Name: 細胞浸潤および移行プロセスの評価: ビデオ顕微鏡ベースのスクラッチの比較創傷アッセイと boyden 教授区域の試金 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 学ぼう 細胞浸潤と移行の評価法として、ビデオ顕微鏡ベースのスクラッチ創傷アッセイとBoydenチャンバー法を比較する。SQ20B細胞を用いた両手法の利点と限界を解説し、創傷治癒や組織再生研究への応用可能性も示す。

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これらの技術は、LabEx 素数 (ANR-11-LABX-0063)、エトワール (CPER 2009 ~ 2013 年)、叙情詩的なグラント インカ DGOS-4664 の科学的なフレームワーク内で契プラン クーデタークーデター地域 (CPER) の支援を受けて開発されました。

注: ECM の包含なし・ ボイデン ・商工会議所とスクラッチ アッセイし、呼ばれ遊走アッセイによる ECM と同じアッセイを浸潤能の測定と呼びます。
1. ボイデン室アッセイ
注: このプロトコル、喉頭がんの再発の頭と頸部扁平上皮癌 (各種) から派生した、ジョンから得られた SQ20B のセルラインに適応されるほとんど (ボストン、マサチューセッツ州、米国)。
日 1
<ol><li>
細胞播種
	<ol>
<li>シード 2 106 SQ20B 細胞の培養液 (CM) 12 mL で 175 cm2フラスコ前日 72 h、80% セル合流点に成長する細胞を許可します。<ol>
<li>SQ20B 細胞の CM を準備をするには、10% 牛胎児血清 (FCS)、0.04 mg/mL ヒドロコルチゾン、100 U/mL ペニシリン、ストレプトマイシン 0.1 g/L とダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) を補足します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>層流フードの下には、セルを trypsinize します。メディアを取り出して洗って滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で細胞をトリプシン エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) (0.5 g/L) の 2.5 mL を追加します。37 ° C で 5 分間細胞をインキュベートし、37 ° C に温めて cm 12.5 mL の追加によって反作用を停止細胞カウンターを使用してセルの数をカウントします。</li>
		<li>評価する条件ごとに 6 105セルの細胞密度で 25 cm2フラスコで細胞を播きます。CM の 3 mL で 24 h のセルを孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
</ol>日 2
<ol start="2"><li>
セル飢餓そしてコーティング室の準備
	<ol>
<li>FBS ではなく各フラスコの培地を 0.1% ウシ血清アルブミン (BSA) を使用して低胎児血清 (FBS) 培地 3 mL に置き換えることによって、細胞を飢えさせます。インキュベーターで 24 h の細胞を飢えさせます。<ol>
<li>飢餓 CM (s CM) を準備するには、0.1 %bsa、0.04 mg/mL ヒドロコルチゾン、100 U/mL ペニシリン、ストレプトマイシン 0.1 g/L と DMEM を補足します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>移行分析手順 1.3 に進みます。</li>
		<li>浸潤能の測定、3 日前に 12 h 各コーティング室に s cm 500 μ L の追加によってコーティングされた boyden 教授室を準備します。市販コーティング ボイデン室を使用して、使用する前に 4 ° C でそれらを保ちます。コンパニオン プレート内各ボイデン室を置き、37 ° C でインキュベーターで一晩おきます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>日 3
<ol start="3"><li>
細胞播種 boyden 教授室
	<ol>
<li>コンパニオン プレートを使用して、走化性因子を準備します。それぞれ記入を完全培地 10 %fbs、0.04 mg/mL ヒドロコルチゾン、100 U/mL ペニシリンとストレプトマイシン 0.1 g/L と 750 μ l 24 ウェル コンパニオン プレートのも。<ol>
<li>各セルラインおよび処理の各条件の走化性因子に適応します。走化性因子 CM CM ca を準備するには、10 %fcs、0.4 mg/mL ヒドロコルチゾン、100 U/mL ペニシリン、ストレプトマイシン 0.1 g/L と DMEM を補足します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>泡を避けるために世話済みコンパニオン プレートに参院を転送します。</li>
		<li>浸潤アッセイ各 boyden 教授室から CM の 450 μ L を慎重に取り外します。</li>
		<li>層流フードの下には、セルを trypsinize します。メディアを取り出して、洗浄滅菌 PBS のセル、トリプシン EDTA (0.5 g/L) の 0.5 mL を加えて、37 ° C で 5 分間細胞をインキュベーションして37 ° C に温めて CM の追加によって反作用を停止します。細胞カウンターを使用してセルの数をカウントします。</li>
		<li>500 μ L の 6 104セル/mL の最終希釈を与えて、0.1 %bsa の中でシード 3 104 SQ20B 細胞。 注: 各セルラインのセルの濃度を合わせる必要があります。</li>
		<li>37 ° C で 24 時間のためのインキュベーターにプレートを配置します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>日 4
<ol start="4"><li>
細胞の固定・染色
	<ol>
<li>倍加時間の細胞ラインに特定する前にセルを修正します。24 h する前に SQ20B セルを修正します。</li>
		<li>各挿入をコンパニオン プレートから外し、綿棒を使用して上部チャンバーからセルを慎重に取り外します。特に上部室にあるすべてのセルを削除することが重要です。</li>
		<li>修正と汚れはそれぞれ 5 月 Grunwald ギムザ着色9提供染色キットを使用してを取得する個別に挿入します。また、別の仲間の板で 30 分固定用 4% パラホルムアルデヒドを使用します。</li>
