Name: 出芽酵母のタンパク質濃度の関数としての形態学的表現型の開発の分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-24T16:05:00.000+00:00
Duration: 15 min 2 s
Description: 学ぶ出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeにおけるタンパク質濃度依存の形態学的表現型発現解析プロトコル。調節可能なプロモーターを用いた制御発現により、個体群・単細胞レベルで表現型を詳細に解析する方法を解説。

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我々は有用な議論とサポートのためにブライアンG.クーンとクラウディアB.ハンナに感謝。このプロジェクトは出発から立ち上げ資金によってサポートされていました。生物科学、R.クラウディオアギラとパーデュー大学がんセンター経由R.クラウディオアギラに米国癌学会機関の研究助成にパデュー大学。

A.細胞培養やタンパク質誘導このセクションでは、酵母細胞内の調節可能なプロモーターからタンパク質の発現誘導に続いて細胞の培養条件、ノコダゾールによる細胞周期の同期を、説明します。 <ol><li>野生型の酵母株W303（LEU2 - 3、112 TRP1 - 1 CAN1 - 100 URA3 - 1 ADE2 - 1 HIS3 - 11、15）の制御下に興味のある私たちの遺伝子を含む高コピー（2μ）プラスミドDNA（ENTH2）で形質転換されメチオニン抑制性プロモーター（MET25）の。メチオニン欠く培地では最大発現を可能にしながらメチオニン2mMのは、プロモーター活性を抑制するのに十分です。したがって、メチオニン濃度の範囲は、所望のレベルでタンパク質を発現するために使用することができます。 W303細胞におけるプラスミドDNAの1トランスフォーメーションは、標準の手順に従ってLiAc - TE法を用いて行われる2。 注：この実験は唯一のバックグラウンドレベルでのタンパク質発現を確保するためにメチオニン2mmの存在下で一晩細胞を増殖させることによって実行する必要があります。翌朝、蛋白質の発現は、メチオニン直後に細胞周期の同期（約4時間）を欠く培地で細胞を再懸濁することにより誘発されるべきである。しかし、我々は、すべての症状の分析のために時間のコースを作り、ENTH2依存性の細胞分裂の表現型が（通常、タンパク質の誘導3の4 - 6H後）ENTH2のかなりの濃度が細胞内に構築された後にのみ誘導されることを見出した（少なくとも16時間）が非常に長い表現。我々は、メチオニン0.2の存在下で一晩細胞を増殖する形態学的表現型を抑制するがメチオニン不足してメディアに転送するときに急速に表現型を誘発するレベルに高めることができる亜臨界タンパク濃度を可能にすることを見出した。これは時間の比較的短い期間での細胞分裂の欠陥の深刻な症状の詳細な分析を可能にします。我々は、それ故に、実験者は、ケースバイケースでの表現型の誘導のためのサブスレッシュホールドであるメチオニン濃度を決定することをお勧めします。 </li><li>標準的な滅菌技術を使用して滅菌コニカルフラスコ中のメチオニン0.2と選択培地の50mlに最近形質転換細胞と接種を含むプレートから六コロニーを選択してください。 30℃で一晩200 rpmで振とうしながらのCをインキュベートする。（標準的な酵母の培養条件の詳細については、文献4参照） </li><li>翌朝、600nmの時の文化の光学密度を測定することにより見積もりの​​細胞密度。室温で5分間に2200 rpmで回転することによって滅菌遠心管と収穫に細胞の20 OD 600nmのに相当するものを転送する。 </li><li>に再懸濁し、細胞は0.4 OD 600nmの / mlの濃度でYPDとDMSOの1mg/mlのストックからの15μg/mlの最終濃度にノコダゾールを追加。 200rpmで振盪しながら30℃で4時間インキュベートする。 注：α- factorを使ってG0期でまたはヒドロキシウレアを使用してG1 - S期で停止を含む代替逮捕の方法を使用することができる。我々は、ノコダゾールを使用して有糸分裂で逮捕はシンプルで私たちの目的のために十分有効であることを見出した。 </li><li> 4時間後、顕微鏡下に表示することによって、同じサイズの芽を持つ細胞の数をカウントすることによって有糸分裂で逮捕された細胞の割合を確認してください。逮捕が90％を超える場合は、以下の手順に進みます。有糸分裂停止の希望する割合が達成されるまでそれ以外の場合、ノコダゾールで細胞を維持する。 </li><li> 5分2200 rpmで遠心分離によって細胞を回収し、氷冷水で3回洗浄する。最終洗浄後、〜0.5 OD 600nmの / mlの細胞密度でメチオニンを欠く選択培地でペレットを再懸濁します。