Name: 全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学ぶ ゼブラフィッシュの多繊毛細胞可視化法。蛍光in situハイブリダイゼーションと免疫組織化学を組み合わせ、Danio rerioの胚腎における繊毛発生と器官形成のメカニズム解明に貢献します。

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この作品は一部インスタントスキルし国立科学財団大学院研究フェローシップ号助成金 R01DK100237 によって支えられました。DGE-1313583 に A.N.M.また、大学の科学夏学部研究フェローシップ ・ プログラム調印への支援に感謝します。自分専用のケア私たちのゼブラフィッシュのノートルダム大学でゼブラフィッシュ研究センターに感謝したいと思います。また、生物科学専攻だけでなく、彼らのサポートと貴重な洞察力のすべての研究室のメンバーに感謝したいと思います。

次のプロトコルは、ゼブラフィッシュ大人維持し、ノートルダム大学でゼブラフィッシュ研究センターの世話を使用します。ゼブラフィッシュ大人と胚を操作するためのすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 胚の固定
<ol><li>上記の方法39,40を用いたゼブラフィッシュ胚を収集します。24 で hpf、胚の E3 に非特定プロテアーゼ混合溶液 (50 mg/mL) の 500 μ L 皿加温室温 (RT) で追加。</li>
	<li>胚の絨毛膜分割し始め、一旦胚皿からすべての液体を削除します。</li>
	<li>E3 の約 20 mL を追加、皿、E3 を軽く旋回液体廃棄物の容器に液体をデカントによって新鮮な E3 に胚を 2-3 回を洗います。</li>
	<li>修正する前に胚を安楽死、E3 に 0.2% tricaine 2 mL を追加します。</li>
	<li>プラスチック製の Pasteur のピペットを使用して 5 mL バイアルに胚を転送します。胚は、バイアルの底に落ち着いて後にピペットを使用して tricaine/E3 ソリューションのほとんどを削除します。</li>
	<li>撹拌せず常温では、2-4 時間 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 5 mL で 24 hpf 胚を固定します。 注意: PFA は有毒であると研究者は実験用の上着や手袋、眼の保護を着ている間、PFA ソリューションは化学のボンネットの下処理必要があります。PFA 顆粒から PFA 定着剤の準備は、グラニュー PFA が静電気によって分散する傾向がある例外的な注意を払って行わなければなりません。 注: 胚は 4 %pfa が 4 ° C で一晩で修正できます。準備 4% グラニュー PFA を完全に解消するソリューションを継続的に攪拌しながら沸騰させるリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 を加熱することによって PFA。一度ソリューションが RT、PFA は真空ろ過、0.45 μ m の使い捨てシステムを通すことで滅菌フィルター 4% に戻ってダウン冷却し、-20 ° C で保存用 15 mL や 50 mL の部分に避けよう</li>
	<li>削除、4 %pfa と 1 X リン酸バッファーで 2 回洗浄胚 0.1% 生理食塩水トゥイーン 20 (pbst;) 室温洗って新鮮な 100% の右追加 5 mL で 100% メタノール (メタノール) 5 mL を 1 回胚胚にメタノールし、-20 ° c 少なくとも 20 分間加温します。 注: 胚は 100% に格納できる胚の準備の準備ができるまでの-20 ° C でメタノール。</li>
</ol>2. 胚の準備および交配
<ol><li>50 %5 mL で 1 回の洗濯で胚を水分補給 1 のメタノールを 5 mL 30% の胚を洗浄することにより RT 続行水分補給で 5 分間 x PBST 1 のメタノール室温 5 分 x PBST 1 の 5 mL で胚を洗う x PBST で各 5 分の 2 回。RT。</li>
	<li>1 の縮尺プロテイナーゼ K 溶液 5 mL (pK) (10 mg/mL) にそれらを孵化によって胚を permeabilize ルートで 2 分間 x PBST 注: 古い胚 pK 濃度濃度 5 mg/mL とインキュベーション時間 2 分未満しかし、上記の 2 分が 24 未満の胚の示唆されたより長く培養できます hpf。</li>
	<li>室温 2 回 pbst; 4 %5 mL に胚を修正する 1 つの x の 5 mL pK ソリューションと即座に洗浄を削除、少なくとも 20 分間常温 PFA。 注: 胚は 4 %pfa が 4 ° C で一晩で修正できます。</li>
	<li>削除 PFA と洗浄を 2 度 1 の 5 mL 室温 x PBST</li>
	<li>1 の 5 mL の胚を転送平らな底遠心チューブに x PBST それぞれの胚とその後交配ソリューション間の相互作用を容易にする RT で遠心ラックに上向きに置かれました。</li>
	<li>新鮮な Hyb + RT。 追加 1.5 mL でハイブリダイゼーション溶液 (Hyb +) 1.5 mL で 2 回胚を洗って、4-6 h のハイブリダイゼーション オーブンで 70 ° C で胚を孵化させなさい。</li>
	<li>プローブ ソリューションのボリュームの Hyb + 1.5 mL に置き換えます (10 μ L RNA プローブ/500 μ L Hyb +) 胚を完全にカバーするために十分な。 注: は、アンチセンス RNA プローブ以前を使用して説明の方法39を合成します。</li>
	<li>振盪せずに遠心ラックに配置されている個々 のチューブ直立 70 ° C でハイブリダイゼーション オーブンで一晩プローブを交配させます。</li>
</ol>3. ホット洗浄およびブロック
注: ホット洗浄は、胚の適切なソリューションを置くと、ハイブリダイゼーション オーブン 70 ° C で培養によって実行されます。70 ° C で洗浄ソリューションを維持、ハイブリダイゼーション オーブンに各ソリューションの 50 mL チューブに配置場合プローブ/Hyb + 混合物を追加。