		<li>各商工会議所を乾燥する所のフードの下で空 24 ウェル コンパニオン プレートに挿入をしてください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>日 5
<ol start="5"><li>
顕微解析
	<ol>
<li>20 位相差顕微鏡に挿入してコンパニオン プレートを挿入し、膜の下の部分にそれぞれ移行したセルをカウントします。目的を下から上に移動して右フォーカス位置を最適化し、膜の下の部分に位置を停止します。</li>
		<li>移行した細胞数とシード セル間の比率を計算します。3 通の各治療条件に対してそれぞれのカウントを繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. スクラッチ傷の試金: 細胞の遊走
メモ: 手順は、細胞の種類ごとに合わせられなければなりません。
日 1
<ol><li>
細胞播種
	<ol>
<li>種子 2 x 106 SQ20B CM 175 cm2フラスコ前日 72 h の 12 mL の細胞し、80% セル合流点に成長する細胞を許可します。</li>
		<li>層流フードの下には、セルを trypsinize します。メディアを取り出して、洗浄滅菌 PBS のセル、トリプシン EDTA (0.5 g/L) の 2.5 mL を追加し、37 ° C で 5 分間細胞をインキュベート37 ° C に温めて cm 12.5 mL の追加によって反作用を停止します。細胞カウンターを使用してセルの数をカウントします。</li>
		<li>各ウェルに 100 μ L あたり 4 104セルの最終的な密度を与える 4 x 105/mL の細胞密度で prediluted のサンプルを生成します。この濃度は、各セルラインに適応する必要があり、1 x 104 6 104セルの範囲内にする必要があります。</li>
		<li>2.1.2 の手順で、溶液の 100 μ l 堆積 96 ウェル プレートの各ウェルにシード細胞。</li>
		<li>井戸の底にセルを均等に分散する 5 分間室温でプレートを残してください。</li>
		<li>インキュベーターにプレートを置き、37 ° C で 12 に 16 時間 (最大) プレートに付着する細胞は、</li>
	</ol>
</li>
</ol>日 2
<ol start="2"><li>
スクラッチ傷アッセイ
	<ol>
<li>インキュベーターから手順 2.1 準備プレートを取り外します。</li>
		<li>フードの下, 製造元のプロトコルに従って商業人が負傷したデバイスを使用して傷を作る。</li>
		<li>すぐに各もピペットを使用して合わせられた円錐形の先端、傷口に触れないように世話をからメディアを削除します。</li>
		<li>吸引を繰り返し、各ウェルの 37 ° C に温めて CM の 100 μ L を使用して 2 回洗浄を行う。</li>
		<li>洗浄のステップ後適応の円錐形の先端のピペットを使用して CM を削除します。</li>
		<li>各ウェルに 100 μ L 媒体の治療条件ごとに特定を追加します。</li>
		<li>井戸の中の任意の気泡を作成するようにしてください。逆ピペッティング テクニックはここで役に立つかもしれません。また、注射針の泡を削除します。</li>
		<li>ビデオ顕微鏡の適応のラックに板を配置します。</li>
		<li>画像の品質を向上させるため、プレートの下側に結露を避けるために最初のスキャンの前に、少なくとも 15 分間ウォーム プレートを許可します。</li>
		<li>まあ 1 つのイメージでビデオ顕微鏡のソフトウェアを使用してスキャンのスケジュールをプログラムします。最大 2 h 間隔が侵攻移行実験のため必要です。実験の目的は、ビデオを作成することは場合、は、最大 30 分の間隔が優先されます。</li>
		<li>実験の終わりには、負傷のデバイスを丁寧に洗うし、各メーカーが示す 4 つの洗浄のステップに従ってください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3、4、および 5 の日
<ol start="3"><li>
ビデオ顕微鏡を使用して移行の解析
	<ol>
<li>24 h、最大 5 日間の最小、監視し、細胞遊走をチェックします。</li>
		<li>セル タイプごとに適応した適切なセル マスクを使用して、セルの移行を分析します。各セルライン適応セル マスクを得るためには、特定のセルのイメージのコレクションを使用してソフトウェア定義の処理セルを生成します。</li>
		<li>カーブをトレースし、データを分析し、結果を比較するために使用できます、スプレッドシートにエクスポートします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. スクラッチ傷の試金: 細胞浸潤
メモ: 手順は、細胞の種類ごとに合わせられなければなりません。
日 1
<ol><li>
細胞播種
	<ol>
<li>細胞播種手順 2.1 で説明されているように同じプロトコルを使用します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>日 2
<ol start="2"><li>
ECM の準備
	<ol>
<li>4 ° C で使用する前に、少なくとも 12 h のマトリックスを解凍します。集計が表示されていないことを確認します。集計が表示されている場合は、集計が消えるまで長い期間の 4 ° C でマトリックスを維持します。氷の行列をしてください。冷却のピペット チップを使用します。 注: マトリックスを固めるいない場合は 4 ° C で保管</li>
		<li>氷上で 5 分間遠心管を冷やします。</li>
		<li>取る CM 冷蔵庫から 4 ° C に冷却し、300 μ g/mL の濃度が最終的な冷却マイクロ遠心チューブ用の行列を希釈します。</li>
		<li>Prediluted 行列を用いたマイクロ遠心チューブ用を 4 ° C の冷凍庫に戻る 注: 冷却ラック マイクロ遠心チューブ用の適応実験を通して 4 ° c 管を維持するため便利です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>日 2
<ol start="3"><li>
スクラッチ傷アッセイと ECM の治療
	<ol>
<li>インキュベーターから 3.1 の手順で作製したプレートを取り外します。</li>
		<li>フードの下, 製造元のプロトコルに従って商業人が負傷したデバイスを使用して傷を作る。</li>
		<li>すぐに各もピペットを使用して傷に触れないように世話適応の円錐形の先端とからメディアを削除します。</li>
		<li>2 回吸引の手順を繰り返し、37 ° C に温めて CM の 100 μ L を使用してセルを洗浄して</li>
		<li>第 2 洗浄後、5 分間その温度を平衡に 4 ° C の定温器にプレートを配置します。</li>