新しい滅菌チューブに細胞の半分の量を転送し、最終的な0.2mmの濃度にメチオニン追加。これは、タンパク質発現の基底レベルによる影響のためのコントロールとして機能します。これは、実験の最初の時間ポイント（時間= 0H）をマークします。細胞を6時間毎時間を分析する。 </li></ol>表現型の開発のB.解析 注：以下で説明するすべての分析手法を同時に実行する必要はありません。 ウェスタンブロッティングによりタンパク質の発現レベルの決定<ol><li>毎回ポイントで、5分に2200 rpmで遠心分離による細胞の培養と収穫2 OD 600nmの同等のOD 600nmのを測定する 。 </li><li> 1ミリリットル滅菌水でペレットを再懸濁し、1.5ミリリットルのエッペンドルフチュー​​ブに懸濁液を移す。ペレットを得るために遠心操作を繰り返します。上清を吸引除去する。 </li><li> 50μlのSDS - PAGE Laemmliサンプル緩衝液（50mMトリスpH6.8で、2％SDS、10％グリセロール、2％β-メルカプトエタノールと0.006％ブロモフェノールブルー）でペレットを再懸濁する。酸洗浄ガラスビーズ（0.2から0.4ミクロンの直径）と1分間ボルテックス50μlのを追加。 </li><li> 95℃熱BLO上でチューブを沸かし2分のためのCK、30秒のため、再度ボルテックスし、5分間煮沸再開。 -20℃でタンパク質試料を凍結</li><li> 、12％SDS - PAGEゲル上でタンパク質サンプルを実行するニトロセルロース膜に転写し、目的のタンパク質を検出するために適切な抗体を用いたウェスタンブロッティング行います。この例では、我々はBlotto中- Tweenでの1:2000希釈（1XPBS、5％脱脂粉乳でマウス抗HA抗体（Covance、プリンストン、NJ）でインキュベートすることにより、ENTHドメインをタグ付けヘマグルチニン（HA）の存在を探る、0.1％のTween）。またBlotto中 - トゥイーンで、1:2500の希釈でヤギ抗マウス二次抗体（Pierce）をタグ付きHRPは、室温で1時間のための膜に一次抗体を結合させています。 Supersignalウエストのピコ化学発光基質は、HRPタグ付けされた抗マウス抗体を検出するために使用されます。 </li><li>デンシトメトリーによるタンパク質の発現レベルを定量化する。 </li></ol>このセクションでは、増加するタンパク質濃度の関数として追跡する表現型の開発の2つの方法について説明します。最初のメソッドは、単一細胞のレベルの第2の研究にしながら、細胞集団に基づいています。 細胞分裂の表現型と細胞死の定量化<ol><li>各タイムポイントで、5分に2200 rpmで遠心分離によって滅菌技術と収穫の細胞を用いて滅菌エッペンドルフチュー​​ブに1ミリリットルの細胞懸濁液を移す。 </li><li>上清を吸引除去し、滅菌水で1mg/mlのストックから、ブルー30μlのメチレンブルー続いて70μlのメディアでペレットを、懸濁します。メチレンブルーは、従って死んだ細胞は、その青い色で識別可能な細胞質ゾルの還元性環境で無色になる青生体染色色素である。 </li><li>ピペット〜きれいなガラススライド上にこの懸濁液6μlとドロップを介してカバースリップを配置。ガラスのインターフェイス間で細胞の薄く均一な層を形成するために静かにカバースリップを押してください。 </li><li> 9象限にカバースリップを分割し、図に示すように象限ごとに3の画像を取る。 2。細胞/フィールドの数は、正確な定量を可能にするために30セルよりも大きくすべきではありません。気泡が準備を損傷する前に、各カバースリップは、約15分間撮像することができます。 </li><li>研究対象の表現型を示す細胞の数を数えます。 ENTH2過剰発現により誘導される細胞分裂の欠陥は、細胞死につながる、それゆえ、我々はまた、青の色で識別される死細胞の数を数えます。 </li><li>表現型の細胞の割合を計算する。 </li><li>図に示すようにデータをプロットします。 3。 </li></ol>蛍光顕微鏡を用いて表現型固有の欠陥の可視化としてENTH2過剰発現時に見られる細胞分裂欠陥のある細胞は、しばしば細胞壁の欠陥とセプチンmislocalization3（GFP -融合タンパク質として可視化）によって特徴付けられる。出芽酵母の細胞壁は簡単に酵母細胞壁にキチンに不可逆的に結合するCalcofluorホワイト（CFW）での染色により可視化することができます。 <ol><li>滅菌エッペンドルフチュー​​ブと収穫細胞における文化のたびにポイント、アリコートの1ミリリットルで、室温で5分間2200 rpmで遠心分離によって。 </li><li>暗所で室温で5分間滅菌水とインキュベートで1mg/ml CFWソリューション液100μlに細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>遠心分離によって細胞を回収し、1X PBSで3回洗浄する。 </li><li> 100Xの倍率で100μlの1X PBSでペレットとUV光学系を用いて顕微鏡下での画像（細胞壁）とFITCフィルター（GFP -セプチン）を再懸濁します。 </li><li>セクションB.2.1で、次の手順4-6で細胞壁の欠陥とセプチンmislocalization持つ細胞の割合を定量化</li></ol> B.3。タイムラプスビデオ顕微鏡：単一細胞レベルでの表現型の開発の決定。 <ol><li> 70％アルコールと凹面のうつ病とスライドガラスを清掃し、空気乾燥することができます。 </li><li>アガロースが完全に溶けるまで電子レンジで滅菌ガラスチューブ内にメチオニンを欠く5ミリリットル選択培地で0.06グラムアガロースを煮る。 </li><li>迅速にピペットスライドうつ病のアガロース含有培地200μlのとそれ以上の別のきれいなガラススライドを反転させ、空気の泡が下敷きにされていないことを確認すること。 </li><li>ゲルが固化するとき、常にその面が平行に保ち、スムーズに離れてうつ病のスライドから上にスライドを移動する。これは、アガロースの床の表面は、うつ病のスライドの表面と同じ高さであることを保証します。繊細な組織でアガロースのベッドを囲むスライド領域を清掃してください。スライドを使用する準備が整いました。 </li><li>時= 4時間、室温で5分間2200 rpmで遠心分離により培養液から滅菌エッペンドルフチュー​​ブと収穫へのセルの転送1ミリリットル。 注：これは、その表現型の開発が保証されているので、時間の点後は、タンパク質発現の高いレベルを確保するために選択することをお勧めします。パイロット実験を決定する際に必要です。ケースバイケースで、電子誘導時間を。 </li><li>メチオニン不足して新鮮な選択培地100μlの上清と再懸細胞を吸引除去する。 </li><li>カバースリップの端にワセリンを塗布。その後、アガロースのベッドの中心に細胞懸濁液のドロップを配置し、静かにその上にカバースリップを押すことによって一様に広がる。 </li><li>ワセリンでカバースリップの端をシールし、マニキュアでのエッジの内側を覆うことによって、その位置を固定。マニキュアが乾くまで待ちます。 </li><li>顕微鏡の加熱ステージ上でスライドを配置し、十分な間隔10以上のセルを含むフィールドを選択してください。細胞が分裂するように、フィールドは、時間の経過とともに混雑してしまいます。 </li><li>フィールドの画像〜5時間、5分ごとにかかります。表現型の進行は、ImageJのソフトウェアを（使ってムービーに画像を組み立てることで調べることができます<a name="cite">Rasband、WS、ImageJは、保健、ベセスダ、メリーランド州、アメリカ、http://rsb.info.nih.gov/ij/、1997年の米国国立研究所-2005</a> ） </li></ol> 注：我々はツァイスAxiovert 200M顕微鏡を使用して、ツァイスAxiocam MRMは、デジタルカメラと生細胞イメージングのためのカールツァイスAxioVisionの画像収集ソフトウエア（バージョン4.4）モノクロ。温度制御は、PeCon Tempcontrol 37デバイスで30℃に維持加熱ステージ上でスライドを配置することによって達成されます。 繰り返しフォーカスを再調整を避けるために、それは自動的にすべての時間の時点でいくつかのZスタック画像を取得し、ムービーを組み立てる際、後で最良の焦点で画像を選択する画像取得ソフトウエアをプログラムするのに便利です。いくつかの画像取得ソフトは、時間経過実験のためのオートフォーカスのオプションがあります。それはときに利用でそのオプションを使用すると便利です。 野生型酵母細胞は、30で最高の成長° Cしたがって、温度制御が重要です。十分な熱を確保するためには、加熱された段階に加えて、熱の外部ソースを提供するために便利です。例えば、我々は、イメージングの全期間に顕微鏡の透過白色光のまま。 また、アガロースのベッドと細胞のサンドイッチを準備する際に気泡を避けるために重要です。気泡内に閉じ込められた空気は、時間をかけて加熱すると膨張し、離れて撮像されてフィールドから細胞をプッシュする傾向がある。 それは、特に再フォーカスの試行中に、そのフィールド内の各セルの位置が画像のプロセスの期間にわたってかなり変更されないようにすることも重要です。映画を組付けた後、ImageJはセルの位置に小さなシフトを是正するための画像安定化プラグインが用意されています。 （ <a href="http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html">http://www.cs.cmu.edu/〜伉儷/コード/ Image_Stabilizer.html</a> ）。