<ol><li>プローブを削除します。50% ホルムアミド/2 x 20-30 分のクエン酸塩ナトリウム (SSC) バッファーの 1.5 mL で 70 ° C で 2 回胚を洗います。 注: プローブ Hyb + で-20 ° C で保存して再使用できる後日。</li>
	<li>70 ° c 2 の 1.5 mL で胚を一度洗って 15 分の x SSC は、20-30 分の 0.2 X SSC の 1.5 mL で 70 ° C で 2 回胚を洗います。1.5 ml のブロッキング試薬の置換 0.2 x SSC と 4 ° C で一晩インキュベート 注: それは一晩ではなく 4 h の RT でブロッキング試薬をインキュベートする可能です。</li>
</ol>4. 抗体の孵化とマレイン酸バッファー洗浄
注意: 胚の周囲の光から保護します。
<ol><li>ブロッキング試薬に置き換えて抗 DIG-ポッド縮尺の比率でブロッキング試薬 0.2 mL、3 h の箔や室温に別の遮光カバーの下でインキュベート 注: また、抗体の 4 ° C での一晩インキュベートすることができます。</li>
	<li>3 h 後 2-4 倍した加温胚は一晩で 1.5 mL の新鮮なマレイン酸バッファー 4 ° C の各 10-15 分のマレイン酸バッファーの 1.5 mL で胚を洗ってください。 注: マレイン酸バッファーで一晩インキュベートする必要はありませんが、行うので減少プローブ背景。</li>
</ol>5. プローブの検出およびペルオキシダーゼの除去
注意: 胚の周囲の光から保護します。
<ol><li>マレイン酸バッファーを削除し、1.5 mL の 1x PBS で置き換えます。蛍光染色液室温 60 分 1.5 mL で 5 分間各 0.2 mL に加温した胚 Cy3 の 1x PBS で 2 回胚を洗う 注: 異なるプローブのインキュベーション時間が異なる場合があります。</li>
	<li>RT で 10 分の 1 × PBS で次の % メタノールの 1.5 mL で一度胚を洗う: 30%、50% メタノール メタノール、75% メタノールと 100% メタノール。</li>
	<li>1.5 ml の MeOH 中 RT。 洗浄で 30 分間 1% H2O2の胚を RT で 10 分の 1 × PBS で次の MeOH ソリューションの 1.5 mL で一度胚孵化させなさい: 75% メタノール、50% メタノール、および 30% メタノール。1.5 mL の 1x PBS で常温 5 分のため 2 回胚を洗浄します。 注: 胚に格納できる PBS 一晩 4 ° C で</li>
</ol>6. 蛍光抗体法
注意: 胚の周囲の光から保護します。
<ol><li>室温 7 分洗う ddH2O 5 分の 1.5 mL で一度胚した洗浄で 1.5 に一度胚のためあらかじめ冷やしたアセトン (-20 ° C で保管) の 1.5 mL で胚した洗浄で ddH2O 5 分の 1.5 mL で胚を洗う1 mL 1 %dmso (PBDT) ルートで 5 分間 x PBST</li>
	<li>2 時間常温ロッカーの PBDT + 10% 牛胎児血清 (FBS) の 1.5 mL で胚を孵化させなさい。</li>
	<li>一次抗体、抗アセチル化チューブリン (マウスから生産)、アンチ-γ-チューブリン (ウサギから生産)、PBDT + 1 %1: 400 で一緒に希釈した 1.5 mL で取り外して交換する PBDT + FB 政府短期証券。4 ° C で一晩胚を孵化します。 注: インキュベーション時間は一次抗体によって異なる場合があります。さまざまな時間間隔のテスト表示を最適化する必要があります。</li>
</ol>7. 二次抗体
注意: 胚の周囲の光から保護します。
<ol><li>過剰を削除する胚からの抗体を非連結、FBS + ロッカーに RT で 1 分の 0.1 M の NaCl を PBDT + 1% の 1.5 mL で洗います。</li>
	<li>胚を洗う PBDT + 1% の 1.5 mL で 5 回 FBS + 室温ロッカーに各 30 分の 0.1 M の NaCl を洗う胚 PBDT + 1% の 1.5 mL で 30 分常温ロッカーの FBS。</li>
	<li>一晩で 200 μ L 二次抗体の 4 ° C の胚をインキュベート アレクサ 488 ヤギ抗マウス igg 抗体と Alexa 647 ヤギ抗ウサギ IgG、1: 500 で PBDT で一緒に希釈しました。</li>
</ol>8. DAPI 染色
注意: 胚の周囲の光から保護します。
<ol><li>胚をすぐに洗って RT で PBDT の 1.5 mL で 2 回。DAPI の 1.5 mL で PBDT を置き換える、pbst; X 1 で 1:15000 を希釈し、15 分常温ロッカーを孵化させなさい。</li>
	<li>PDBT + 1% の 1.5 mL で胚を洗う FBS + 0.1 M 塩化ナトリウム 3 回 RT 15-20 分間。マウントし、イメージの準備ができるまで、4 ° C で PBDT の 1.5 mL で胚を格納します。</li>
</ol>9. マウントおよびゼブラフィッシュ Pronephros イメージング
<ol><li>小さな容量の約 10 μ L、PBDT のガラス スライドのレイアウト胚横。</li>
	<li>頭を削除する微細鉗子のペアと卵黄球の一部の目の後ろに胚を絞る。</li>
	<li>ゆっくりとこすり胚の体から残りの卵黄のボールに微細鉗子を使用します。薄い組織でスライドから分離卵黄、余分な液体を削除します。</li>
	<li>胚の残りの尾にメディアのマウントを一滴を追加し、尾を横に置いたように配置します。サンプルでは、平らにするカバー スライド ボックスに配置し尻尾の上に coverslip を配置します。</li>
	<li>次のチャネルを使用して共焦点顕微鏡の 60 倍の倍率で腎臓繊毛をイメージ: 青の DAPI (408.0 でセットをレーザー nm)、緑の FITC (488.0 でセットをレーザー nm)、赤色素 Cy3 標識 (561.0 でセットをレーザー nm) と白の Alexa 680 (637.0 でセットをレーザー nm)。</li>
</ol>

