細胞浸潤および移行プロセスの評価: ビデオ顕微鏡ベースのスクラッチの比較創傷アッセイと boyden 教授区域の試金

この実験の全体的な目標は、細胞の浸潤と移動の研究に使用される2つのアッセイ、ボイデンチャンバーアッセイ、および最適化されたin vitroビデオ顕微鏡ベースのスクラッチ創傷アッセイを報告し、比較することです。これらの実験は、最も関連性の高い方法の選択など、侵略と移住の研究分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この最適化されたin vitroビデオ顕微鏡ベースのスクラッチ創傷アッセイの主な利点は、治療条件間の再現性と正確な比較を提供することです。

この方法は細胞の遊走と浸潤を評価できますが、治癒や組織再生などの他の研究分野にも適用できます。アッセイ1日目の72時間前に、175平方センチメートルのフラスコに25ミリリットルの培養培地中の1/6細胞に10回2回播種することにより、SQ20B細胞を調製します。細胞が摂氏37度で80%の細胞合流まで増殖するのを待ちます。

トリプシン処理と細胞計数後の 1 日目に、25 平方センチメートルのフラスコに 25 平方センチメートルのフラスコに 6 倍の細胞密度で細胞を播種し、3 ミリリットルの培養培地に 1/5 細胞を入れます。細胞を摂氏37度で24時間インキュベートします。翌日、各フラスコの培地を3ミリリットルの低ウシ胎児血清培地に交換して細胞を飢餓状態にします。

摂氏37度のインキュベーターで細胞を24時間飢餓状態にします。浸潤アッセイのためには、細胞飢餓開始から12時間後にコーティングされたボイデンチャンバーを調製します。各ボイデンチャンバーをコンパニオンプレートに入れます。

コーティングされた各チャンバーに500マイクロリットルの飢餓細胞培地を追加します。翌日、3日目に、コンパニオンプレートを使用して走化性物質を調製します。24ウェルコンパニオンプレートの各ウェルに、10%FBS、ヒドロコルチゾン、ペニシリン、ストレプトマイシンを含む750マイクロリットルの完全な培地を充填します。

上部チャンバーをプレフィルドコンパニオンプレートに移し、気泡を避けます。インベージョンアッセイでは、各Boydenチャンバーから450マイクロリットルの培地を慎重に取り出します。トリプシン化し、飢餓状態のSQ20B細胞をカウントした後、0.1%BSA培地の500マイクロリットル中の1/4細胞に1/4細胞に10×10を3回播種し、1ミリリットルあたり1/4細胞に10×6の最終希釈を与える。

ボイデンチャンバーを摂氏37度のインキュベーターに24時間置きます。4日目に、コンパニオンプレートから各インサートを取り出し、綿棒を使用して上部チャンバーから細胞を慎重に取り出します。その後、各インサートを個別に固定して染色し、メーカーの指示に従って染色キットを使用してMay-Grunwald Gemsaの着色を取得します。

5日目に顕微鏡分析を行います。インサート付きのコンパニオンプレートを20倍位相差顕微鏡に挿入し、メンブレン下部で移動した各細胞をカウントします。アッセイの1日目の72時間前に、175平方センチメートルフラスコ内の25ミリリットルの培養培地に1/6 SQ20B細胞に10回2回播種し、細胞を80%細胞コンフルエンスまで増殖させます。

トリプシン処理および細胞計数後の1日目に、SQ20B細胞の希釈済みサンプルを、1ミリリットルあたり10の1/5細胞の4倍の密度で生成します。100マイクロリットルの細胞溶液を96ウェルプレートの各ウェルに分注して、各ウェルの100マイクロリットルあたり1/4細胞に10の4倍の最終密度を与える。プレートを摂氏37度のインキュベーターに入れ、細胞をプレートに12〜16時間接着させます。

翌日、市販の傷害装置を使用してプレートをフードに持っていき、傷つけます。巻線メーカーの上部を取り外し、ウォッシュボート溶液にセットします。プレートをベースプレートホルダーに挿入し、プレートカバーを取り外します。

ピンブロックの後部ダボをベースプレートの後部穴に導いて、ピンブロックを交換します。黒いレバーを押したまま、黒いレバーを押し続けながらピンブロックを持ち上げます。円錐形の先端が適合したピペットを使用して、傷口に触れないように注意しながら、すぐに各ウェルから培地を取り出します。

