の実験的マウスモデルにおけるプッシー接種とサンプル採取のためのプロトコルカンジダ膣炎
December 8th, 2011
の評価に使用するキー技術カンジダ膣炎が説明されています。メソッドは、腰リンパ節を排出するから膣標本とリンパ球の迅速な収集が可能になります。これらの技術は、女性の下部生殖管の他の疾患のマウスモデルを生じさせることができる。
この手順の全体的な目標は、膣カンジダ症の実験動物モデルを使用して、膣真菌の負荷を定量化する手段として使用することに関連する特定の手続き上の問題を実証すること、および免疫学的および組織学的アッセイなどの特定のアッセイで膣またはリンパ球を使用することです。これは、最初にエストロゲン治療マウスで膣接種技術を実証することによって達成されます。次に、マウスを安楽死させた後、カンジダを回収するために膣洗浄を行います。
その後、膣組織および/または膣ドレナージリンパ節が抽出されます。洗浄液を顕微鏡で観察して、膣上皮細胞に関連するカンジダを示したり、寒天に播種して膣真菌の負荷を定量化したりできます。細胞画分の塗抹標本は、上皮細胞およびリンパ球の染色にも使用できます。
したがって、この手法を実証することの主な利点は、膣炎の動物モデルのユーザーがそれを最も効率的かつ効果的に行うことができるようにすることです。そして、この技術を通じて答えられている主要な問題は、膣炎と生態学の分野であり、宿主の免疫応答、細胞分布、薬物の有効性、免疫療法の有効性、さらには免疫化の効果などの主要な質問に答え、技術を実証しています。今日は私の研究室の大学院生、矢野純子さん、ベータエストラジオールの注射を投与してから3日後にマウスにCアルビカンスを感染させます。
まず、マウスを平らなgRED面に固定してグリップします。次に、2本の指で尾の付け根を持ち、膣口が手前を向くように腰を上に持ち上げます。ピペットチップを膣内腔に約5ミリメートルの深さまで挿入し、接種懸濁液を最大20マイクロリットルまでピペットで挟みます。
この手順は、マウスの負担を最小限に抑えるために、できるだけ迅速かつ穏やかに完了してください。希望する潜伏期間の後、施設のプロトコルに従って動物を安楽死させます。次に、2本の指でマウスの尾の付け根を下にして、膣口がピペットで露出するようにします。
100マイクロリットルの滅菌PBSを膣内腔に導入し、吸引と攪拌を繰り返しながら洗浄を行います。ピペットチップが細胞で詰まった場合は、閉塞している細胞を分注し、残りのPBSで破壊を続けます。洗浄液をマイクロ遠心チューブに集めます。
膣洗浄手順に続いて、マウスを仰向けに置き、鼠径部を70%エタノールで飽和させます。一対の鉗子を使用して、尿口を上に持ち上げて、膣口が露出するようにします。湾曲した一対の鉗子を膣内腔に挿入し、鉗子をしっかりと握ったまま子宮頸部を配置します。
膣腔から子宮頸部を摘出し、膣口の付け根で膣を切除し、手術用ハサミで膣から子宮頸部を切除します。膣組織が退縮しているため、元の向きを維持するために反転させるか、動物を背中に乗せて腰椎リンパ節切除のために横切開を行ってシートに開きます。腹部を70%エタノールで飽和させます。
下腹部から胸部に向かって横切開を行い、両手の鉗子を使用して内臓を露出させます。腸を上に動かして、中央の血管が見えるようにします。下大静脈と腹部大動脈を見つけます。
一対の腰椎リンパ節は、腎臓の起点と総腸骨動脈のほぼ中間に位置する腹部大動脈に隣接して識別できます。これらのリンパ節は、弾力性のある質感によって脂肪組織と視覚的に区別でき、脂肪組織と比較して色が薄く不透明です。また、感染した動物では、接種していない動物に比べて著しく大きくなります。
動物は、リンパ節の下に微小鉗子を配置し、その後、リンパ節を周囲の組織から分離するためにゆっくりと引き上げることによってリンパ節を切除しました。組織を切除した後、リンパ節を滅菌済み金網スクリーンに移し、約10ミリリットルのハンクの平衡塩溶液を含む滅菌ガラスシャーレの中に置かれました。リンパ球を単離するには、書面によるプロトコルを参照してください。
少なくとも4日前に接種されたマウスからの膣洗浄液の細胞画分は、典型的には、湿式マウント顕微鏡法によって示されるように、カンジダ上皮細胞および細胞浸潤物からなる。カンジダは、PHAと酵母の存在によって識別できます。ここでは、膣洗浄液の塗抹製剤が染色されています。
パパニコロウ塗抹標本法を使用して、上皮細胞と浸潤性白血球を調べます。これは、トラクリアローブによって識別できるように、主要な細胞が好中球です。好中球は、もしあったとしても、接種されていないマウスではほとんど検出されません。この図は、膣の真菌の負担の一例を示しています。
膣洗浄液は特定の時点で収集され、CFU計数のために培養されます。この例では、接種後5日目に液体を連続して収集し、希釈めっきし、48時間インキュベートしました。次に、コロニーをカウントし、膣のコロニー形成またはカンジダによる感染を計算した膣真菌負荷は、エストロゲン処理された接種マウスで数週間持続します。
カンジダは、非エストロゲン処理された接種マウスでは膣のコロニー形成を確立することができませんが、エストロゲン処理された非接種マウスは、時間を通じてカンジダに対して陰性のままです。さらに、膣洗浄は、各時点で別々のマウスで1回行うか、麻酔下で同じマウスで縦方向に行うことができる。この手順を試みるときは、膣への外傷を避けるために動物をしっかりと拘束することを覚えておくことが重要であり、膣組織を抽出するときは、膣真菌の負担を正確に得るために徹底的に洗浄するために必要な時間をかけてください。
脱水症状を防ぐためにPBSを使用し、リンパ節を切除する際やリンパ節細胞の処理中は、細胞の生存能力を維持するために氷上または4度で保管し、主要な静脈や動脈を傷つけないように注意してください。このビデオを見れば、カンジダ性膣炎の実験マウスモデルを使用して、膣真菌の負荷を再現可能に定量化し、特定の免疫学的または組織学的アッセイのために膣またはリンパ組織を切除する方法を十分に理解できるはずです。
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概要
この記事では、実験動物モデルを用いてカンジダ膣炎を評価するための主要な技術について説明します。これらの方法により、膣標本と腰部リンパ節からのリンパ球を迅速に収集することができ、女性の下部生殖器疾患の他のマウスモデルにつながる可能性があります。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 微生物学
- 免疫学
背景
- カンジダ膣炎は女性の生殖器に影響を与える一般的な状態です。
- 免疫反応を理解することは治療法を開発するために重要です。
- 実験モデルは疾患メカニズムの研究に役立ちます。
- 膣カンジダ症は特定の検査を用いて定量化できます。
研究目的
- 膣カンジダ症を研究するための手順技術を実証すること。
- 実験モデルで膣真菌負荷を定量化すること。
- 免疫学的アッセイに膣およびリンパ組織細胞を利用すること。
使用方法
- エストロゲン処理されたマウスへの膣内接種技術。
- マウスを安楽死後にカンジダを回収するための膣洗浄。
- 膣組織および排水リンパ節の抽出。
- 洗浄液の顕微鏡検査とアガープレートへの塗布。
主な結果
- 膣洗浄からのカンジダの成功的な回収。
- アガープレートを用いた真菌負荷の定量化。
- 染色による上皮細胞およびリンパ球の同定。
- 将来の研究のためのモデルの実現可能性の証明。
結論
- 概説された技術は膣カンジダ症を研究するための堅牢な方法を提供します。