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上記の詳細なプロトコルは、 odf3bトラン スクリプトと α-チューブリン 24 hpf ゼブラフィッシュ胚における pronephros の MCCs のラベルに最適です。最良の結果は、新鮮な固定および準備された胚を使用することをお勧めします。固定と 1 週間以上-20 ° C でメタノールまたは Hyb + のいずれかで保存されている胚は、胚をストレージに保持する時間の増加を汚す不要なバック グラウンドの確率が使用できます。
変更とトラブルシューティングのこの技術の特定のマーカー、その他のアンチセンスの riboprobes やその他の抗体などの他のスイーツのこのメソッドに合わせて必要です。全台紙の in situハイブリダイゼーション過程でステップのパラメーターを調整するための多くの方法がされている31,34,36,38、私たちのグループで以前記載されています。 39。同様に、各蛋白質抗体染色時間の面でいくつかのトラブルシューティングが必要になります、希釈、各一次抗体の孵化時間のおおよその範囲が文書化された結果28,の評価によって算出された最高35。 24 歳未満の胚の hpf、pK の治療は 2 分より短くなるはずどこ 24 より古い胚 2 分より長いため pk hpf を扱う必要があります。また、胚 24 より古い hpf は pK 治療前に、色素の漂白する必要があります。
蛍光染色液で染色後、メタノールや過酸化水素洗浄のシリーズを実行することによって、任意の残りの汚れ、抗体およびペルオキシダーゼを削除するが重要です。PBS 洗浄直後は胚から過剰なメタノールを削除に不可欠です。重要なは、IF 抗体を前に、我々 はアセトンと脱イオン水洗浄胚互いおよび/または遠沈管に付着しにくいことを発見しました。私たちの経験、特定のトランスクリプション要因および他の遺伝子のための抗体効率的に働くことがありますけれども西部のしみ、ゼブラフィッシュのよく動作しません。ただし、α-チューブリンと β-カテニンなどの非常に節約された、豊富な蛋白質は場合16,37のゼブラフィッシュでうまく動作しないでください。
魚、まだのゼブラフィッシュ特異抗体を持っていない遺伝子の RNA 転写産物を視覚化することが可能です。このプロトコルによって示されるように場合魚を組み合わせることによって、RNA 転写産物やタンパク質の共局在は見られる生体内で(図 2) できます。プロトコルの柔軟な性質により、様々 な RNA 転写産物と多数の組織および時間ポイントにおけるタンパク質の可視化のための迅速なトラブルシューティングできます。ゼブラフィッシュ胚のすでに尊敬の特性と組み合わせることで、魚 + 場合のこのプロトコルは発達経路制御する遺伝子および重要なタンパク質発現を探検する別のツールを提供します。

