全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

このプロトコルの全体的な目標は、ゼブラフィッシュの多繊毛細胞をその場で標識し、可視化することです。この方法は、ゼブラフィッシュの胚性腎臓における多繊毛硫酸塩を調節する要因は何かなど、発生生物学分野の重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、タンパク質とRNAの両方の転写物を同時に標識できることであり、これはゼブラフィッシュ特異的抗体がない場合に有用です。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、胚に変更を加えた後の繊毛の存在を分析しながら、前腎の多繊毛細胞を標識したときでした。まず、受精後24時間でゼブラフィッシュの胚を5ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドに室温で2〜4時間固定します。次に、胚をPBSで0.1%Tween 20またはPBSTで2回洗浄し、続いて5ミリリットルの100%メタノールで1回洗浄します。

次に、胚を5ミリリットルの新鮮な100%エタノールでマイナス20°Cで少なくとも20分間インキュベートします。ハイブリダイゼーションのための胚を準備するために、新生児を5ミリリットルの50%メタノールとPBSTで5分間再水和し、続いて5ミリリットルの30%メタノールとPBSTで5分間水分補給します。胚を5ミリリットルのPBSTでそれぞれ5分間2回洗浄し、胚を5ミリリットルの1対1,000プロテイナーゼKおよびPBST溶液で2分間インキュベートし、その後すぐに5ミリリットルのPBSTでさらに2回洗浄します。

胚を5ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドで室温で少なくとも20分間固定し、続いて5ミリリットルのPBST 20で2回洗浄します。胚とハイブリダイゼーション溶液との間の相互作用を容易にするために、マイクロ遠心分離ラック内の直立平底マイクロ遠心チューブで胚を5ミリリットルのPBSTに移し、1.5ミリリットルのハイブリダイゼーション溶液で胚をそれぞれ5分間2回洗浄します。2回目の洗浄後、胚を1.5ミリリットルの新鮮なハイブリダイゼーション溶液で摂氏70度のハイブリダイゼーションオーブンで4〜6時間インキュベートします。

次に、ハイブリダイゼーション溶液を目的のRNAプローブ10マイクロリットルおよびハイブリダイゼーション溶液500マイクロリットルと交換して、摂氏70度で一晩プローブハイブリダイゼーションを行います。翌朝、胚を1.5ミリリットルの50%ホルムアミドと2X生理食塩水-クエン酸ナトリウム緩衝液またはSSCで2回、摂氏70度で1回の洗浄につき20〜30分間洗浄します。次に、胚を1.5ミリリットルの2X SSCのみで70°Cで15分間1回洗浄し、続いて1.5ミリリットルの0.2X SSCを70°Cで20〜30分間1回の洗浄で2回洗浄します。

2回目の洗浄後、0.2X SSCを1.5 mLのブロッキング試薬と交換し、摂氏4度で一晩インキュベーションします。翌朝、ブロッキング試薬を西洋ワサビペルオキシダーゼ中の0.2ミリリットルの抗ジゴキシンとブロッキング試薬を1対1、000の比率で交換し、光から保護された室温で3時間インキュベーションします。次に、1回の洗浄につき10〜15分間、1.5ミリリットルのリンゴ酸緩衝液で胚を2〜4回洗浄し、続いて1.5ミリリットルの新鮮なリンゴ酸緩衝液で摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌朝、リンゴ酸緩衝液を1.5ミリリットルのPBSと交換し、1回の洗浄で5分間、1.5ミリリットルのPBSで胚を2回洗浄します。胚を0.2ミリリットルのSi3蛍光静置溶液で60分間インキュベートした後、1.5ミリリットルの漸増メタノール濃度で10分間連続して4回洗浄します。最後のインキュベーション後、胚を室温で1.5ミリリットルの1%過酸化水素とメタノールで30分間インキュベートします。

次に、胚を1.5ミリリットルの下降メタノール溶液で1回の洗浄ごとに10分間洗浄し、続いて1.5ミリリットルのPBSで5分間を2回洗浄します。次に、胚を1.5ミリリットルの二重蒸留水で5分間洗浄し、続いてマイナス20°Cのアセトン1.5ミリリットルで7分間洗浄します。胚をさらに1.5ミリリットルの二重蒸留水で5分間洗浄し、続いて1.5ミリリットルのPBSTを1%DMSOまたはPBDTで5分間洗浄します。

胚を1.5ミリリットルのPBDTに室温で10%FBS入りロッカーで2時間インキュベートします。次に、PBDTとFBSを1.5ミリリットルの一次抗体と交換し、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌朝、胚を1.5ミリリットルのPBDT、FBS、および0.1モルの塩化ナトリウムで1分間ロッキングしながら洗浄し、続いて1.5ミリリットルのPBDT、FBS、および塩化ナトリウムで30分間のロッキング洗浄を5回行います。

最後の洗浄後、胚を1.5ミリリットルのPBDTおよびFBSで1回30分間だけ洗浄し、ロッキングを行い、その後、200マイクロリットルの適切な二次抗体で4°Cで光から保護された状態で一晩インキュベートします。翌朝、胚を1.5ミリリットルのPBDTで2回すばやく洗浄し、続いてロッカーで1.5ミリリットルのDAPIで15分間インキュベートします。次に、胚を1.5ミリリットルのPBDTでFBSと塩化ナトリウムで1回の洗浄ごとに15〜20分間3回洗浄し、周囲光から保護する摂氏4度のPBDT1.5ミリリットルに胚を保存します。

ゼブラフィッシュの腎臓を画像化するには、胚を約10マイクロリットルのPBDTでスライドガラス上に横向きに置きます。一対の細い鉗子と解剖顕微鏡を使用して、目の後ろの最初の胚を絞って、頭と卵黄球の一部を取り除きます。次に、胚体から残っている卵黄球をそっとこすり落とします。

卵黄ボールを取り外すときは、目的の組織が簡単に裂け、エクステンションの真上にあるため、卵黄嚢エクステンションに触れないように注意してください。薄いティッシュを使用して、解離した卵黄と余分な液体をスライドから取り除きます。次に、残りのテールにマウント媒体をドロップし、テールを横方向に配置します。

カバースリップでテールを平らにし、スライドをカバー付きのスライドボックスに入れます。次に、共焦点顕微鏡で60倍対物レンズを使用し、適切な蛍光チャンネルで腎臓の繊毛をイメージングします。以下のゼブラフィッシュ胚の代表的な画像では、ODF3B転写産物の発現を認識するために用いられたアンチセンスリボプローブ、配偶子チューブリン標識基底体、アセチル化αチューブリン標識繊毛の可視化により、多繊毛細胞を同定することができます。

実際、この胚性プロネフロスの拡大では、ODF3B転写産物、複数の基底体、および繊毛を持つ多繊毛細胞を観察できます。隣接する単繊毛細胞は、その単一の基底体および単一の繊毛表現型によって区別することができる。この手順を試みる際には、新たに固定された胚を使用し、最初の抗体を添加した後は標本を周囲光から保護することを忘れないでください。