<ol><li>Rönicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+conditional+promoters+for+expression+of+heterologous+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGietz%2C+RD+%22High+efficiency+transformation+with+lithium+acetate+in+Molecular+Genetics+of+Yeast%3A+A+Practical+Approach%22">High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press Inc. New York. 121-134 (1994).</li>
<li>Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+endocytic+protein+Epsin+2+functions+in+a+cell-division+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway.</a> J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).</li>
<li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSherman%2C+F+%22Getting+started+with+yeast+in+Guide+to+Yeats+genetics+and+Molecular+Biology%22">Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology</a>. , Academic Press Inc. San Diego. 3-21 (1991).</li>
</ol>

このプロトコルは、タンパク質の過剰発現時に形態学的表現型（適切な細胞分裂を受けることができない酵母細胞）の開発を監視する方法について説明します。この手順を行うときは、それより速いスピードで細胞や不明瞭な結果を傷める可能性がありますので、推奨遠心速度で沈殿させ、酵母細胞を採取することを忘れないことが重要です。メチレンブルーとCalcofluor白は、それらが有毒であるとしてちょうどイメージングの前に細胞を生きるに追加する必要があります。この手順は、簡単にターゲットを制御可能なプロモーターから発現される提供、蛋白質の抑制の条件下で観察表現型に適合させることができる。

<table><tbody><tr><td>Nocodazole</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>メチレンブルー 1% (w/v)</td><td>試薬</td><td>VWR international</td><td>VW6276-0</td><td></td></tr><tr><td>カルコフルールホワイト</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3543</td><td></td></tr><tr><td> पेट्रोलियमジェリー</td><td>試薬</td><td>VWR international</td><td>VW3339-2</td><td></td></tr></tbody></table>

出芽酵母のタンパク質濃度の関数としての形態学的表現型の開発の分析

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

遺伝子欠失と蛋白質の過剰発現は、タンパク質の機能を研究するための一般的な方法です。この記事では、我々は、人口および単一細胞レベルでのタンパク質の濃度の関数として表現型の開発の分析のためのプロトコルを記述する<em&gt;サッカロマイセスセレビシエ</em&gt;。このプロトコルは、タンパク質の過剰発現に基づいていますが、それは容易にタンパク質発現の抑制に依存する形態学的表現型に適合させることができる。私たちの研究室では、エンドサイトーシスのアダプタータンパク質のepsinのシグナル伝達特性の研究に興味を持っています。その目的のために我々が保存を過剰発現しているドミナントネガティブアプローチを使用<u&gt; E</u&gt; psin<u&gt; N</u&gt; -<u&gt; T</u&gt; erminal<u&gt; H</u内因性epsin - 2（Ent2またはYLR206W）の機能と干渉するために&gt; omology（ENTH）ドメイン。我々は、足場タンパク質、septinsの家族のmislocalizationに依存している細胞分裂の欠陥につながった野生型細胞でEnt2（ENTH2）のENTHドメインの過剰発現を観察した。

遺伝子欠失と蛋白質の過剰発現は、タンパク質の機能を研究するための一般的な方法です。この記事では、我々は、人口および単一細胞レベルでのタンパク質の濃度の関数として表現型の開発の分析のためのプロトコルを記述する<em&gt;サッカロマイセスセレビシエ</em&gt;。