過去数十年にわたってゼブラフィッシュ (動脈分布) は、発生生物学を研究するプライム モデル生物として浮上しています。胚は母親以外の開発と光学的透過的です。また、目、腎臓、脳などの重要な器官の形成はちょうど 24 時間後受精 (hpf) によって形成された構造を持つ急速に発生します。重要なは、ゼブラフィッシュのゲノムが哺乳類1,2,3保存性が高い。さらに、ゼブラフィッシュと哺乳類の臓器と同様の解剖学と生理学があります。ゼブラフィッシュ胚の腎臓、または pronephros、初期のなかでもと脊椎動物のネフロン4,の保存された上皮細胞集団の運命決定の間に遺伝子の機能を調べるためのモデル システムの値を示してください。5,6,7,8,9,10します同様に、ゼブラフィッシュ胚の MCCs11,12,13,14,15,の個体発生を調べることでますます重要になっている。16,17。
その名の通り、MCCs は上皮細胞の頂端表面17に位置する繊毛の束によって特徴付けられます。ゼブラフィッシュ、MCCs 液流機能、24 hpf11,12,13,14、 、pronephros の各ネフロンの中間を通してファッションのような「霜降り」に分散しています。15,16,17. ひと腎臓の病気症例18,19,20,21MCCs、脳など他の哺乳類の組織で普及している彼らは、ほんの一握りで指摘されているが、気管22,23,24、実験的なデザインの課題を提起します。ゼブラフィッシュを含む様々 な脊椎動物モデルでエレガントな研究は、クライアント開発12,17,25 阻害剤としてシグナル伝達経路の切り込みと MCC 運命の保存された経路を示しています。、26,27。したがって、ゼブラフィッシュ pronephros クライアント開発生体内で11,12,13,14,の遺伝子のメカニズムを勉強する簡単にアクセスできるモデルについて説明します15,16,17。
透明性とゼブラフィッシュ胚の遺伝的操作を容易、初期胚1,2 の開発、組織の成長、細胞の運命を制御する遺伝学的および分子経路を検討するとき非常に貴重な特性であると証明します。 ,3。タンパク質と遺伝子の転写産物の in situハイブリダイゼーションなど全体の場合のマウントを視覚化する、されているに適用しゼブラフィッシュ16,28,29のために最適化された、このような伝統的な手法として 30,31,32,33,34,35,36,37,38。魚の場合は人気のあるプロトコルを組み合わせて、ラベル、MCCs体内の16,28,37,38を分析することが可能です。

