフルオレセインを高分子量デキストランに化学的に結合させることによって達成されます。次に、調製したケージに入れたフルオレセインデキストランをゼブラフィッシュの胚にマイクロインし、2光子吸収を用いて選択した細胞で光活性化します。

胚の光活性化後、免疫組織化学分析を行い、ケージに入れられていないフルオレセインデキストランを検出し、活性化細胞の運命マッピングを行います。最終的に、この方法を使用して、光活性化単一細胞の系統寄与と組織局在を決定することができます。この手法は、標準的な蛍光顕微鏡法などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、フェイスマッピングのために単一細胞を鑑別的に標識するために使用できることです。

この方法は、未分化の前駆細胞がさまざまな組織タイプにどのように寄与できるかなど、発生生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。テキストの説明だけでは胚のマウントと光の活性化ステップを学ぶのが難しいため、視覚的なデモンストレーションが重要です。始める前に、ケージに入れられたフルオレセインデキストランを合成し、金属箔で覆われたチューブに保管してください。次に、合成したケージフルオレセインデキストランを1〜2細胞期の胚にマイクロインプジョンします。

胚が適切な発生段階に達したら、それらをコーティングします。次に、コーティングされた胚を低融点のエアロにマウントします 写真活性化のために。荷重が固まった場合は、LSM five 10ソフトウェアを使用します。

白色光ビームパスに透明な黄色のフィルターを配置し、新しい画像のスキャンを選択して、エキスパートモードの開始をクリックします。レーザータブを選択し、アルゴン鉄とミタイレーザー光源をオンにします。mi tai 波長を 7 40 ナノメートルに設定します。

次に、configタブを選択し、アルゴンイオンとmitaiレーザーの光路構成を設定します。次に、[スキャン]タブを選択します。

目標を 20 × 0.8 に変更します。最大スキャン速度を設定するには、チャネルタブで「最大設定モード」の方法と「数値からライン平均」と「1」をそれぞれクリックし、mi taiを除くすべてのレーザー光源の選択を解除します。次に、光ビームパスにパワーメーターを配置し、conボタンを選択して連続スキャンをアクティブにします。

パワーメーターが平均レーザー出力47ミリワットを読み取るまで、透過率を調整します。次に、[チャネル]タブの下にある停止ボタンを選択してスキャンを停止します。mi taiレーザー光源の選択を解除し、アルゴンン鉄を選択します。

次に、チャネルタブの下にある高速XYボタンを再度選択し、ピンホールを調整します。ゲインを検出し、オフセットを増幅し、再度増幅して、アルゴンヌ鉄レーザーで最高の画質を実現します。ステージコントローラーを使用して、アクティブ化するセルを見つけてフォーカスし、停止ボタンをクリックします クロップツールを使用して、アクティブ化されたセルをクロップし、モードタブの下のクロップファクターが50〜70を表示するようにします。

次に、[チャンネル]タブの[停止]ボタンを選択してスキャンを停止します。アルゴンイオンレーザーの選択を解除し、[モード]タブで[My Tai]レーザーを選択します。スキャン速度を31.46秒に設定します。

次に、シングルボタンを選択して、選択した細胞のケージに入れられたフルオレセインデキストランの2光子活性化のスキャンを開始します。アクティベーション後、[チャネル]タブに移動し、mitaiレーザーの選択を解除し、アルゴンイオンレーザーを再度選択します。次に、モードでズーム倍率を1に設定します。次に。

速度の見出しの下にある最大ボタンをクリックして、最速のスキャン速度を設定します。写真でアクティブ化された領域を確認するには、fast xy を選択します。次に、チャネルタブを選択し、ピンホールを調整して再度検出し、写真の活性化領域がレーザーアブレーションされていないことを確認します。

ケージに入れられていないフルオレセインデキストラン免疫検出用の光活性化胚を調製した後、添付の原稿に概説されているプロトコルに従ってください。胚をPBTで6回、APバッファーで2回洗浄します。次に、胚をAPバッファーの9つのウェルプレートに移します。

次に、AP バッファを吸引し、N-B-T-B-C-I-P を追加します。N-B-T-B-C-I-P溶液を吸引することにより、N-B-T-B-C-I-P染色の現像を停止します。次に、PBTで胚を洗います。

次に、胚を回収し、回転プラットフォームで室温で5分間振とうします。その後、PBTの洗浄をさらに2回繰り返します。最後に、胚を0.6%低融点のarosにマウントし、直立した化合物顕微鏡を使用して光活性化細胞の画像を取得します。

この図では、光活性化前にケージに入れられたフルオレセインdex鎖マイクロ注入ゼブラフィッシュ胚の左に示される明視野画像と右に示される蛍光画像です。ここに示すように、胚は、左の明視野図の矢印で示された体節の1つで、波長40ナノメートル7個、スキャン時間31秒、平均レーザー出力47ミリワットで光活性化されています。右の図では、ケージに入れられていないフルオレセインデキストランからの光活性化蛍光がこの図で観察できます。

ケージに入れられていないフルオレセインデキストランの免疫染色は、側板の小さな領域、中胚葉10に描かれています。したがって、ダニ期の胚は、免疫検出手順を使用して、前の図と同じレーザーパラメータを使用して光活性化されました。ここで矢印で示されているように、活性化された領域は、この手順に従うと最小限のバックグラウンド染色で識別できます。

標識細胞の位置と運命をより良く特徴付けるために、さまざまな組織特異的マーカーの免疫染色などの追加の分析を行うことができます。この技術を用いることで、血管生物学の研究者がゼブラフィッシュの胚発生における静脈前駆細胞の動脈の起源を研究する道が開かれます。NBTやBCIPなどの化学試薬を扱う場合、非常に危険であるため、常に手袋を着用する必要があることを忘れないでください。