遺伝子欠損およびタンパク質の過剰発現は、タンパク質の機能を研究するための一般的な手法である。本記事では、...の解析のためのプロトコルについて述べる。

このプロトコルでは、タンパク質発現の制御が可能な調節可能プロモーターを利用します。本実験では、メチオニン抑制性プロモーターからN-末端2ドメインを発現させる高コピーの2ミクロン・プラスミドを使用します。野生型酵母細胞にこれを形質転換させます。プラスミドおよび形質転換体は、uolを欠くプレート上で選抜します。選択培地にて一晩培養した後、コルチゾールによる増殖停止を介して細胞を同期させます。最後に、タイムコース実験の間、細胞をメチオニン欠損培地に移すことで発現を誘導します。タンパク質濃度はウェスタンブロッティングで、形態学的表現型の形成は顕微鏡観察でモニタリングします。こんにちは、パデュー大学生物科学科のクラウディアです。私はALラボのde Bari Mujiです。本日は、細胞内におけるタンパク質濃度の関数として形態的表現型の発達を解析する手順について説明します。当研究室では、エンドサイトーシス適応タンパク質absent twoのN末端ドメインを過剰発現させた際に観察される細胞分裂表現型の形態的および分子的な側面を研究するために、この手順を用いています。それでは始めましょう。本プロトコルは、目的タンパク質を発現させる酵母株の作製から始まります。本例では、メチオニン抑制性プロモーターの制御下にnth twoを含む高コピー数プラスミドDNAを、野生型酵母株W 3 0 3に形質転換しました。2 millimolarのメチオニンにより、met 25プロモーターの活性が抑制されます。メチオニン欠乏培地で最大発現が可能となりますが、最近形質転換した細胞を含むプレートから6つのコロニーを選別し、0.2 millimolar メチオニンを含む50 millilitersの選択培地に入れたコニカルフラスコに接種し、翌朝まで30 degrees Celsius、200 RPMの振盪条件下で一晩培養します。600 nanometersにおける培養液の吸光度を測定し、細胞密度を推定します。20 OD 600 nanometers/milliliterに相当する細胞量を滅菌した遠心チューブに移し、遠心分離により回収します。細胞周期を同期させるため、YPD培地中で細胞をボルテックスして再懸濁し、DMSO中の1 mg/mLストック溶液から最終濃度15 µg/mLとなるように調製します。30 °Cで200 RPMで振盪しながら4時間インキュベートします。4時間後、有糸分裂期に停止した細胞の割合を確認します。顕微鏡で観察し、同サイズの芽を持つ細胞数をカウントして、次のステップに進みます。細胞周期の停止が90%を超えた場合にのみ、2200 RPMで5分間遠心分離して細胞を回収します。氷冷水で3回洗浄した後、メチオニン不含の選択培地を用いて、細胞密度が約0.5 OD 600 nanometers/mLになるようにペレットを再懸濁します。細胞液の半分を新しい滅菌チューブに移し、最終濃度が0.2 millimolarになるようにメチオニンを添加します。これにより、タンパク質発現の基底レベルによる影響を確認するためのコントロールとします。両方の培養液を30 degree Celsiusのインキュベーターに戻します。各時間において、6時間にわたり1時間ごとに細胞の表現型発達を分析します。各培養液から1 mLの細胞懸濁液を滅菌マイクロ遠心チューブに移し、遠心分離により細胞を回収します。上清を吸い出し、ペレットを70 µLの培地で再懸濁します。次に、滅菌水で1 mg/mLに調製したストック溶液から、メチレンブルーを30 µL添加します。次に、この懸濁液を約6 µL、清潔なガラススライド上にピペットで滴下し、液滴の上にカバーガラスを被せます。カバーガラスを軽く押し、ガラスの界面間に細胞の薄く均一な層を作ります。カバーガラスを9つの領域に分け、各領域につき3枚ずつ画像を撮影します。正確な定量を行うため、1視野あたりの細胞数は30個以下にする必要があります。研究対象の表現型を示す細胞数をカウントします。この例では、互いに分離できず、伸長または連鎖した出芽を持つ出芽酵母細胞が対象となります。また、nthによって誘導される細胞分裂不全に伴い、青色で識別される死細胞の数もカウントします。2つの過剰発現によって細胞死を誘導し、各時点における表現型特異的な欠損を可視化します。滅菌済みのマイクロ遠心チューブに培養液を1 mL分取し、遠心分離により細胞を回収します。細胞ペレットを、滅菌水で調製した1 mg/mLのCalcein White溶液100 µLに懸濁し、室温・暗所で5分間インキュベートします。カルシフルホワイト（calcofluor white）で染色することで、細胞壁を可視化できます。ペレットを1×PBSで3回洗浄します。最後に、ペレットを100 µLのPBSに懸濁させます。顕微鏡下で細胞を観察し、UV光学系を用いて細胞壁を可視化しながら100倍の倍率で画像を撮影します。GFPタグ付きセプチンを可視化するには、FS Eフィルターを用いて画像を撮影します。カバーガラスを9つの区画に分け、各区画につき3枚の画像を撮影してカウントするという前述の方法を用いて、細胞壁の欠損およびセプチンの誤局在を示す細胞の割合を定量化し、タイムラプスビデオを撮影します。