<table><tbody><tr><td>非特異的プロテアーゼ混合液</td><td>Roche</td><td>11459643001, Streptomyces griseus 由来プロナーゼ</td><td>E3 without メチレンブルーで希釈して 50mg/mL ストック溶液を作製; -20°C;C</td></tr><tr><td>E3 溶液</td><td></td><td></td><td>蒸留水で 50X E3 (250 mM NaCl、8.5 mM KCl、16.5 mM CaCl2、16.5 mM MgSO4) を蒸留水で希釈し、1 x 10-5 M メチレンブルー (sigma M9140) を加えて汚染を抑制します</td></tr><tr><td>トリカイン (3-アミノ安息香酸エチル メタンスルホン酸)</td><td>Fluka</td><td>A5040-250G</td><td>0.2% ストック溶液を作るには、1 g のトリカイン粉末を 10 mL トリスに溶解します。 pH 9.5および蒸留水 500 mLまでの蒸留水</td></tr><tr><td>胚皿</td><td>VWR</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>5 mLガラスバイアル</td><td>ウィートン</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てプラスチック パスツールピペット</td><td>VWR</td><td>414004-004</td><td></td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド(PFA)溶液</td><td>電子顕微鏡サービス</td><td>19210</td><td>4% PFAを1X PBSに溶解し、ドラフトの下で沸騰させます。冷ましてアリコートし、-20°Cで保存します。解凍後は再凍結して使用しないでください。</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td>蒸留水で希釈して1Xストック</td></tr>を作る <tr><td>Tween-20ストック</td>を作る <td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td>蒸留水で希釈して0.1%Tween-20ストックを作る。</td></tr><tr><td>1X リン酸緩衝生理食塩水、0.1% Tween 20 (PBST)</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>0.1% Tween-20 in 1X PBS</td></tr><tr><td>メタノール (MeOH)</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>ロシュ</td><td>3115879001</td><td>蒸留水に溶解して 10 mg/mL ストックを調製します。分注して -20> で保存します。C</td></tr><tr><td>平底微量遠心チューブ</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>アメリカンバイオアナリシス</td><td></td><td>AB00600-20°Cで保存;C</td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーション溶液 (HYB+)</td><td></td><td></td><td>50% ホルムアミド、5X SSC、0.1% Tween-20、5 mg/mL 酵母トルラ RNA、50 &mu;g/&mu;Lヘパリン;-20°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーション オーブン</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>13-247-10Q</td><td></td></tr><tr><td>20X 生理食塩水 - クエン酸ナトリウム (SSC) 緩衝液</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td>蒸留水で希釈して 2X および 0.2X ストック</td></tr>を作る <tr><td>ブロッキング試薬溶液</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td>マレイン酸緩衝液で希釈して 10% ストック溶液を作る; 4°Cで保存;C</td></tr><tr><td>マレイン酸緩衝液</td><td>Sigma</td><td>M0375およびS7653</td><td>150mMマレイン酸、100mM NaCl(pH 7.5)</td></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニン-POD、Fabフラグメント</td><td>Roche</td><td>11207739910</td><td>4°Cで保存。C</td></tr><tr><td>Cy3蛍光染色液</td><td>パーキンエルマー社</td><td>NEL744001KT、TSA Plus Cyanin3システムは</td><td>4°Cで保管されています。C;TSA試薬(DMSOの60uLに溶解)を1:50希釈して、過</td></tr><tr><td>酸化水素(H2O2)</td><td>Sigma</td><td>H1009-500mL</td>を<td>4°Cで保存して、染色液を新鮮に調製します。C</td></tr><tr><td>分子グレードの蒸留水(ddH2O)</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>アメリカンバイオアナリティカル</td><td>AB00636-01000</td>は<td>-20°Cでアリコートを保管します。C</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435-01000</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10438-034</td><td>アリコート -20&deg;C</td></tr><tr><td>モノクローナル抗アセチル化チューブリンクローン6-11B-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td>分量および-20°Cで保存します。ウサギ</td></tr>の<tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5192</td>アリコート<td>で産生されたC抗γ-チューブリンアンチボディ</td><td>は、-20°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>odf3b cDNAクローンMGC:63985</td><td>OpenBiosystems</td><td>IMAGE:6792478</td><td>は-80°Cで細菌のグリセロールストックを保存します。C</td></tr><tr><td></td><td>NaCLアメリカのバイオアナリティカル</td><td>AB01915-05000</td><td></td></tr><tr><td>アレクサ粉647ヤギ抗ウサギIgG</td><td>ライフ</td><td>テクノロジーA2124545454545454545454545454545454545454545454540</td><td>日で4&degで。C;光から保護</td></tr>する <tr><td>アレクサフルーア488ヤギ抗マウスIgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>4&degで店;C;光から保護する</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ D1306</td><td>アリコートと-20°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18×18mm</td></tr><tr><td>細鉗子</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Tweezers Pattern #55</td></tr><tr><td>封入剤</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18606、アクアポリ/マウント</td><td>ストア4&deg;C</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡および関連ソフトウェア</td><td></td><td></td><td>Nikon C2plus 共焦点顕微鏡と NIS-elements AR</td></tr><tr><td>ソフトウェアロッカー</td><td>Bio-Rad</td><td>1660710EDU</td><td></td></tr> を使用しています</tbody></table>

全体のマウント蛍光in situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける multiciliated の細胞を可視化します。

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

近年、ゼブラフィッシュ胚は胚子宮 exと光透過性などの特徴により発生生物学を研究する人気モデルとして登場しました。特に、ゼブラフィッシュ胚研究 multiciliated 細胞 (MCC) の開発と同様に、脊椎動物の腎臓器官形成に重要な生物になりました。ゼブラフィッシュ胚性腎センターを視覚化するには、我々 は蛍光その場全体マウント交配 (魚) の複合的なプロトコルを開発しているし、全体高分解能イメージングを可能にする蛍光抗体法 (IF) をマウントします。本稿では、共同様々 な系統の因子の発現を通じて発達プログラムの制御を理解するツールとして RNA 転写産物やタンパク質をローカライズするための手法について説明します。