		<li>世話を端から慎重にピペットと傷口に触れることを避けるために円錐形の先端を吸引ピペットの各ウェルから寒い中を削除します。</li>
		<li>4 ° C で冷却の円錐形の先端を使用して各ウェルに prediluted マトリックスの 50 μ L を追加します。</li>
		<li>37 ° C で 30 分間のインキュベーターでプレートを配置します。 注: 37 ° C で prewarmed サポート ラック 96 ウェル プレートの温暖化を加速させると便利です。</li>
		<li>インキュベーターからプレートを外し、治療条件ごとに示されているように、各ウェルに 100 μ L の適応の CM を追加します。</li>
		<li>井戸の中の任意の気泡を作成するようにしてください。逆ピペッティング テクニックはここで役に立つかもしれません。また、注射針の泡を削除します。</li>
		<li>ビデオ マイクロ スコープで適合ラックに板を配置します。</li>
		<li>画像の品質を向上させるため、プレートの下側に結露を避けるために最初のスキャンの前に、少なくとも 15 分間ウォーム プレートを許可します。</li>
		<li>まあ、スクラッチ傷スキャン モードで 1 つのイメージでビデオ顕微鏡のソフトウェアを使用してスキャンのスケジュールをプログラムします。2 h の間隔の最大値は、侵攻移行実験に必要な。実験の目的は、ビデオを作成することは場合、は、最大 30 分の間隔が優先されます。</li>
		<li>実験の終わりには、負傷のデバイスを丁寧に洗うし、各メーカーが示す 4 つの洗浄のステップに従ってください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3、4、および 5 の日
<ol start="4"><li>
ビデオ顕微鏡を用いた細胞浸潤の解析。
	<ol>
<li>2.3 の手順を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-enhanced+cell+migration%2Finvasion+process%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review.</a> Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).</li>
<li>Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+E-cadherin+and+integrins+in+mesoderm+differentiation+and+migration+at+the+mammalian+primitive+streak%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak.</a> Development. 118 (3), Cambridge, England. 829-844 (1993).</li>
<li>Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+and+cancer+stem%28-like%29+cells+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).</li>
<li>Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases%3A+biologic+activity+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications.</a> J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).</li>
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<li>Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15576902">Wound-healing assay.</a> Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 23-29 (2005).</li>
<li>Piaton, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+recommendations+and+best+practice+guidelines+for+May-Gr%C3%BCnwald-Giemsa+staining%3A+literature+review+and+insights+from+the+quality+assurance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Path%22%5BJournal%5D)">Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance.</a> Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance%3A+cancer+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+lett%22%5BJournal%5D)">Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell.</a> Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+ion+irradiation+withstands+cancer+stem+cells%E2%80%99+migration%2Finvasion+process+in+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+%28HNSCC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC).</a> Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).</li>
<li>Gilormini, M., Wozny, A. -S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+a+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Subpopulation+Having+Stem+Cell+Characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics.</a> J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