単一酵母細胞の顕微鏡観察には、培入りのアガロースベッドが必要なため、アガロースベッドを作製します。まず、凹みのあるガラススライドを70%アルコールで洗浄し、自然乾燥させます。スライドが乾いている間に、メチオニン不含の選択培地5 mLに0.06 gのagrosを加え、完全に溶解するまで電子レンジで急速に加熱します。その後、agrosを含む培地200 µLをスライドにピペットで分注します。凹みのあるスライドの上に、もう一枚の清潔なガラススライドを逆さまに被せ、下に気泡が閉じ込められないようにします。ゲルが凝固したら、上のスライドを凹みのあるスライドから滑らかに遠ざけます。この際、常に2枚のスライドの表面を平行に保ってください。これにより、アガロース床の表面が凹みのあるスライドの表面と面一になります。アガロースベッド周囲のスライド領域を、柔らかいティッシュで清掃します。これで、4時間後に使用可能な状態でスライドが準備できました。培養液から1 mLの細胞を滅菌マイクロ遠心チューブに移し、遠心分離によって回収します。上清を吸引し、メチオニンを含まない新鮮な選択培地 100 µL で細胞を再懸濁します。カバーガラスの縁にワセリンを塗布します。次に、アガロースベッドの中央に細胞懸濁液を1滴滴下し、その上にカバーガラスをそっと押し当てて均一に広げます。カバーガラスの端を封印し、エッジにマニキュアを塗布して位置を固定します。マニキュアが乾いたら、スライドを顕微鏡の加熱ステージ上に置きます。Zeiss Axio camm、MRMモノクロデジタルカメラを備えたZeiss Axio 200 M顕微鏡を使用し、時間の経過とともに視野内が混雑するため、十分な間隔を空けて10個以内の細胞が含まれる視野を選択します。細胞が分裂する間、約5時間にわたって5分ごとに視野の画像を撮影します。焦点の再調整を繰り返す手間を省くため、画像取得ソフトウェアをプログラムし、各タイムポイントでZスタック画像を数枚自動的に取得するようにします。後で最もフォーカスが合った画像を選択して動画を構成します。細胞に十分な熱を供給するため、加熱ステージに加えて、イメージングの間中、顕微鏡の透過白色光を点灯させて外部熱源として利用します。Image Jソフトウェアを用いて画像を動画にまとめることで、表現型回帰を研究することができます。ここでは、目的タンパク質を過剰発現させた際の代表的な結果を示します。Nth two。まず、nth twoのタンパク質発現について確認します。実験のタイムコースにおいて、HA nth twoを発現する細胞のライゼートを、モノクローナル抗HA抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析しました。免疫ブロットの結果が示すように、0.2 mMのメチオニン存在下で培養した細胞では、タンパク質発現は最小限でした。しかし、メチオニンを欠いた培地で培養した細胞では、実験のタイムコースを通じてS twoの濃度が一貫して上昇することが示されました。低濃度のnth twoでは、細胞分裂の表現型または細胞死のみを誘導することができないため、メチオニンの存在下または不在下で6時間培養した細胞を解析しました。メチレンブルーで染色した後、青色を呈している細胞はわずかであり、死細胞の割合が低いことが示されました。同様に、1細胞あたりの核数、細胞壁およびセプチンの構成は、予想通り正常でした。対照的に、M2の過剰発現は、メチレンブルー染色で青色を保持する連結した細長い出芽の長い鎖によって示されるように、激しい細胞分裂不全と細胞死を引き起こします。DPI染色で示されるように、表現型を示す細胞の多くは多核となっています。カルシフルホワイト染色は、異常な細胞壁パッチの蓄積を示しています。さらに、セプチンは著しく誤局在し、無秩序な状態になっています。時間の関数としての表現型の定量化をこのグラフに示しており、白抜きの円は0 mM メチオニンを、塗りつぶされた円は0.2 mM メチオニンを表しています。ここでは、細胞内でnth twoの濃度が時間とともに上昇するにつれて、細胞分裂の表現型を示す細胞の割合も上昇することがわかります。0.2 Milli メチオニンで培養したコントロール細胞により、表現型の発現はタンパク質濃度の低下によるものであり、細胞培養条件によるものではないことが示されました。最後に、nth two の過剰発現に伴う表現型の発現をタイムラプスビデオ顕微鏡で捉えました。nth処理から4時間後、過剰発現細胞の2つに軽微な形態学的細胞分裂表現型が見られます。動画が進むにつれて、頂端芽の成長期間が異常に延長し、非常に細長い芽が形成される様子が確認できます。また、細胞分離が起こる前に新しい芽が出現する現象も見られます。さらに、母細胞の複数の領域から出芽が観察され、分枝状の外観を呈します。以上の手順により、出芽酵母においてタンパク質濃度に応じた形態学的表現型の発達を特性評価および分析する方法を示しました。この手順を行う際は、推奨される遠心分離速度で細胞を処理することが重要です。速度が速すぎると細胞を損傷させる可能性があるためです。また、メチレンブルーと塩化物はライトイースト細胞に毒性があるため、イメージングの直前に添加することが重要である点に注意してください。それでは、ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功を願っております。

