区分するマイクロ流体デバイスとライブセルイメージングを使用した癌幹細胞の移行の評価

この手順の全体的な目標は、コンパートメント化マイクロ流体デバイスを介してがん細胞の移動を視覚的に検査し、特徴付けることです。これは、無血清培地で増殖した脳腫瘍幹細胞の既存のニューロスフェアを最初に解離させることによって達成されます。2番目のステップは、二層構造のSU8マスターを製造し、コンパートメント化デザインのソフトリソグラフィー金型APDMSスタンプを使用することです。

次に、マイクロ流体デバイスを組み立て、脳腫瘍幹細胞をロードします。最後に、脳腫瘍幹細胞の遊走の長期タイムラプスイメージングは、オールインワンの顕微鏡システムを使用して行われます。最終的に、脳腫瘍幹細胞は、超閉鎖空間を移動する際に、形態学的段階の回転シーケンスを示すことが結果として示されました。

Transwell Boyton Chamberのような既存の質量に対するこの技術の主な利点は、マイクロデバイスにより、移動プロセスの目視検査、細胞の制御された配置、および因子の正確な送達が可能になることです。したがって、マイクロフォリックテクノロジーには、信頼性が高く、効率的で、費用対効果の高いシングルセルの選択とナビゲーションという特徴があります。この技術の意味は、高度に遊走性細胞のシングルセル解析により、将来の潜在的な化学療法標的が特定される可能性があるため、がんの転移と再発の治療にまで及びます。

この方法は、がんシステムの移動挙動に関する洞察を提供しますが、胚発生、免疫応答、創傷治癒、臓器再生などの他のシステムにも適用できます。BTSC由来の神経スピアの細胞懸濁液から始まります。細胞を15ミリリットルの円錐管にプールし、900 RPMで5分間遠心分離しますが、それ以上の速さはしません。

スーパーナチンを吸引します。次に、ニューロスフェアを0.5ミリリットルの温めたアキュテインに摂氏37度で5〜10分間インキュベートして、ニューロスフェアを緩めます。インキュベーション後、P 100ピペットを10〜20回優しくストロークして細胞を機械的に破壊します。

次に、1.5ミリリットルの幹細胞培地を加えてアキュテイン遠心分離機を中和し、細胞懸濁液を1300 RPMで5分間中和し、1ミリリットルの幹細胞培地に細胞を再懸濁します。ヘモサイトメーターで細胞密度を確認し、密度をマイクロリットルあたり20, 000細胞に調整します。SU eight masterの製作にあたっては、Adobe Illustratorで2枚のフォトマスクと、Image Setterを組み込んだレーザー印刷用透明フィルムを用意します。

第1層のフォトマスクは、2つの基準マーカーと一連のマイクロチャネルで構成され、フォトマスクの第2層には、座席と受信チャンバーがあります。両方のマスク層をイソプロパノールで洗浄し、自然乾燥させます。次に、ハンドルウェーハに3ミクロンの厚さのSU8フォトレジストをスピンコートし、続いてソフトベーキングを行います。

次に、最初の層のフォトマスクをUVに密着させて、写真を露光し、抵抗して硬化させます。次に、硬化したウェーハをポストベークして現像します。ハンドルウェーハの基準マーカー領域をスコッチテープで覆います。

次に、ウェーハに厚さ250ミクロンのフォトレジストをスピンコートします。その後、テープをはがして、位置合わせ用のマーカーを表示します。フォトレジストの2層目を配置し、基準マーカーを位置合わせします。

次に、2層目のフォトマスクをUV露光して硬化させ、続いてポストベーキングと現像を行います。次に、SU 8マスターを蒸着して表面の粘着性を低減します。ウェーハを数滴のTri Chloro cline溶液を入れた乾燥剤に、真空下で少なくとも1時間置きます。

その後、マスターはマスターでPDMSを成形する準備が整います。まず、プレポリマーベースと硬化剤を10対1の比率で完全に混合します。次に、気泡が見えなくなるまで、混合物を乾燥剤に入れて真空脱気します。

混合物をマスクに注ぎ、再度脱気します。新しい気泡が導入された場合は、水平なホットプレートで金型を摂氏90度で2時間硬化させます。室温まで冷めたら、PDMSスタンプを静かに離します。

したがって、培養チャネルはPDMSに刻印され、マイクロ流体デバイスの組み立ての準備が整います。マスターは、ひび割れや摩耗するまで成形に再利用できます。マスターがべたついたら、アンチスティックコーティングを再塗布できます。

まず、PDMSスタンプを介してマイクロ流体デバイスに入口と出口を作成します。生検穴穿刺を使用して、PDMSスタンプを70%エタノールに30分間浸し、次に脱イオン水で10分間すすいでPDMSスタンプを洗浄します。PDMSスタンプのクロスリンク反応をオートクレーブで滅菌し、完了させます。

次に、ポリLリジンでコーティングされたガラスカバースリップにPDMSスタンプを置きます。次に、リザーバー入口からチャンバーにラミネート溶液を充填することにより、デバイスをラミネートでコーティングし、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、デバイスからラミネートを吸引します。

次に、幹細胞培地でデバイスを2回浸してデバイスを洗浄します。次に、解離した細胞の11マイクロリットルを播種リザーバーの1つにロードします 必要に応じて、真空吸引を使用して細胞をチャンバーに押し込みます。次に、さらに7マイクロリットルの細胞を隣接する座席リザーバーにロードします。

5分後、座席と受け取り用の貯水池はメディアで溢れかえります。次に、厚さ0.5〜1ミリメートルの滅菌PDMSシートをデバイスに置きます。PDMS自体が自然に表面に接着することで、一度密封されるとデバイスが密閉され、輸送、インキュベーション、顕微鏡イメージングの準備が整います。

ビオ、IMを45分間実行して、事前に平衡化します。温度、湿度、および空気供給を安定させるために、サンプルチャンバーにいくつかの水皿を追加して、適切な湿度を取得します。準備したデバイスを顕微鏡のサンプルチャンバーにロードします。

マイクロピンセットを使用してデバイスを中央に配置します。次に、Biotソフトウェアを使用してフォーカス位置のポイントとタイムポイントを設定し、必要に応じてタイムラプス録画を開始します。培養に5日間浸した後、培地を交換します。

デバイスにシードされたBTCは、フェーズイメージによって連続的に記録されました。シーティングチャンバー内で5日間、紡錘形細胞は移動前の段階に留まりました。彼らがマイクロチャネル入口に近づくと、いくつかの細胞が拡張し、接着性の突起を生成しました。

入り口を占有し、移動方向を探索できたのは1つのセルだけでした。細胞が移動方向を決定すると、細胞は安定した高速でマイクロチャネル全体を巡航し始めました。マイクロチャネルの終わりに、細胞は受信チャンバーのオープンスペースを探索し始め、最終的にチャンバーに入りました。

2秒のイメージング間隔で細胞を観察することにより、移動力は主にOID細胞と同様のブラビング活性によって生成されるように見えました。この手順を試行する際、デバイスの設計は非常に柔軟であるため、マイクロチャネルの寸法を操作して所望の程度の細胞移動を達成できることを覚えておくことが重要です。このビデオを見た後、目的の細胞を培養するのに適した独自のコンパートメント化マイクロ流体デバイスを作成し、その後、これらの細胞の遊走特性を定性的および定量的に定義するための長期タイムラプスイメージングを実行する方法について十分に理解しているはずです。

次世代シーケンシングやDNAマイクロアレイなどの他の方法を適用して、高度に移動性のがん細胞が遺伝的にどれほど異なるかなどの追加の質問に答えることができます。