我々 はここに細胞浸潤と移行過程を研究する 2 つの異なるモダリティを報告します。このプロセスの分析は、がん幹細胞10,11と呼ばれる癌細胞の亜集団の増加運動によって説明されるかもしれない転移再発に関与する因子を理解することが重要です。
ボイデン室実験は最も頻繁に使用される 1 つを探索する技術細胞浸潤と移行。この手法は実験者の専門知識に大きく依存して、このアプローチの利点の 1 つはその再現性です。細胞数は手動、実験者によって異なります。多くの重要なステップは、標準化し、各セルラインに固有走化性因子と飢餓の適切な媒体の使用を確保するなどの世話を続けてする必要があります。綿棒と上部の膜からのセルの削除も最適な結果を確保し、図 2 aに示すように最適ではない結果を回避する重要です。細胞運動、侵略、および 3 次元 (3 D) 多孔質膜を通る移行能力評価にこの試金を使用する場合、コマ撮り実験を通して細胞を追跡す...

細胞浸潤と移行治療1への抵抗の主な原因である癌細胞の普及に関与しているし、局所または転移性がん治療2再発につながることができます。上皮間葉転換 (EMT) は、細胞浸潤移行の癌細胞からに切り替えると、上皮間葉系の表現型の初期プロセスです。E-カドヘリンは上皮性の表現型3の細胞マーカーと N 型カドヘリンおよびビメンチンの発現増加間葉系表現型4の特徴であります。移行は、マトリックス分解酵素5の作用により細胞外のマトリックス (ECM) を侵略する癌細胞の本質的な能力によっても異なります。
この侵略 – 移行メカニズムは、頭頸部がん6を中心に、多くの場所で癌のため記載されています。多くの研究者は、がん細胞がこの知識は新たな治療戦略につながることを願って発信方法をよりよく理解する移行と侵入のプロセスに焦点を当てています。信頼性が高く、再現性のある試金を使用してこれらの研究を実行することが重要です。
細胞の運動性のin vitro解析は挑戦することができます。何年も前に開発、ボイデン室アッセイに侵攻-移行解析7の標準と見なされます。しかし、それは時間がかかるし、はしばしば不正確。2 番目のテストは、創傷治癒の試金8、含み細胞の単層培養に傷を作り、細胞浸潤と一定の時間間隔で移行の画像をキャプチャします。この手法は、2 つの連続したテストの結果の大きい変化のため広く批判されています。しかし、特に、顕微鏡での近代的な技術のアプリケーション スクラッチ傷アッセイの再現性の向上が。ビデオ顕微鏡インキュベーターで簡単に導入することができ、細胞遊走のリアルタイム画像を生成することができます。これらのデバイスは顕微鏡データを記録し、時間をかけて傷細胞合流点の自動解析を提供します。本稿の目的はボイデン室分析と最適化されたスクラッチ傷の試金を記述する、長所とそれぞれのアプローチの弱点を議論します。