野生型ゼブラフィッシュ胚が 24 で固定した hpf と前述のようにすぐに準備します。図 1は、選択したイラスト段階に沿って実験ワークフローを示しています。1-8 の手順に従ってワークフローにはサンプル調達、固定、およびアンチセンス riboprobes 続いて興味のラベル蛋白への蛍光抗体法と内因性のトラン スクリプトにラベルを付ける固定組織の操作のプロセスが含まれます。ワークフローのステップ 9 は、取り付けとイメージング ゼブラフィッシュ胚性幹の可視化を最適化するために特別に設計された技術を指します。ステップ 9 に付随する図面では、スライド ガラス上の組織を配置するための操作方法を示しています。このステップでスライド ガラスと coverslip の間に配置される横尾を残して胚の頭と卵黄のボールは削除されます。卵黄のボール自動蛍光を発するし、実装プロセスを妨害、pronephros の MCC 住民の最高のイメージング卵黄のボールとヘッドの取り外しが示唆されました。
図 2を示しています 60 倍の倍率で同じ野生型胚と同じ倍率でデジタル ズームは、共焦点顕微鏡を用いた代表的な像を提供しています。下の 2 つのパネルはこれらの画像データの複合のオーバーレイ、上部パネルは、個々 のチャンネルのイメージを提供します。(左列のイメージ) の白いボックスは、デジタル ズーム (右列の画像) のフォーカスとなっている区域をについて説明します。デジタル ズームの最後のパネルで強調表示, 核を DAPI でラベル付けしたそして Mcc は、 odf3b γ-チューブリン抗体を示す基底の体、α-チューブリンを示します繊毛を認識するように設計されたアンチセンス riboprobe に基づいて検出されました。複合のオーバーレイのデジタル ズーム、黄色の破線の円は、 odf3bの成績証明書、複数の基底ボディと繊毛の所持のため検出されたクライアント センターの境界を示します。単一の体温と単一の繊毛を有するの表現型に基づく黄色点線の円が付いた、隣接のモノラル繊毛細胞が確認されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig1.jpg"> 図 1: 実験フローチャートのスケマティック。これは雪が冷たいインキュベーションをことを示しますの重要な段階のイラストが伴う実験ワークフローのフローチャートに示します、3 本の曲線を表す熱、および時計は長いインキュベーション時間を表します。プロトコルで説明したように、長い時間の期間にわたっていくつかの手順を実行できますが、6 日間 (プロセスの各ステージの右上隅に番号を参照)、最低でワークフローを実行できます。実装プロセスの詳細な描写は、スライド ガラスと coverslip の最終的なマウントされた胚の尾を示す、描画されます。黒破線のボックスは、60 倍の倍率で撮影である区域をについて説明します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig2.jpg"> 図 2: ゼブラフィッシュ pronephros の MCCs を可視化結果を代表します。イメージの最大投影倍率と同じ胚の 60 倍の倍率で共にデジタル ズーム X 60 24 hpf 野生型ゼブラフィッシュ胚の。白いボックスは、ズームの焦点領域を示します。DAPI (核)、 odf3b (MCCs)、γ-チューブリン (基底ボディ)、α-チューブリン (繊毛) の個々 の汚れは貼付し、下の二つのパネルにマージされます。デジタル ズームで我々 は次のようにセルの位置の近似を提供: 黄色破線の円によってクライアント センターを囲まれ、黄色点線の丸モノ繊毛細胞の概要を説明します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

