皮質ネットワークの開発で機能的カルシウムイメージング

この動画の全体的な目標は、カルシウム感受性蛍光インジケーターを使用して、皮質脳スライスの発達からネットワーク活動を測定する方法を示すことです。DY脳スライスは、若いマウスの発達中の経腸皮質から作られます。ニューロンとアストロサイトの両方にカルシウム依存性マーカーがロードされています。

カルシウム依存性色素の蛍光の変化は、細胞活性の変化を反映しています。アストロサイト、ミクログリア、内皮細胞などの非神経細胞は、特定のマーカー色素を使用して染色できます。皮質ネットワーク活動は、タイムラプスを使用して記録されます 多光子イメージング細胞は、関心領域を通じて画像の3Dスタックを作成することにより、ネットワーク内で検出されます。

その後、複数の細胞にわたる細胞蛍光の変化を解析して、発達中の皮質ネットワークの活性を読み取ることができます。発達中の神経系における活動の特徴的なパターンは、自発的な同期ネットワーク活動です。同期活動は、無傷の脊髄皮質や、自発的な活動ニューロンの期間中に解離したニューロン培養製剤、火に脱分極したニューロン、単一のスパイク、または活動電位のバーストなど、多くの異なる発達ニューロン領域で観察されています。これには、カルシウム流入につながる電位依存性カルシウムチャネルを含む多くの鉄チャネルが活性化されます。

高度に同期した活動は、フィールド電極またはマルチ電極アレイを使用してローカルネットワークから測定されています。これにより、高い時間サンプリングレートが可能になりますが、細胞活性の統合された読み出しにより、空間分解能が低くなります。神経活動の単一細胞の分解能は、単一ニューロンのパッチクランプ電気生理学を使用して発火率を測定することで可能です。

ただし、ネットワークから測定する能力は、同時にパッチされたニューロンの数に制限されており、通常は1つまたは2つのニューロンのみです。カルシウム依存性蛍光インジケーター色素の使用により、細胞ネットワーク全体での同期活性の測定が可能になりました。この手法は、発達中のネットワークの自発的な活動を記録するために、高い空間分解能と十分な時間的サンプリングの両方を提供します。

URA 2:00 AMエステルなどの蛍光カルシウム感受性指標には、カルシウム鉱山に結合できるカルボン酸基が含まれています。これらの蛍光色素は、1つの光子顕微鏡または2つの光子顕微鏡を使用して、特定の光波長によって活性化されます。色素から放出される光子の数は、カルシウムの結合時に一時的に変化します。

この光子数または蛍光の変化は、デルタFF信号として報告され、ニューロン内のカルシウムレベルの変化に対応します。カルシウム感受性指標の変化の測定は、発生中の細胞におけるネットワーク活動パターンの有用な読み出し尺度です。こんにちは、私はリアンナ・モーティです、そして私の名前はジュリー・アボッツです。

私たちはアムステルダムの大学と解釈神経生理学の学部から来ています。私たちは、カルシウムイメージングを用いて、多焦点イメージングにおけるカルシウム感受性指標を用いて、マウス皮質の組織発生における機能活性を研究しています。このショートムービーの目的は、これらの方法を使用して、神経系のネットワーク発達における自発的および誘発的な活動パターンの両方を測定する方法を示すことです。

若いマウスの頭蓋骨から脳を迅速に取り出して、神経回路の損傷を減らします。氷冷したスライス溶液で脳を解剖します。スライス溶液には、ニューロン記録のためにA TSFで一般的に使用されるナトリウムの代わりに塩化コリンが含まれています。

これらの実験では、発生中のマウスの脳の経腸皮質から脳スライスを作製しています。ペトロ皿の上に濾紙を置き、数ミリリットルのATSFで濡らします。脳を濾紙に移します。

片刃のカミソリの刃を使用して半球を二等分します。2つの半球を分離します。残りの半球で1つを氷のスライス溶液に戻します。

かみそりの刃で小脳を取り除きます。片方の半球をその正中線上にひっくり返し、背側表面から吻側の端に向かって刃をわずかに傾けて約1ミリメートルの切り込みを入れます。脳をひっくり返します。