<table><tbody><tr><td>子牛胎児血清ゴールド</td><td>GEヘルスケア</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン 水溶性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396-100MG</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン 100 X</td><td>Dominique Dutscher</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>プロメガ</td><td>G5021</td>溶液は<td>、非常に不安定</td></tr>な<tr><td>Z1コールター粒子</td>ベ<td>ックマンコールター</td><td>6605698</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>オリンパス&nbsp;</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>SQ20B細胞株</td><td>John Little'からの贈り物s</td> <td>Laboratory-Wound</td><td></td></tr> <tr><td>Maker</td><td>Essen Bioscience</td><td>4494</td><td>安全で乾燥した場所に保管</td></tr><tr><td>96ウェル ImageLock プレート</td><td>Essen Bioscience</td><td>4379</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox 96F System with CoolSink 96F</td><td>Essen Bioscience</td><td>1500-0078-A00</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox with M30 System</td><td>Essen Bioscience</td><td>1500-0078-A00</td><td></td></tr><tr><td>Boyden Insert</td><td>ドミニク・ダッチャー</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>ボイデンコーティングインサート</td><td>ドミニク・ダッチャー</td><td>354483</td><td>ストア -20 &deg;C</td></tr><tr><td>コンパニオン 24ウェルプレート</td><td>ドミニク・ダッチャー</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>BD マトリゲル標準</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>BD 354234</td><td>-20°C.&nbsp;</td></tr><tr><td>RAL 555 染色キット</td><td>RAL 診断</td><td>&nbsp;361550</td>安全で<td>乾燥した場所に保管</td></tr><tr><td>するマイクロ遠心チューブ</td><td>Eppendorf33511</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

細胞浸潤および移行プロセスの評価: ビデオ顕微鏡ベースのスクラッチの比較創傷アッセイと boyden 教授区域の試金

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

腫瘍細胞の浸潤と移行の能力は、癌の進行や再発の主な要因です。多くの研究は、新しい治療戦略の開発の目的で、がん細胞を普及させる方法を理解するための移行と侵攻能力を探検しました。これらの能力の分子・細胞基盤の解析は、細胞移動の特性と細胞骨格と細胞の微小環境の物理化学的性質につながっています。長年にわたりボイデン室アッセイとスクラッチ傷アッセイは、細胞浸潤と移行を検討する標準的な手法をされています。ただし、これらの 2 つの手法には、制限があります。ボイデン室アッセイは難しく、時間がかかり、スクラッチ傷の試金、低再現性。顕微鏡、特に現代の技術の開発は、スクラッチ傷測定の再現性を増加しています。強力な解析システムを使用して、「インキュベーター」ビデオ顕微鏡は細胞の遊走と浸潤の自動リアルタイム分析を提供するために使用できます。本稿の目的は、レポートおよび細胞浸潤と移行を研究するために使用 2 つの試金を比較する: ボイデン室アッセイと、最適化された体外ビデオ顕微鏡ベース スクラッチ傷の試金。

我々 は細胞浸潤と移行を分析する 2 つの方法をここに報告します。図 1は、ボイデン室実験を示します。挿入は走化性因子中、コンパニオン プレートに配置され、セルは CM で播かれます。膜をコーティングすることができます (移行法) や (浸潤アッセイ) をコーティングします。S cm 上部チャンバーに細胞がシードされます。下院は、走化性因子として CM でいっぱいです。セルは、2 倍の時間の前に固定されています。
図 2は、セル固定後・ ボイデン ・膜を示します。図 2 aは、最適ではない結果は、細胞膜の面の上にクラスターを示しています。図 2 bは、細胞固定し、膜上のブルーのステンド グラスに最適な結果を示していま...

