出芽酵母のタンパク質濃度の関数としての形態学的表現型の開発の分析

このプロトコルでは、タンパク質発現の制御が可能な調節可能プロモーターを利用します。本実験では、メチオニン抑制性プロモーターからN-末端2ドメインを発現させる高コピーの2ミクロン・プラスミドを使用します。野生型酵母細胞にこれを形質転換させます。

プラスミドおよび形質転換体は、uolを欠くプレート上で選抜します。選択培地にて一晩培養した後、コルチゾールによる増殖停止を介して細胞を同期させます。

最後に、タイムコース実験の間、細胞をメチオニン欠損培地に移すことで発現を誘導します。タンパク質濃度はウェスタンブロッティングで、形態学的表現型の形成は顕微鏡観察でモニタリングします。こんにちは、パデュー大学生物科学科のクラウディアです。

私はALラボのde Bari Mujiです。本日は、細胞内におけるタンパク質濃度の関数として形態的表現型の発達を解析する手順について説明します。当研究室では、エンドサイトーシス適応タンパク質absent twoのN末端ドメインを過剰発現させた際に観察される細胞分裂表現型の形態的および分子的な側面を研究するために、この手順を用いています。

それでは始めましょう。本プロトコルは、目的タンパク質を発現させる酵母株の作製から始まります。本例では、メチオニン抑制性プロモーターの制御下にnth twoを含む高コピー数プラスミドDNAを、野生型酵母株W 3 0 3に形質転換しました。2 millimolarのメチオニンにより、met 25プロモーターの活性が抑制されます。

メチオニン欠乏培地で最大発現が可能となりますが、最近形質転換した細胞を含むプレートから6つのコロニーを選別し、0.2 millimolar メチオニンを含む50 millilitersの選択培地に入れたコニカルフラスコに接種し、翌朝まで30 degrees Celsius、200 RPMの振盪条件下で一晩培養します。600 nanometersにおける培養液の吸光度を測定し、細胞密度を推定します。20 OD 600 nanometers/milliliterに相当する細胞量を滅菌した遠心チューブに移し、遠心分離により回収します。

細胞周期を同期させるため、YPD培地中で細胞をボルテックスして再懸濁し、DMSO中の1 mg/mLストック溶液から最終濃度15 µg/mLとなるように調製します。30 °Cで200 RPMで振盪しながら4時間インキュベートします。4時間後、有糸分裂期に停止した細胞の割合を確認します。

顕微鏡で観察し、同サイズの芽を持つ細胞数をカウントして、次のステップに進みます。細胞周期の停止が90%を超えた場合にのみ、2200 RPMで5分間遠心分離して細胞を回収します。氷冷水で3回洗浄した後、メチオニン不含の選択培地を用いて、細胞密度が約0.5 OD 600 nanometers/mLになるようにペレットを再懸濁します。

細胞液の半分を新しい滅菌チューブに移し、最終濃度が0.2 millimolarになるようにメチオニンを添加します。これにより、タンパク質発現の基底レベルによる影響を確認するためのコントロールとします。両方の培養液を30 degree Celsiusのインキュベーターに戻します。

各時間において、6時間にわたり1時間ごとに細胞の表現型発達を分析します。各培養液から1 mLの細胞懸濁液を滅菌マイクロ遠心チューブに移し、遠心分離により細胞を回収します。上清を吸い出し、ペレットを70 µLの培地で再懸濁します。次に、滅菌水で1 mg/mLに調製したストック溶液から、メチレンブルーを30 µL添加します。

次に、この懸濁液を約6 µL、清潔なガラススライド上にピペットで滴下し、液滴の上にカバーガラスを被せます。カバーガラスを軽く押し、ガラスの界面間に細胞の薄く均一な層を作ります。カバーガラスを9つの領域に分け、各領域につき3枚ずつ画像を撮影します。

正確な定量を行うため、1視野あたりの細胞数は30個以下にする必要があります。研究対象の表現型を示す細胞数をカウントします。この例では、互いに分離できず、伸長または連鎖した出芽を持つ出芽酵母細胞が対象となります。また、nthによって誘導される細胞分裂不全に伴い、青色で識別される死細胞の数もカウントします。

2つの過剰発現によって細胞死を誘導し、各時点における表現型特異的な欠損を可視化します。滅菌済みのマイクロ遠心チューブに培養液を1 mL分取し、遠心分離により細胞を回収します。細胞ペレットを、滅菌水で調製した1 mg/mLのCalcein White溶液100 µLに懸濁し、室温・暗所で5分間インキュベートします。

カルシフルホワイト（calcofluor white）で染色することで、細胞壁を可視化できます。ペレットを1×PBSで3回洗浄します。最後に、ペレットを100 µLのPBSに懸濁させます。

顕微鏡下で細胞を観察し、UV光学系を用いて細胞壁を可視化しながら100倍の倍率で画像を撮影します。GFPタグ付きセプチンを可視化するには、FS Eフィルターを用いて画像を撮影します。カバーガラスを9つの区画に分け、各区画につき3枚の画像を撮影してカウントするという前述の方法を用いて、細胞壁の欠損およびセプチンの誤局在を示す細胞の割合を定量化し、タイムラプスビデオを撮影します。単一酵母細胞の顕微鏡観察には、培入りのアガロースベッドが必要なため、アガロースベッドを作製します。