- このモデルは女性の下部生殖器の他の疾患に適応できます。
- 将来の研究はこれらの知見に基づいて免疫反応を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The experimental mouse model of Candida vaginitis provides a robust platform for quantifying vaginal fungal burden and evaluating host immune responses in a controlled, disease-relevant system. This model enables reproducible assessment of infection dynamics and immunological endpoints, supporting early discovery and mechanistic de-risking for antifungal and immunotherapeutic candidates. Its translational alignment with human infection properties enhances predictive confidence for preclinical portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of host-pathogen interactions and immune response mechanisms in a physiologically relevant context.
- Supports functional target validation by quantifying infection and immune cell infiltration without immunosuppression confounders.
- Facilitates mechanistic de-risking for antifungal and immunomodulatory strategies.
Screening & Assay Development
- Provides standardized protocols for inoculation, sample collection, and fungal burden quantification.
- Delivers reproducible, quantitative outputs such as CFU enumeration and immune cell profiling.
- Enables longitudinal sampling from the same animal, supporting robust assay development and screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with human infection immunology, enhancing translational relevance for candidate evaluation.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling immunological and histological endpoint analysis.
- Permits risk-adjusted advancement of antifungal and immunotherapeutic leads based on quantitative infection and immune readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This model integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, target validation, and quantitative assessment of infection and immune responses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven studies of host-pathogen interactions and immune mechanisms.
- Screening: Provides validated, reproducible assays for fungal burden and immune cell quantification.
- Analytics: Generates quantitative outputs (CFU counts, cell profiles) for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Offers continuity for immunological and infection endpoints relevant to human disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating diverse infectious and immunological hypotheses in the lower female genital tract.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in antifungal and immunological research.
- Operational Value: Standardizes infection and sampling protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust preclinical data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of therapeutic candidates targeting mucosal infections.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal handling, infection models, and immunological assays.
- Needs access to instrumentation for sample collection, microscopy, and quantitative plating.
- Demands cross-team standardization of protocols for reproducibility across studies.
- Adaptable to other infectious disease models of the lower female genital tract with protocol modifications.
- Careful handling and sample processing are critical to maintain cell viability and data integrity.