細胞浸潤と移行の解析のための 2 つの方法の事例分析: ボイデン室アッセイと体外ビデオ顕微鏡を用いた創傷治癒アッセイ。これらの 2 つの実験のプロトコルの記述とのメリットとデメリットを比較します。

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

この実験の全体的な目標は、細胞の浸潤と移動の研究に使用される2つのアッセイ、ボイデンチャンバーアッセイ、および最適化されたin vitroビデオ顕微鏡ベースのスクラッチ創傷アッセイを報告し、比較することです。これらの実験は、最も関連性の高い方法の選択など、侵略と移住の研究分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この最適化されたin vitroビデオ顕微鏡ベースのスクラッチ創傷アッセイの主な利点は、治療条件間の再現性と正確な比較を提供することです。この方法は細胞の遊走と浸潤を評価できますが、治癒や組織再生などの他の研究分野にも適用できます。アッセイ1日目の72時間前に、175平方センチメートルのフラスコに25ミリリットルの培養培地中の1/6細胞に10回2回播種することにより、SQ20B細胞を調製します。細胞が摂氏37度で80%の細胞合流まで増殖するのを待ちます。トリプシン処理と細胞計数後の 1 日目に、25 平方センチメートルのフラスコに 25 平方センチメートルのフラスコに 6 倍の細胞密度で細胞を播種し、3 ミリリットルの培養培地に 1/5 細胞を入れます。細胞を摂氏37度で24時間インキュベートします。翌日、各フラスコの培地を3ミリリットルの低ウシ胎児血清培地に交換して細胞を飢餓状態にします。摂氏37度のインキュベーターで細胞を24時間飢餓状態にします。浸潤アッセイのためには、細胞飢餓開始から12時間後にコーティングされたボイデンチャンバーを調製します。各ボイデンチャンバーをコンパニオンプレートに入れます。コーティングされた各チャンバーに500マイクロリットルの飢餓細胞培地を追加します。翌日、3日目に、コンパニオンプレートを使用して走化性物質を調製します。24ウェルコンパニオンプレートの各ウェルに、10%FBS、ヒドロコルチゾン、ペニシリン、ストレプトマイシンを含む750マイクロリットルの完全な培地を充填します。上部チャンバーをプレフィルドコンパニオンプレートに移し、気泡を避けます。インベージョンアッセイでは、各Boydenチャンバーから450マイクロリットルの培地を慎重に取り出します。トリプシン化し、飢餓状態のSQ20B細胞をカウントした後、0.1%BSA培地の500マイクロリットル中の1/4細胞に1/4細胞に10×10を3回播種し、1ミリリットルあたり1/4細胞に10×6の最終希釈を与える。ボイデンチャンバーを摂氏37度のインキュベーターに24時間置きます。4日目に、コンパニオンプレートから各インサートを取り出し、綿棒を使用して上部チャンバーから細胞を慎重に取り出します。その後、各インサートを個別に固定して染色し、メーカーの指示に従って染色キットを使用してMay-Grunwald Gemsaの着色を取得します。5日目に顕微鏡分析を行います。インサート付きのコンパニオンプレートを20倍位相差顕微鏡に挿入し、メンブレン下部で移動した各細胞をカウントします。アッセイの1日目の72時間前に、175平方センチメートルフラスコ内の25ミリリットルの培養培地に1/6 SQ20B細胞に10回2回播種し、細胞を80%細胞コンフルエンスまで増殖させます。トリプシン処理および細胞計数後の1日目に、SQ20B細胞の希釈済みサンプルを、1ミリリットルあたり10の1/5細胞の4倍の密度で生成します。100マイクロリットルの細胞溶液を96ウェルプレートの各ウェルに分注して、各ウェルの100マイクロリットルあたり1/4細胞に10の4倍の最終密度を与える。プレートを摂氏37度のインキュベーターに入れ、細胞をプレートに12〜16時間接着させます。翌日、市販の傷害装置を使用してプレートをフードに持っていき、傷つけます。巻線メーカーの上部を取り外し、ウォッシュボート溶液にセットします。プレートをベースプレートホルダーに挿入し、プレートカバーを取り外します。ピンブロックの後部ダボをベースプレートの後部穴に導いて、ピンブロックを交換します。黒いレバーを押したまま、黒いレバーを押し続けながらピンブロックを持ち上げます。円錐形の先端が適合したピペットを使用して、傷口に触れないように注意しながら、すぐに各ウェルから培地を取り出します。各ウェルに37°Cに温めた細胞培地100μリットルを各ウェルに加えて細胞を洗浄します。2回目の洗浄後、先端が円錐形のピペットを使用して細胞培地を吸引します。次に、各処理条件に固有の100マイクロリットルの培地を各ウェルに追加して、ウェルに気泡が発生しないようにします。