各ウェルに37°Cに温めた細胞培地100μリットルを各ウェルに加えて細胞を洗浄します。2回目の洗浄後、先端が円錐形のピペットを使用して細胞培地を吸引します。次に、各処理条件に固有の100マイクロリットルの培地を各ウェルに追加して、ウェルに気泡が発生しないようにします。

96ウェルプレートをビデオ顕微鏡の適合ラックに置きます。ビデオ顕微鏡ソフトウェアプログラムを使用して、ウェルごとに1つの画像でスキャンのスケジュールを作成します。移民侵入実験には、最大 2 時間の間隔が必要です。

実験の目的がビデオを作成することである場合は、最大 30 分の間隔が望ましいです。各細胞タイプに適合した適切なセルマスクを使用して、最短24時間、最長5日間、細胞遊走をモニタリングおよびチェックし、細胞遊走を解析します。各細胞株に適合した細胞マスクを取得するには、特定の細胞画像コレクションを使用して、ソフトウェアから細胞処理定義を生成します。

曲線をトレースし、データをスプレッドシートにエクスポートして、結果の分析と比較に使用できます。細胞浸潤アッセイの準備として、細胞遊走アッセイで実証したのと同じ方法でSQ20B細胞をシードし、インキュベーター内で96ウェルプレートをインキュベートします。アッセイの2日目に、細胞外マトリックスを調製します。

使用前に少なくとも12時間、マトリックスを摂氏4度で解凍し、骨材が見えないことを確認してください。微量遠心チューブを氷の上で5分間冷やします。予冷した微量遠心チューブで摂氏4度に予冷した円錐形の先端でマトリックスを希釈し、摂氏4度に冷却した細胞培地でマトリックスを希釈し、最終濃度300マイクログラム/ミリリットル

マトリックスをあらかじめ希釈したマイクロ遠心チューブを冷蔵庫で摂氏4度に保ちます。インキュベーターから96ウェルプレートを取り出します。ボンネットの下では、前に示したように、製造元のプロトコルに従って市販の傷害装置を使用して傷を作ります。

先端が円錐形のピペットを使用して、各ウェルから培地をすぐに取り出し、傷口に触れないように注意してください。摂氏37度に温めた100マイクロリットルの細胞培地を使用して細胞を2回洗浄します。2回目の洗浄後、プレートを氷の上に5分間置き、温度を平衡化します。

端から慎重にピペットでピペットを動かし、傷口に触れないように注意しながら、各ウェルから冷たい培地を取り出します。摂氏4度で予冷した円錐形の先端を使用して、各ウェルに50マイクロリットルの予め希釈されたマトリックスを追加します。プレートを摂氏37度のインキュベーターに30分間置きます。

30分後、各治療条件に示されているように、適応した細胞培地100マイクロリットルを各ウェルに加えます。プレートをビデオ顕微鏡の適合ラックに置きます。その後、スキャンをプログラムし、細胞移動アッセイで実証されたようにビデオ顕微鏡分析を行います。

細胞固定後のボイデンメンブレンの代表的な結果を示します。最適でないメンブレンは、メンブレンの上側に細胞クラスターがあり、解釈できない結果をもたらします。対照的に、最適なメンブレンは、メンブレンの下部に青色で染色された可算細胞を持っています。

スクラッチ創傷アッセイの最適な結果は、ゼロ時間、15時間、および30時間での創傷治癒のこれらの画像によって示されています。質の高い実験の基準は、線状創傷であること、創傷に細胞片が観察されないこと、および細胞のコンフルエンスが最適であることです。パネルAに示すように、90%コンフルエンスは創傷治癒アッセイに最適な細胞密度であり、パネルCは低細胞密度の例を示し、パネルBは細胞ペレットの不十分な洗浄によって引き起こされる細胞クラスターを示しています。

ビデオ顕微鏡ソフトウェアを使用して得られた創傷治癒のこのグラフ表現は、4つの治療条件の時間に応じた創傷細胞コンフルエンスのパラメータの定量化を示しています。併用療法は細胞遊走を有意に減少させることが観察された。このビデオを見れば、細胞の移動と浸潤プロセスの評価方法について十分に理解できるはずです。