最近カットされた表面は、綿の鳥と金属のヘラを使用してカットされています。脳を金属切断ブロックに移します。綿の鳥で脳をへらから接着面にそっと押し込みます。

300マイクロメートルの脳のスライスは、若い組織のために切断され、切断速度とブレードの周波数は通常、より成熟した組織に使用されるものよりも遅くなります。切断したら、ガラスピペットを使用して各スライスを移し、スライスを室温で酸素化されたA TSFを含む保持チャンバーに移します。A CSFは、A CSF溶液よりもマグネシウムとカルシウムの比率が高くなります。

記録に使用されるスライスは、回復するために1時間放置されます。カルシウム依存性インジケーターまたは細胞特異的マーカーを細胞にロードするには、染色手順のためにスライスをチャンバーに移す必要があります。市販のチャンバーもありますが、標準的なラボ機器から簡単に組み立てることができ、コストもかかりません。

染色チャンバーを作るには、以下の基本的な実験装置、プラスチック製シャーレ2枚、10ミリリットルシリンジ1本、シリカチューブの一部、半透膜瞬間接着剤付き細胞培養インサート、3つの小さなチューブコネクター、細いボーンニードルが必要です。大きなペトリ皿を取り、側壁に加熱されたロッドで小さな穴を開けます。小さなペトリ皿を取り、シリコンチューブが通過するのに十分な大きさの同様の直径の穴を開けます。

シリコンチューブの一部を穴に通し、小さな皿の内側にループを形成します。瞬間接着剤を使用して、チューブの開放端をシールします。次に、チューブの残りの部分を小さなペトリ皿の内壁に貼り付けます。

小さなシャーレを大きなシャーレの中央に置き、接着します。シリコンチューブの残りの端を取り、ペトリ皿の側壁にある小さな穴に通します。細い針を取り、シャーレ内のシリコンチューブに小さな穴を開けます。

均一なガスパーフュージョンのために、等間隔で穴を開けます。加熱したメスを使用して、半透膜で細胞培養をよく行います。ウェルの上部1センチを切り取り、インキュベーション中にスライスを保持するための浅い皿を残します。

多孔質シリコンチューブに囲まれた小さな皿の中央に浅い皿を置きます。大きな皿の蓋に直径約半分から1センチメートルの穴を開けます。加熱したメスを使用して10ミリリットルのプラスチック注射器を取ります。

シリンジの端を取り外すために角度をつけてカットします。シリンジチューブの切断面に瞬間接着剤を塗布します。これを大きなシャーレの蓋の穴に直接貼り付けます。

シリンジチップの端にチューブコネクタを取り付けます。浅い皿を小さなペトリ皿の中央に置き、多孔質ガスチューブが皿の周りに横たわっていることを確認します。次に、このチューブをカルボゲンガス供給に接続して、スライスに酸素を供給します。

インキュベーション中に、シリンジチップを介してガス供給に直接接続されている大型皿の蓋を元に戻します。これにより、インキュベーション中にスライスに車とガスが供給され、染料の漂白が防止されます。すべての手順はできるだけ少ない光で行われ、染料とスライスの両方が暗闇に保たれます。

スライスホルダーから約1.5ミリリットルのA TSFを染色チャンバーに充填します。インターフェースチャンバーを内部に置き、別のミリリットルのATSFを充填します。組織を健康に保ち、スライスの負荷を良好に保つためには、良好な酸素供給を維持することが重要です。

染色は、染色チャンバーが加熱されている間に色素がニューロンに取り込まれるのを促進するために、約35°Cで行われます。fira 2:00 AM Esterのインジケーター染料を準備します。50マイクログラムのバイアルに9マイクロリットルのDMSOと1マイクロリットルのオン酸を加えます。

DMSOとオン酸。色素が脂質膜を通して取り込まれるようにするための透過剤として機能します。バイアルを15分間ボルテックスして、染料が完全に溶解していることを確認します。

染色のために、各スライスを界面に移します。染色チャンバーに挿入します。スライスの上の関心領域に染料を直接ペットにかけ、染色チャンバーの蓋を閉めます。

スライスを暗闇で20〜40分間インキュベートし、使用するマウスの年齢にもよりますが、放置します。インキュベーション後、スライスをスライスホルダーに戻し、残っている余分な色素を洗い流します。カルシウムイメージングの染色プロトコルは、古い組織にも適応させることができます。

