の実験的マウスモデルにおけるプッシー接種とサンプル採取のためのプロトコルカンジダ膣炎

本手順の全体的な目的は、腟カンジダ症の実験動物モデルを用いて腟内の真菌量を定量化すること、および免疫学的・組織学的解析などの特定のアッセイに腟細胞やリンパ系細胞を利用することに関連する、具体的な手順上の課題を提示することです。まず、エストロゲン投与マウスを用いて腟内接種の手法を実演します。次に、マウスを安楽死させた後、腟洗浄を行いカンジダを回収します。

次に、膣組織および／または膣の排液リンパ節を摘出します。洗浄液を顕微鏡で観察して膣上皮細胞に付随するカンジダを確認するか、あるいは寒天培地で培養して膣内の真菌量を定量化することができます。また、細胞分画の塗抹標本を用いて、上皮細胞およびリンパ球の染色を行うことも可能です。

この手法を実演する主な目的は、腟炎のアニマルモデルを利用するユーザーが、最も効率的かつ効果的に実施できるようにすることです。本手法を通じて解明される重要な課題は、腟炎およびエコロジーの分野にあり、宿主の免疫応答、細胞分布、薬剤の有効性、免疫療法の有効性、さらに免疫化の影響などの主要な問いに答えるものです。本日は、私の研究室の大学院生である矢野純子が、$\beta$-estradiolを投与して3日後にマウスにC. albicansを感染させる手順を実演します。

まず、マウスが掴まれるように平らなgRED表面で固定します。次に、2本の指で尾の付け根を持ち、腟口がこちらを向くように腰を持ち上げます。ピペットチップを腟腔内へ約5 mm挿入し、接種懸濁液を20 µLまで吸引します。

マウスのストレスを最小限に抑えるため、この工程は可能な限り迅速かつ穏やかに行ってください。所定のインキュベーション期間後、施設で定められたプロトコルに従って動物を安楽死させます。次に、2本の指でマウスの尾の付け根を持って下方へ固定し、ピペットで膣口が見える状態にします。

滅菌済みPBS 100 µLを膣腔内に注入し、吸引と攪拌を繰り返して洗浄を行います。ピペットチップが細胞で詰まった場合は、詰まった細胞を排出し、残りのPBSで洗浄を続けます。洗浄液をマイクロ遠心チューブに回収します。

膣洗浄の手順の後、マウスを仰向けに寝かせ、鼠径部を70%ethanolで十分に濡らします。ピンセットを用いて尿道口を上方に持ち上げ、膣口を露出させます。曲がりピンセットを膣腔内に挿入し、ピンセットでしっかりと保持しながら子宮頸部を確認します。

腟腔を通して子宮頸部を抽出し、腟口の基部で腟を切除した後、外科用鋏を用いて腟から子宮頸部を取り出します。腟組織は内反しているため、元の方向を維持するように反転させるか、あるいは動物を背臥位にして腰部リンパ節を摘出するために、側切開を加えてシート状に開きます。腹部を70% ethanolで飽和させます。

下腹部から胸部にかけて側方切開を行い、両手のピンセットを用いて内臓を露出させます。腸を上方へ移動させ、中心血管が見えるようにします。下大静脈と腹部大動脈を確認します。

腹大動脈に隣接し、腎動脈と総腸骨動脈の分岐点の中間付近に位置する一対の腰リンパ節を確認できます。これらのリンパ節は、弾力のある質感によって脂肪組織と視覚的に区別でき、脂肪組織に比べて色が淡く不透明です。また、非接種個体と比較して、感染個体では明らかに増大しています。

マイクロ鉗子をリンパ節の下に挿入し、周囲の組織から慎重に引き上げて分離させることで、動物からリンパ節を摘出します。組織を摘出した後、約10 millilitersのHank's balanced salt solutionを入れた滅菌済みのガラス製ペトリ皿の中に配置した、滅菌済みのワイヤーメッシュスクリーン上にリンパ節を移します。リンパ球の分離については、記述プロトコルを参照してください。

少なくとも4日前に接種したマウスから採取した膣洗浄液の細胞画分は、ここに見られるウェットマウント顕微鏡観察の結果のように、通常はカンジダの上皮細胞と細胞浸潤物で構成されています。カンジダは、酵母だけでなくPHAの存在によって同定できます。ここでは、膣洗浄液の塗抹標本を染色しています。

パップスミア法を用いて、上皮細胞および浸潤白血球を検査します。白血球の主成分は好中球であり、これは分葉核によって識別可能です。非接種マウスでは、好中球はほとんど、あるいは全く検出されません。この図は、腟内の真菌負荷の例を示しています。

腟洗浄液を特定の時点で採取し、CFU計数のために培養します。この例では、接種後5日目に洗浄液を採取し、段階希釈してプレートに播種し、48時間培養しました。その後、コロニー数を計測して腟内の真菌量を算出します。エストロゲン投与済みの接種マウスでは、カンジダによる腟への定着または感染が数週間持続します。

エストロゲン未投与の接種マウスではカンジダの腟内定着が認められない一方で、エストロゲン投与済みの未接種マウスは、全期間を通じてカンジダ陰性のままとなります。また、腟洗浄は、各タイムポイントで別々のマウスを用いて1回のみ行うか、または麻酔下で同一マウスを用いて経時的に行うことができます。この操作を行う際は、腟への外傷を避けるために動物をしっかりと固定することが重要です。また、腟組織を抽出する際に正確な腟内真菌量を算出できるよう、時間をかけて十分に洗浄してください。

脱水を防ぐため、静止状態のPBSを使用してください。また、リンパ節を摘出する際は、主要な静脈や動脈を損傷させないよう注意してください。リンパ節細胞を処理する際は、細胞生存率を維持するため、氷上または4°Cで保持してください。このビデオを視聴することで、カンジダ膣炎の実験マウスモデルを用いて、膣内の真菌量を再現性高く定量し、特定の免疫学的または組織学的解析のために膣組織やリンパ組織を摘出する方法について十分に理解できるはずです。