出芽酵母のタンパク質濃度の関数としての形態学的表現型の開発の分析

このプロトコルは、制御されたタンパク質発現を可能にする調節可能なプロモーターを利用しています。この実験では、メチオニン抑制性プロモーターからN 2ドメインを発現する高コピーの2ミクロンプラスミドを使用します。これにより野生型の酵母細胞が形質転換されます。

プラスミドと形質転換体は、uolを欠くプレートで選択されます。一夜にして成長した後。選択的な培地では、細胞はコルチゾール媒介性増殖によって同期されません。逮捕。

最後に、時間経過実験中にメチオニンを欠く培地に細胞を移すことにより発現が誘導されます。タンパク質濃度は、ウェスタンブロッティングと顕微鏡による形態学的表現型の発生によってモニターされます。こんにちは、パデュー大学生物科学部のクラウディアです。

私は鼻唇と私はALラボのde Bari Mujiです。今日は、体内誘導におけるタンパク質濃度の関数としての形態学的表現型の発達の解析手順をお見せします。私たちの研究室では、この手順を使用して、エンドサイトーシス適応タンパク質のN 2ドメインが2つ存在しない状態で過剰発現したときに観察される細胞分裂表現型の形態学的および分子的側面を研究しています。

それでは始めましょう。このプロトコールは、目的のタンパク質を発現する酵母株の構築から始まります。我々のケースでは、野生型酵母W3 0 3を、メチオニン抑制性プロモーター2ミリモルメチオニン抑制の制御下でn番目の2を含む高コピー血漿DNAで形質転換し、25のプロモーター活性を満たした。

メチオニンを欠く培地は最大限の発現を可能にしますが、最近形質転換された細胞を含むプレートから6つのコロニーを選び、50ミリリットルの選択培地に0.2ミリモルのメチオニンを円錐形フラスコに接種し、翌朝200RPMで振とうしながら摂氏30度で一晩インキュベートします。600ナノメートルで培養物の光学密度を測定することにより、細胞密度を推定します。細胞のミリリットルあたり20個のOD600ナノメートルに相当するものを滅菌遠心チューブに移し、遠心分離によって回収します。

DMSO中の1ミリグラム/ミリリットルのストックから細胞周期を1ミリリットルあたり15マイクログラムの最終濃度に同期させるためにボルテックスすることにより、YPD培地に細胞を懸濁します。200 RPMで振とうしながら、摂氏30度で4時間インキュベートします。4時間後、有糸分裂で停止した細胞の割合を確認します。

顕微鏡で観察し、同じサイズの芽を持つ細胞の数を数えることにより、次のステップに進みます。停止が90%より大きい場合のみ2200RPMで5分間遠心分離することにより、細胞を回収します。氷冷水で3回洗浄した後、再燃し、メチオニンを欠く選択培地にペレットを約0.5 OD 600ナノメートル/ミリリットルの細胞密度で懸濁します。

細胞の半分の量を新しい滅菌チューブに移し、メチオニンを最終濃度0.2ミリモルまで添加します。これは、タンパク質発現の基礎レベルによる影響の制御として機能します。両方の培養物を摂氏30度のインキュベーターに戻します。

細胞の表現型の発生について、1時間ごとに6時間分析します。各培養物の細胞懸濁液1ミリリットルを滅菌マイクロフュージチューブにポイントトランスファーし、遠心分離により細胞を回収し、上清を吸引し、ペレットを70マイクロリットルの培地に再懸濁します。次に、滅菌水に1ミリグラムあたり1ミリグラムのストックから30マイクロリットルのメチレンブルーを追加します。

次に、この懸濁液の約6マイクロリットルをきれいなスライドガラスにピペットで移し、その上にカバースリップを置きます。カバースリップを静かに押して、ガラス界面の間に薄く均一なセル層を形成します。カバースリップを9つの象限に分割し、象限ごとに3つの画像を撮影します。

フィールドあたりのセル数は、正確な定量を可能にするために 30 セル以下にする必要があります。研究中の表現型を示す細胞の数を数えますが、この例では、互いに分離できない細長い芽や連結された芽を持つ出芽酵母細胞です。また、n番目に誘発された細胞分裂障害以降、青色で識別された死細胞の数もカウントします。

2回の過剰発現は細胞死につながり、毎回表現型特異的な欠陥を視覚化します。滅菌マイクロフュージチューブで1ミリリットルの培養物をポイントアリコートし、遠心分離によって細胞を回収します。細胞ペレットを1ミリリットルあたり1ミリグラムの100マイクロリットルに懸濁し、滅菌水中の白色カロール溶液に沈め、暗所で室温で5分間インキュベートします。

カルシオールホワイトで染色することで、e細胞壁を可視化することができます。ペレットを1つのXPBSで3回洗浄します。最終的なペレットを100マイクロリットルのPBSに懸濁します。

顕微鏡で細胞を観察し、UV光学系を使用して100倍の倍率で画像を取得し、細胞壁を視覚化します。GFPタグ付きセプチンを可視化するには、FS Eフィルターを使用して画像を取得し、前述の方法を使用して、カバースリップを9つの象限に分割し、象限ごとに3つの画像を撮影してTimeLapseビデオをカウントすることにより、細胞壁の欠陥とセプチンのミス局在を持つ細胞の割合を定量化します。単一酵母細胞の顕微鏡検査では、アグロスベッドを作るために培地を埋め込んだアグロスベッドが必要です。