これには、追加のプレインキュベーションステップが必要です。古いスライスを、3ミリリットルのCSFと8マイクロリットルのクレマ4溶液で満たされた浅いインキュベーション皿に移し、0.5%で35°Cに3分間加熱します。次に、スライスをインターフェースに移し、染色チャンバーに挿入し、通常の染色手順に従います。

これらのスライスを非ニューロン細胞、すなわち星状細胞、ミクログリア、および内皮細胞に染色することも可能です。硫黄ルミン1 0 1は、硫黄ドミンの星状細胞を染色するために使用できます。10マイクロモルの溶液を作り、スライスの関心領域に紫色の染料をピペットします。

15分間インキュベートします。スライスを保持チャンバーに戻して、余分な染料を取り除きます。トマトレクチンのFSEコンジュゲートは、ミクログリアおよび内皮細胞を染色することができます。

トマトレクチンの場合は、ミリリットルあたり20マイクログラムの溶液を作ります。スライスの関心領域に染料をペットで塗ります。スライスを45分間インキュベートします。

次に、スライスをもう一度保持チャンバーに戻します。イメージング中、スライスは顕微鏡下で安定している必要があります。通常、金属製のハープは組織を押さえるために配置されますが、スライスの表面を不均一に歪ませる可能性があり、イメージングが回避するための焦点の限られた視野しか与えません。

このスライスは、POLYETHALINEまたはPEI溶液を使用して記録チャンバーに貼り付けられます。PEIは、細胞の表面への接着を少なくとも1時間強化するために使用されるポリマーです。スライスを記録チャンバーに入れる前に、これらのチャンバーに数ミリリットルのPEI溶液を充填して、チャンバーの床を覆います。

まず、蒸留水でチャンバーからPEIを洗い流し、続いてCSF溶液をトランスします。細い絵筆を使用して、スライスをチャンバーの中央に配置します。

吸収性濾紙の小片を使用して、さらにすべてのA CSFを除去します。スライスの端に A CSF がなくなったことを確認します。最後に、半ミリリットルのA CSFを、チャンバーから緩めずにスライスに優しく撫

チャンバーを大きな酸素化インターフェース容器に入れ、暗闇の中でさらに1時間放置します。カルシウム感受性指示薬色素の変化は、1つまたは2つの光子顕微鏡で記録できます。オリンパスの顕微鏡にチタンサファイアレーザーを組み合わせ、神経細胞ネットワークにおける2光子イメージングを可能にしています。

さらに、L VisionのバイオテクノロジートリムスコープシステムとEM CCDハンマーMATSUカメラを使用して、フレームスキャン速度を向上させています。1.6ミリモルのカルシウムと1.5ミリモルのカルシウムを含む酸素化A-T-S-F-A-T-S-Fの安定した流れで、スライスチャンバーを顕微鏡下に配置します。マグネシウムは、白色光を使用してセットアップで約30°Cに加熱されます。

スライス内の関心領域を特定し、サーフェスに焦点を合わせます。照明を消し、録音キャビネットのドアを閉めます。背景の光のレベルを下げるため。

画像の記録と分析には、さまざまな商用ソフトウェアパッケージまたはオープンソフトウェアパッケージが用意されています 私たちの研究室では、Lavis Biotechからの取得にインスペクタソフトウェアを使用しています。イメージングを開始するには、検出用のCCDカメラモードを選択します。インジケーターに関連する波長を設定します。

fira 2:00 AM Esterの場合、トリムスコープソフトウェアで励起を820ナノメートルに設定しました。64 Bスキャンモードを選択します。関心領域に最適なサイズの視野とピクセル解像度を選択します。

画像のサンプリングに必要な場合は、適切なフレームレートとピクセルスピンを選択します。レーザーシャッターを開けて、連続撮影の準備をします。連続イメージングモードを使用します。

ゲインとレーザー強度を調整し、イメージングしたいニューロンネットワークに焦点を合わせます。スキャンを停止します。フレームレートとシーケンス時間のタイムラプス設定を選択します。

タイムラプス撮影後、上20ミクロン、下20ミクロンを1ミクロン刻みでZスタックします。このZスタックは、解析中の細胞検出に使用されます。記録したファイルをTIFF画像のスタックとしてエクスポートします。

結論として、カルシウム指標を使用して、発達中の皮質における同期自発的なネットワーク活動を測定することを示しました。方法論と試薬の詳細については、このフィルムに付属のデータシートを参照してくださいので、ご自分のラボでこの技術をセットアップすることができます。