96ウェルプレートをビデオ顕微鏡の適合ラックに置きます。ビデオ顕微鏡ソフトウェアプログラムを使用して、ウェルごとに1つの画像でスキャンのスケジュールを作成します。移民侵入実験には、最大 2 時間の間隔が必要です。実験の目的がビデオを作成することである場合は、最大 30 分の間隔が望ましいです。各細胞タイプに適合した適切なセルマスクを使用して、最短24時間、最長5日間、細胞遊走をモニタリングおよびチェックし、細胞遊走を解析します。各細胞株に適合した細胞マスクを取得するには、特定の細胞画像コレクションを使用して、ソフトウェアから細胞処理定義を生成します。曲線をトレースし、データをスプレッドシートにエクスポートして、結果の分析と比較に使用できます。細胞浸潤アッセイの準備として、細胞遊走アッセイで実証したのと同じ方法でSQ20B細胞をシードし、インキュベーター内で96ウェルプレートをインキュベートします。アッセイの2日目に、細胞外マトリックスを調製します。使用前に少なくとも12時間、マトリックスを摂氏4度で解凍し、骨材が見えないことを確認してください。微量遠心チューブを氷の上で5分間冷やします。予冷した微量遠心チューブで摂氏4度に予冷した円錐形の先端でマトリックスを希釈し、摂氏4度に冷却した細胞培地でマトリックスを希釈し、最終濃度300マイクログラム/ミリリットルを得ます。マトリックスをあらかじめ希釈したマイクロ遠心チューブを冷蔵庫で摂氏4度に保ちます。インキュベーターから96ウェルプレートを取り出します。ボンネットの下では、前に示したように、製造元のプロトコルに従って市販の傷害装置を使用して傷を作ります。先端が円錐形のピペットを使用して、各ウェルから培地をすぐに取り出し、傷口に触れないように注意してください。摂氏37度に温めた100マイクロリットルの細胞培地を使用して細胞を2回洗浄します。2回目の洗浄後、プレートを氷の上に5分間置き、温度を平衡化します。端から慎重にピペットでピペットを動かし、傷口に触れないように注意しながら、各ウェルから冷たい培地を取り出します。摂氏4度で予冷した円錐形の先端を使用して、各ウェルに50マイクロリットルの予め希釈されたマトリックスを追加します。プレートを摂氏37度のインキュベーターに30分間置きます。30分後、各治療条件に示されているように、適応した細胞培地100マイクロリットルを各ウェルに加えます。プレートをビデオ顕微鏡の適合ラックに置きます。その後、スキャンをプログラムし、細胞移動アッセイで実証されたようにビデオ顕微鏡分析を行います。細胞固定後のボイデンメンブレンの代表的な結果を示します。最適でないメンブレンは、メンブレンの上側に細胞クラスターがあり、解釈できない結果をもたらします。対照的に、最適なメンブレンは、メンブレンの下部に青色で染色された可算細胞を持っています。スクラッチ創傷アッセイの最適な結果は、ゼロ時間、15時間、および30時間での創傷治癒のこれらの画像によって示されています。質の高い実験の基準は、線状創傷であること、創傷に細胞片が観察されないこと、および細胞のコンフルエンスが最適であることです。パネルAに示すように、90%コンフルエンスは創傷治癒アッセイに最適な細胞密度であり、パネルCは低細胞密度の例を示し、パネルBは細胞ペレットの不十分な洗浄によって引き起こされる細胞クラスターを示しています。ビデオ顕微鏡ソフトウェアを使用して得られた創傷治癒のこのグラフ表現は、4つの治療条件の時間に応じた創傷細胞コンフルエンスのパラメータの定量化を示しています。併用療法は細胞遊走を有意に減少させることが観察された。このビデオを見れば、細胞の移動と浸潤プロセスの評価方法について十分に理解できるはずです。

evaluation-cell-invasion-migration-process-comparison-video

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

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Scratch Wound Migration Assay と Spheroid Sprouting Assay を活用した機能的および分子レベルでの血管新生の調査

学ぼう 細胞浸潤と移行の評価法として、ビデオ顕微鏡ベースのスクラッチ創傷アッセイとBoydenチャンバー法を比較する。SQ20B細胞を用いた両手法の利点と限界を解説し、創傷治癒や組織再生研究への応用可能性も示す。

細胞浸潤および移行プロセスの評価: ビデオ顕微鏡ベースのスクラッチの比較創傷アッセイと boyden 教授区域の試金

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