まず、70%アルコールで凹型のくぼみのあるスライドガラスを清掃し、スライドが風乾している間に自然乾燥させます。0.06グラムのアグロスを、メチオニンが不足している5ミリリットルの選択培地で電子レンジで沸騰させ、アグロスが完全に急速に溶解するまで煮沸します。スライド内の媒体を含むアグロスの200マイクロリットルをピペットで。

その上に別のきれいなスライドガラスをくぼませて反転させ、気泡が下に閉じ込められていないことを確認します。ゲルが固まったら、上部のスライドをくぼみスライドからスムーズに離し、表面を常に平行に保ちます。これにより、アグロスベッドの表面がくぼみスライドの表面と同じ高さになります。

アグロスベッドの周囲のスライド領域を繊細なティッシュで清掃します。これで、スライドは 4 時間に相当する時間で使用できるようになりました。培養物から1ミリリットルの細胞を滅菌マイクロフュージチューブに移し、遠心分離により回収します。

上清を吸引し、メチオニンを欠く新鮮な選択培地100マイクロリットルに細胞を再懸濁します。カバースリップの端にワセリンを塗ります。次に、細胞懸濁液をアグロスベッドの中央に一滴置き、カバースリップをそっと押して均一に広げます。

カバースリップの端をシールし、マニキュアで縁を裏打ちしてその位置を固定します。マニキュアが乾いたら、スライドを顕微鏡の加熱ステージに置きます。Zeiss Axio 200 M顕微鏡とZeiss Axio camm、MRMモノクロデジタルカメラを組み合わせて使用し、時間が経つとフィールドが混雑するため、十分な間隔で10個以下のフィールドを選択します。

細胞が分裂するにつれて、約5時間にわたって5分ごとにフィールドの画像を撮ります。ピントを繰り返し調整し直すのを避けるため。画像取得ソフトウェアは、各時点で数枚のZack画像を自動的に取得するようにプログラムされています。

最適な焦点の画像は、細胞のための適切な熱を確保するために、ムービーを組み立てるために後で選択され、顕微鏡の透過白色光をイメージング表現型退縮の全期間にわたってオンにしておくことによって提供される加熱ステージに加えて、外部熱源は、Image Jソフトウェアを使用して画像をムービーに組み立てることによって研究することができます。ここでは、目的のタンパク質を過剰発現させた代表的な結果を示します。N番目2。

まず、n番目の2のタンパク質発現。実験の過程で、HAを発現する細胞からのライセートをn番目に決定し、モノクローナル抗HA抗体を用いてウェスタンブロッティングにより2つを解析したところ、0.2ミリモルのメチオニン存在下で増殖したイムノブロット細胞はタンパク質発現が最小限であったことが示された。しかし、メチオニンを欠く培地で増殖した細胞は、実験の経時的過程にわたってS2の濃度が一貫して上昇することを示しています。

次に、メチオニンの存在下または非存在下で6時間増殖した細胞を、低n番目の2濃度では細胞分裂表現型または細胞死のみを誘導できないため、分析しました。メチレンブルーで染色した後、青色で示されるように、細胞が死滅する割合は低いです。同様に、細胞あたりの核数、細胞壁、中隔組織化も予想通り正常です。

対照的に、M 2の過剰発現は、メチレンブルーで染色しても青色を保持する接続された細長い芽の長い鎖によって示されるように、大規模な細胞分裂障害と細胞死につながります。ほとんどの表現型細胞は、DPI染色で示されるように多核化されています。カルシオールホワイト染色は、異常な細胞壁パッチの蓄積を示しています。

さらに、セプチンは著しくミス局在化しており、無秩序です。時間の関数としての表現型定量化をこのグラフに示しており、白丸はゼロミリモルメチオニンを表し、閉じた円は0.2ミリモルメチオニンを表します。ここでは、時間の経過とともに細胞内に2つの濃度が蓄積すると、細胞分裂表現型を示す細胞の割合も上昇することがわかります。

0.2で増殖したコントロール細胞。ミリメチオニンは、表現型の発生がタンパク質濃度の上昇によるものであり、細胞培養条件によるものではないことを示しています。最後に、n番目の2つの過剰発現による表現型の発達を、タイムラプスビデオ顕微鏡法によって捕捉します。

n時間経過の4時間後、2つの過剰発現細胞は軽度の形態学的細胞分裂表現型を示します。映画が進むにつれて、頂芽の成長が異常かつ長期間にわたって行われ、非常に細長い芽が生じます。また、細胞分裂イベントが発生する前に、新しい芽が出現するイベントも見られます。

さらに、芽は母親の細胞のいくつかの領域から出現し、外観への分岐を引き起こすことが観察されます。出芽リストにおけるタンパク質濃度の関数として形態学的表現型の発達を特徴付け、分析する方法を示しました。この手順を行うことで、速度が速いと細胞が損傷する可能性があるため、推奨される遠心分離速度で細胞を撫でることを忘れないでください。

また、メチレンブルーと塩化物は軽い東細胞に毒性があるため、イメージングの直前に添加することを忘れないことも重要です。だから、見てくれてありがとう、そしてあなたの実験に頑張ってください。