繊毛の開発は適切な器官形成に不可欠です。このプロトコルでは、ラベルを付けると、ゼブラフィッシュの繊毛細胞を可視化する最適化されたメソッドについて説明します。

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

このプロトコルの目的は、ゼブラフィッシュの多繊毛細胞をin situで標識し、可視化することです。本手法は、胚期のゼブラフィッシュの腎臓においてどのような因子が多繊毛細胞を調節しているかなど、発生生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、タンパク質とRNA転写物を同時に標識できることであり、ゼブラフィッシュ特異的な抗体が存在しない場合に有用です。この手法のアイデアは、胚に改変を加えた後の繊毛の存在を解析する際、前腎の多繊毛細胞を標識しようとした時に最初に得られたものです。まず、受精後24時間のゼブラフィッシュ胚を、4%パラホルムアルデヒド5 mL中で、室温にて静置した状態で2〜4時間固定します。次に、0.1% Tween 20含有PBS（PBST）で胚を2回洗浄し、続いて100%メタノール5 mLで1回洗浄します。次に、胚を5 mLの新鮮な100%エタノールに入れ、-20 °Cで20分以上インキュベートします。ハイブリダイゼーションに向けて胚を準備するため、新生仔を5 mLの50%メタノールおよびPBSTで5分間、続いて5 mLの30%メタノールおよびPBSTで5分間再水和させます。胚を5 mLのPBSTで5分間ずつ2回洗浄し、1:1,000に希釈したproteinase KおよびPBST溶液5 mL中で2分間インキュベートした後、すぐに5 mLのPBSTでさらに2回洗浄します。胚を5 mLの4%パラホルムアルデヒドで室温にて20分以上固定し、続いて5 mLのPBST 20で2回洗浄します。胚とハイブリダイゼーション溶液の相互作用を促進するため、マイクロ遠心チューブラック内の直立した平底マイクロ遠心チューブに胚を5 mLのPBSTとともに移し、1.5 mLのハイブリダイゼーション溶液で5分間ずつ2回洗浄します。2回目の洗浄後、胚を1.5 mLの新鮮なハイブリダイゼーション溶液に入れ、ハイブリダイゼーションオーブンを用いて70 °Cで4〜6時間インキュベートします。次に、ハイブリダイゼーション溶液を、目的のRNAプローブ 10 µLとハイブリダイゼーション溶液 500 µLに置換し、70 °Cで一晩プローブハイブリダイゼーションを行います。翌朝、胚を50% フォルムアミドおよび2X 塩類-クエン酸ナトリウム緩衝液（SSC） 1.5 mLで、70 °Cにて1回あたり20〜30分間、2回洗浄します。その後、胚を2X SSC 1.5 mLのみで70 °Cにて15分間1回洗浄し、続いて0.2X SSC 1.5 mLで70 °Cにて1回あたり20〜30分間、2回洗浄します。2回目の洗浄後、0.2X SSCを1.5 millilitersのブロッキング試薬に交換し、4 °Cで一晩インキュベートします。翌朝、ブロッキング試薬を、1:1,000の比率で希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗ジゴキシンおよびブロッキング試薬0.2 millilitersに交換し、遮光条件下、室温で3時間インキュベートします。その後、胚を1.5 millilitersのマロン酸緩衝液で1回につき10〜15分間、2〜4回洗浄し、続いて新鮮な1.5 millilitersのマロン酸緩衝液中で4 °Cで一晩インキュベートします。翌朝、リンゴ酸緩衝液を1.5 millilitersのPBSに交換し、1.5 millilitersのPBSで胚を2回、各5分間洗浄します。胚を0.2 millilitersのSi3蛍光染色液中で60分間インキュベートした後、濃度を上げたメタノール1.5 millilitersを用いて、10分間の洗浄を4回連続で行います。最後のインキュベーション後、1%過酸化水素およびメタノール1.5 milliliters中で、胚を室温で30分間インキュベートします。次に、1.5 mLの段階的なメタノール溶液で1回10分間ずつ胚を洗浄し、続いて1.5 mLのPBSで5分間の洗浄を2回行います。次に、1.5 mLの二回蒸留水で5分間胚を洗浄し、続いて-20 °Cの1.5 mLのアセトンで7分間洗浄します。さらに、別の1.5 mLの二回蒸留水で5分間胚を洗浄し、最後に1% DMSOを含む1.5 mLのPBSTまたはPBDTで5分間洗浄します。胚を10% FBSを含むPBDT 1.5 mL中で、ロッカを用いて室温で2時間インキュベートします。その後、PBDTおよびFBSを一次抗体 1.5 mLに交換し、4 °Cで一晩インキュベートします。翌朝、胚をPBDT、FBS、および0.1 M 塩化ナトリウムを含む 1.5 mLの溶液中で1分間ロッキングしながら洗浄し、続いてPBDT、FBS、および塩化ナトリウムを含む 1.5 mLの溶液中で30分間のロッキング洗浄を5回行います。最後の洗浄後、胚を1.5 millilitersのPBDTおよびFBSで、ロッキングしながら30分間1回洗浄し、続いて適切な二次抗体200 microliters中で、遮光した状態で4 degrees Celsiusにて一晩インキュベートします。翌朝、胚を1.5 millilitersのPBDTで迅速に2回洗浄し、続いて1.5 millilitersのDAPI中でロッカーを用いて15分間インキュベートします。その後、胚をFBSおよび塩化ナトリウムを含む1.5 millilitersのPBDTで、1回につき15〜20分間、計3回洗浄し、胚を1.5 millilitersのPBDT中で、周囲の光を遮断して4 degrees Celsiusで保存します。ゼブラフィッシュの腎臓をイメージングするために、胚を約10 µLのPBDTを入れたガラススライド上に側方から置きます。精密ピンセットと解剖顕微鏡を用い、1匹目の胚の目の後ろ側を挟んで、頭部と卵黄嚢の一部を除去します。次に、胚の体から残りの卵黄嚢を注意深く掻き出します。卵黄球を除去する際は、目的の組織が破れやすく、卵黄嚢の伸展部の直上に位置しているため、伸展部に触れないよう注意してください。薄い組織片を用いて、解離した卵黄と余分な液体をスライドから除去します。その後、残った尾に封入剤を1滴加え、尾を側方に配置します。カバーガラスで尾部を平らにし、スライドをカバー付きのスライドボックスに入れます。次に、共焦点顕微鏡の60倍対物レンズを使用し、適切な蛍光チャンネルで腎臓の繊毛を撮影します。上述の手法で染色したゼブラフィッシュ胚の代表的な画像において、ODF3B転写物の発現を認識するために使用したアンチセンスリボプローブ、γ-tubulinで標識された基底小体、およびアセチル化α-tubulinで標識された繊毛の可視化に基づき、多繊毛細胞を特定できます。実際に、胚原腎をこの倍率で観察すると、ODF3B転写産物、複数の基底小体、および繊毛を持つ多繊毛細胞を確認できます。隣接する単繊毛細胞は、単一の基底小体と単一の繊毛という表現型によって区別可能です。この手順を行う際は、固定したばかりの新鮮な胚を使用すること、および一次抗体を添加した後は検体を室光から遮光して保存することを忘れないでください。