まず、凹みのあるガラススライドを70%アルコールで洗浄し、自然乾燥させます。スライドが乾いている間に、メチオニン不含の選択培地5 mLに0.06 gのagrosを加え、完全に溶解するまで電子レンジで急速に加熱します。その後、agrosを含む培地200 µLをスライドにピペットで分注します。

凹みのあるスライドの上に、もう一枚の清潔なガラススライドを逆さまに被せ、下に気泡が閉じ込められないようにします。ゲルが凝固したら、上のスライドを凹みのあるスライドから滑らかに遠ざけます。この際、常に2枚のスライドの表面を平行に保ってください。これにより、アガロース床の表面が凹みのあるスライドの表面と面一になります。

アガロースベッド周囲のスライド領域を、柔らかいティッシュで清掃します。これで、4時間後に使用可能な状態でスライドが準備できました。培養液から1 mLの細胞を滅菌マイクロ遠心チューブに移し、遠心分離によって回収します。

上清を吸引し、メチオニンを含まない新鮮な選択培地 100 µL で細胞を再懸濁します。カバーガラスの縁にワセリンを塗布します。次に、アガロースベッドの中央に細胞懸濁液を1滴滴下し、その上にカバーガラスをそっと押し当てて均一に広げます。

カバーガラスの端を封印し、エッジにマニキュアを塗布して位置を固定します。マニキュアが乾いたら、スライドを顕微鏡の加熱ステージ上に置きます。Zeiss Axio camm、MRMモノクロデジタルカメラを備えたZeiss Axio 200 M顕微鏡を使用し、時間の経過とともに視野内が混雑するため、十分な間隔を空けて10個以内の細胞が含まれる視野を選択します。

細胞が分裂する間、約5時間にわたって5分ごとに視野の画像を撮影します。焦点の再調整を繰り返す手間を省くため、画像取得ソフトウェアをプログラムし、各タイムポイントでZスタック画像を数枚自動的に取得するようにします。

後で最もフォーカスが合った画像を選択して動画を構成します。細胞に十分な熱を供給するため、加熱ステージに加えて、イメージングの間中、顕微鏡の透過白色光を点灯させて外部熱源として利用します。Image Jソフトウェアを用いて画像を動画にまとめることで、表現型回帰を研究することができます。ここでは、目的タンパク質を過剰発現させた際の代表的な結果を示します。Nth two。

まず、nth twoのタンパク質発現について確認します。実験のタイムコースにおいて、HA nth twoを発現する細胞のライゼートを、モノクローナル抗HA抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析しました。免疫ブロットの結果が示すように、0.2 mMのメチオニン存在下で培養した細胞では、タンパク質発現は最小限でした。しかし、メチオニンを欠いた培地で培養した細胞では、実験のタイムコースを通じてS twoの濃度が一貫して上昇することが示されました。

低濃度のnth twoでは、細胞分裂の表現型または細胞死のみを誘導することができないため、メチオニンの存在下または不在下で6時間培養した細胞を解析しました。メチレンブルーで染色した後、青色を呈している細胞はわずかであり、死細胞の割合が低いことが示されました。同様に、1細胞あたりの核数、細胞壁およびセプチンの構成は、予想通り正常でした。

対照的に、M2の過剰発現は、メチレンブルー染色で青色を保持する連結した細長い出芽の長い鎖によって示されるように、激しい細胞分裂不全と細胞死を引き起こします。DPI染色で示されるように、表現型を示す細胞の多くは多核となっています。カルシフルホワイト染色は、異常な細胞壁パッチの蓄積を示しています。

さらに、セプチンは著しく誤局在し、無秩序な状態になっています。時間の関数としての表現型の定量化をこのグラフに示しており、白抜きの円は0 mM メチオニンを、塗りつぶされた円は0.2 mM メチオニンを表しています。ここでは、細胞内でnth twoの濃度が時間とともに上昇するにつれて、細胞分裂の表現型を示す細胞の割合も上昇することがわかります。

0.2 Milli メチオニンで培養したコントロール細胞により、表現型の発現はタンパク質濃度の低下によるものであり、細胞培養条件によるものではないことが示されました。最後に、nth two の過剰発現に伴う表現型の発現をタイムラプスビデオ顕微鏡で捉えました。

nth処理から4時間後、過剰発現細胞の2つに軽微な形態学的細胞分裂表現型が見られます。動画が進むにつれて、頂端芽の成長期間が異常に延長し、非常に細長い芽が形成される様子が確認できます。また、細胞分離が起こる前に新しい芽が出現する現象も見られます。

さらに、母細胞の複数の領域から出芽が観察され、分枝状の外観を呈します。以上の手順により、出芽酵母においてタンパク質濃度に応じた形態学的表現型の発達を特性評価および分析する方法を示しました。この手順を行う際は、推奨される遠心分離速度で細胞を処理することが重要です。速度が速すぎると細胞を損傷させる可能性があるためです。

また、メチレンブルーと塩化物はライトイースト細胞に毒性があるため、イメージングの直前に添加することが重要である点に注意してください。それでは、ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功を願っております。