合成タンパク質の最適化：中間物挿入依存関係の同定構造的インジケートおよび/または機能的に連結された残基

本手順の全体的な目的は、タンパク質アライメントにおいて、部位間依存性（interpositional dependencies：IPD）を示唆する共進化残基を特定することです。これは、まずアライメントをStick Worldに読み込むことで達成されます。Stick Worldは、タンパク質アライメントのインタラクティブな3D表現を作成し、共変動する残基を明確に表示する視覚的分析ツールです。アライメントの各ポジションは、球体のスタックからなる列として表現されます。各列には、そのポジションにおけるアライメント内で可能な20種類のアミノ酸に対応する球体が1つずつ配置され、そのサイズは出現頻度に応じて決定されます。また、各ポジションを表す列はシリンダー状に巻き付けられ、IPDが表現されます。

残基間の共進化が、プログラム内でそれらの位置にある残基が依存している場合に予想されるよりも高く、あるいは低くなっている場合に、それらの間に線が引かれます。エッジの数が管理可能な数になるまで残差を調整し、その後、関心のあるエッジを特定します。最終的に、Stick Worldを用いて、互いに共進化している残基を特定します。

このような機能的に必要とされるコービング残基が、ベンチレートキナーゼにおいて同定されています。多くの人々がこのプロセスに苦労する理由の一つは、その斬新さにあります。これは科学であると同時に、ほとんど芸術に近い側面を持っています。

Stick Worldはビジュアル分析ツールであり、ユーザーのインタラクションを必要とするため、視覚的に実演することが重要です。Intel Core i5以上のプロセッサ、4GB以上のRAMを搭載し、Mac OS 10またはLinux OSで動作し、テキストプロトコルに記載されているPythonライブラリがインストールされたコンピュータを使用してください。すべての関連Pythonスクリプトを含むzipアーカイブとしてStick Worldをダウンロードします。

また、標準的なFASTA形式のDNAおよびタンパク質配列アラインメントをスティックワールド形式に変換するための「FASTA two stick」スクリプトをダウンロードしてください。アーカイブを解凍し、作成されたスティックワールドフォルダと「FASTA two stick」スクリプトをデスクトップに配置します。次に、任意の標準的なアラインメントソフトを使用して、タンパク質配列のアラインメントを作成してください。

アライメントをデスクトップに保存します。形式を指定してください。Linuxコンピュータのターミナルアプリケーションを開き、ターミナルに「cd ~/Desktop」と入力してReturnキーを押し、デスクトップに移動します。

FASTA two stickスクリプトを実行可能にするためのコマンドを入力し、次にスクリプトを実行するためのコマンドを入力してください。スクリプトによって表示される画面上の指示に従い、入力ファイル名と希望の出力ファイル名を指定します。出力ファイルはデスクトップに保存してください。

MacまたはLinuxコンピュータのターミナルアプリケーションを使用して、stick worldの実行ファイルフォルダに移動します。ターミナルにPython -32 stick world demo PIと入力して、stick worldを起動してください。画面上にstick worldのデータローダーパネルが表示されていることを確認します。次に、load proteinボタンを押して、変換済みのタンパク質配列アライメントをロードします。

作成したファイルを選択して「開く」を押すと、Stick World ControlやStick World OpenGLを含むいくつかの新しいウィンドウが開きます。Stick World OpenGLウィンドウを選択してください。OpenGLメニューから「Reset View」を選択すると、シリンダーを通したトップダウンビューでデフォルトのStick World可視化が表示され、リサイズ可能なOpenGLウィンドウにデータが表示されます。

stick worldにはいくつかの表示オプションがあります。stick worldコントロールパネルの列ラベルとボールラベルのチェックボックスを選択すると、列とボールの値が表示されます。列エッジのチェックボックスの選択を解除すると、列エッジの線が非表示になります。

スティックワールドのコントロールペインでカラムの太さを0.1に設定し、カラムを通して細い線を描画します。3Dビューでの操作性を向上させるため、Returnキーを押して変更を確定させます。スティックワールドのOpenGLウィンドウでビューをリセットします。

次に、全画面ボタンを押して表示を最大化し、プログラム内を操作します。マウスの左ボタンを押し続けながらマウスを任意の方向に動かすことで、3Dスティックワールド表示を回転させることができます。マウスの右ボタンを押し続けながらマウスを上下に動かすことで、3Dスティックワールド表示をズームできます。

パンおよびズーム操作でビューを閲覧してください。p値とresidualの両方の閾値要件を超える共進化残基は、エッジ線で接続されます。残基を接続するエッジが多すぎるか、または少なすぎる場合は、residualの閾値を変更して表示されるエッジの数を調整してください。stick worldコントロールパネルでresidualの閾値を上げ、IPDエッジ線が表示されなくなるまで調整した後、関係性が現れるまでゆっくりと下げてください。その後、調査に十分な数の関係性が表示されるまで、residualの値をさらに調整してください。

Commandキーを押しながら左クリックし、関心のある残基、またはアラインメント内で互いに離れた位置にある残基を含む関係性を特定して、任意のエッジを選択します。スティックワールド制御ペインに列が表示され、特定の残基が接続されます。実線は正の相関を表します。

一方、破線は負の相関を示しています。Stick Worldコントロールパネルの「output edges」ボタンを押すと、結合残基とその実際の残基値を含む、表示されているすべてのエッジのプレーンテキスト形式ファイルが適切なディレクトリに保存されます。前景には、132番目のglycine、135番目のtyrosine、および141番目のprolineの3つのノードによる相関を含む、大きなクラスターの相互位置依存性（IPD）が確認できます。

ここでは、ユーザーがシリンダーのわずか上方に位置するように視点を傾けており、位置1のhistamineと、107残基離れた位置29のmethionineの間のIPDが示されています。対照的に、同一ドメイン由来のA-P-A-M-H-M-Mモチーフでは、これらを特異的に共起するモチーフ変異として検出せず、また生物学的に根拠のないスキームで全体的なグループ分けを定義します。この手順を行う際は、2つの異なる方法で試みることを忘れないでください。

高い残差から始めて段階的に下げていくか、あるいは低い残差から始めて段階的に上げていくことで、2つの異なる方法で空間を探索することができます。