visualizing-multiciliated-cells-zebrafish-through-combined-protocol

Research

JoVE Journal

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in situハイブリダイゼーション全体のマウントは、発生生物学で最も広く使用されている技術の一つです。ここで、我々は、単一の遺伝子の正確な発現パターンを解析するためと、二つの遺伝子の発現領域の重なりを判定するためのin...

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の生体内で個々の神経細胞や神経堤細胞のイメージングを説明します。このメソッドは、蛍光共焦点タイムラプス顕微鏡を使用して細胞の行動とアクチンの局在を調べるために使用されます。...

細胞運動やゼブラフィッシュ胚における個々の神経細胞と神経堤細胞のアクチン細胞骨格のライブイメージング

初期胚を形成する形態形成のプロセスを理解するための鍵は、高解像度での画像セルにできることです。ここでは、細胞膜をターゲットとする緑色蛍光タンパク質で全体のゼブラフィッシュの胚では細胞の単一細胞または小さなクラスターを標識するためのテクニックを説明します。...

ゼブラフィッシュ後脳における標識およびイメージング細胞

ここで説明するには、ゼブラフィッシュ胚における組織特異的な蛍光の半自動イメージングのためのプロトコルです。...

ゼブラフィッシュ胚における組織特異的蛍光の半自動イメージング

&gt;jove_content&lt;細胞小器官や他の細胞内構造の動的挙動をin...

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

技術は全体のゼブラフィッシュ胚におけるホスホ - エピトープを免疫染色した後、一次繊毛のように小さな細胞構造の二色の蛍光共焦点の局在化を行うことが記載されています。固定およびイメージングのための技術は、特定のタンパク質の出現または活性化の位置と速度を定義することができます。...

ホールマウントゼブラフィッシュ胚の繊毛器官におけるリン酸化エピトープを免疫染色

このプロトコルは、初期のゼブラフィッシュ胚からの凍結切片に対する順次免疫蛍光および免疫組織化学を示し、特定の細胞集団における正確なコローカリゼーション分析を可能にする。...

凍結切除ゼブラフィッシュ胚に対する順次免疫蛍光と免疫組織化学

ここでは、ゼブラフィッシュ胚および幼虫の全製剤におけるタンパク質の蛍光抗体媒介検出に関するプロトコルを提示する。...

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚切片の in situ ハイブリダイゼーションと免疫組織化学を組み合わせて画像を取得する方法について説明します。凍結切片の前に in situ...

その場で 凍結切片ゼブラフィッシュ胚における免疫組織化学と組み合わせたハイブリダイゼーション

学ぶ ゼブラフィッシュの多繊毛細胞可視化法。蛍光in situハイブリダイゼーションと免疫組織化学を組み合わせ、Danio rerioの胚腎における繊毛発生と器官形成のメカニズム解明に貢献します。

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

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