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私たちは、分裂酵母の性的なライフサイクルの長期顕微鏡検査のための再現可能な基本的な方法を提供します。説明されているわずかな調整で、提示されたプロトコルは、生殖プロセスのさまざまなステップに研究の焦点を当てることができます。...

分裂酵母セクシャルライフサイクルの顕微鏡観察

出芽酵母は、その強力な遺伝学とその微小管細胞骨格のシンプルさにin vivoでの微小管ダイナミクスを研究するための有利なモデルです。以下のプロトコルを変換し、培養酵母細胞、共焦点顕微鏡画像を取得し、かつ定量的に酵母生細胞における微小管ダイナミクスを分析する方法について説明します。...

出芽酵母における高解像度画像と個人アストラル微小管動態の解析

私たちは、個々の酵母細胞の成長表現型を、酵母（ODELAY）の生存アレイの1細胞倍加評価と称する経時的顕微鏡法を用いて固体培地上でコロニー中に増殖させる際に定量する方法を提示する。コロニーに成長する遺伝的に同一の細胞の集団の異種性を直接観察および定量することができる。...

ODELAY：酵母増殖の多パラメータ定量化のための大規模法

翻訳制御蛋白質量の制御に重要な役割を果たしています。ここでは、我々...

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

この単一分子蛍光その場で交配のプロトコルは、栄養生長と減数分裂中出芽酵母の RNA...

単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

ここでは、核分裂細胞および発芽酵母細胞の蛍光顕微鏡画像における脂質液滴の自動検出および定量的記述のMATLAB実装を提示する。...

自動画像処理による核分裂および発芽酵母における脂質液滴含有量の解析

この原稿は、非侵襲的共焦点顕微鏡を使用して、哺乳類宿主における活動感染中の形態形成表現型について中等度のカン ジダアルビカンス 変異体ライブラリをスクリーニングする方法について説明しています。...

哺乳類宿主における活動感染中のカンジダ・アルビカンス変異株の形態形成表現型をスクリーニングするためのin vivoイメージングの使用

このプロトコルは、酵母細胞周期停止とオプションの放出の2つの方法を詳述し、 S.

出芽酵母における細胞周期依存過程の操作と解析

学ぶ出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeにおけるタンパク質濃度依存の形態学的表現型発現解析プロトコル。調節可能なプロモーターを用いた制御発現により、個体群・単細胞レベルで表現型を詳細に解析する方法を解説。

出芽酵母のタンパク質濃度の関数としての形態学的表現型の開発の分析

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