ホールマウントマッスル分析による再現性のあるマウスの坐骨神経クラッシュと再生のその後の評価

この手順の全体的な目標は、坐骨神経潰潰のシンプルで再現可能な方法と、坐骨神経潰後の筋肉再神経潰の全マウント分析を実証することです。これは、神経への良好なアクセスを確保するための外科的開創器の適切な配置を含む、最初に坐骨神経を露出させることによって達成されます。次に、止血鉗子で神経を粉砕し、木炭で神経に印を付けます。

次に、後肢から坐骨神経によって神経支配された個々の筋肉を取り除きます。最後のステップは、免疫染色後のホールマウント分析のために個々の筋肉を解剖することです。最終的に、結果は、再現性のある坐骨神経潰傷を簡単に行うことができ、筋肉の穴マウントを使用してその後の再生を分析できることを示しています。

この手順の主な利点は、坐骨神経を粉砕し、その後軸索再生をスコアリングするためのシンプルで再現可能な技術を提供することです。この手順は、術後の痛みを最小限に抑えるために、ケタミン1キログラムあたり100ミリグラムとキシラジン1キログラムあたり10ミリグラムのカクテルを使用して手術のためにマウスに麻酔をかけることから始めます。マウスはまた、メロキシカムのキログラムあたり10ミリグラムの皮下注射を受けます。

次に、外科用バリカンを使用して両方の後肢を慎重に剃ります。次に、ナレ脱毛クリームを塗って完全に消耗させます。滅菌綿の先端アプリケーターとベタジン外科用スクラブで肌をきれいにします。

その後、滅菌綿の先端のアプリケーターで眼科用軟膏を目に塗ります。予熱したホメオテーマの毛布の上にマウスを清潔なステンレス鋼板の上に置き、動物の体温を摂氏37度に保ちます。次に、すべての手足をテープで留めます。

膝関節が体と直角になるように、後肢を対称的に配置するように慎重に配置します。その後、顕微鏡下で滅菌ドレープで術野を覆います。正中線を横切って半円形の切開を行います。

皮膚を下にある筋肉組織からやさしく分離し、時々折りたたみます。手術中に手術部位を湿らせておくために、約0.1ミリリットルの滅菌生理食塩水を適用します。次に、大臀筋と大腿二頭筋の前頭部との間の筋膜面を開きます。

外科的制御のための坐骨神経を明らかにすること。対側の坐骨神経は露出して動員する必要がありますが、無傷のまま残します。次に、臀筋組織を休ませて縫合します。

リトラクターと同じ方法で実験的な坐骨神経を露出させます。視覚化を容易にするため。虹彩切除ハサミを使用して、坐骨神経を周囲の結合組織から優しく解放します。

次に、細かい5 45鉗子を使用して、神経を超微細止血鉗子の下顎に置き、3つの筋膜を互いに重ならないように隣接して整列させます。止血鉗子には、先端から1.5mmのところにマークが刻印されています。潰す前に、坐骨神経痛の最も外側の部分をこのマークに沿って置きます。

これにより、均一な幅の粉砕が保証され、粉砕力により平らにされたときに神経が止血鉗子の顎を超えて伸びることはありません。神経が鉗子の先端を超えて伸びている場合、神経は部分的にしか押しつぶされません。クラッシュ部位をマークするために、事前に浸漬して粉末にした止血鉗子の2番目のペアを使用します。

同じ潰れた場所で神経を3回のクリックで15秒間押しつぶします。カーボンマーキングは、初期クラッシュの境界を超えて拡張してはなりません。これは、鉗子をカーボンに事前に浸し、手術部位に広範なカーボンを排除するために、クラッシュ部位の正確なマーキングが必要な場合に特に重要です。

粉末カーボンで鉗子を開きます。次に、それらをそっと閉じます。滅菌ガーゼを使用して、止血剤の外側のカーボンを拭き取ります。

少なくとも3倍の倍率で鉗子をチェックして、破砕面が粉末カーボンで均一にコーティングされていることを確認します。必要に応じて、それらは再び浸され、拭かれます 休息し、反対側と同じ方法で臀筋組織を縫合します。最後に、9ミリメートル反射クリップを使用して皮膚切開部を閉じます。

9ミリ反射クリップが動きを制限することがわかった場合は、より小さな反射クリップまたは6つの自動縫合糸を使用できます。代わりに、マウスを犠牲にした後、4つの筋肉を取り除きます。後肢の脛骨前指伸筋、長腓骨筋、およびヒラメ筋は、結合組織を介して黒いサードコーティングされた皿に慎重に固定されます。

次に、PBSですすいでください。その後、4%パラホルムアルデヒドで30分間固定します。黒いサードでコーティングされたペトリ皿で各筋肉を解剖するには、虹彩切除はさみを使用して腱を取り除きます。

その後、内部の筋繊維を剥がして筋肉を薄くし、終板バンドを含む筋肉の外面を丁寧に温存します。次に、得られた筋肉をベクトルシールドと22 x 40ミリメートルのガラスカバースリップを備えたプラススライドに取り付け、透明なマニキュアで両面をシールします。スライドに適切に取り付けられている場合、nplateバンドはカバースリップに接触している必要があります。

これは、左後肢のその場にあるクラッシュサイトの例です。クラッシュサイトはブラックカーボンで示されます。アスタリスクは、大腿部の筋肉組織を神経支配する脛骨神経の枝を示し、有用なランドマークとして機能します。

クラッシュ手術中、坐骨神経の脛骨分割は青、腓骨骨と緑、そして陰茎と黄色で輪郭が描かれています。この半薄い切片は、止血鉗子で行われる完全な粉砕を示しています。矢印は、ここの繊維が砕かれていることを示しています。

角度のある鉗子で行われた不完全なクラッシュは、別のセミフィンセクションに示されています。矢印は再び砕かれた繊維を示し、矢印は保存された軸索を示します。これらは、マウントの筋肉全体からレンダリングされた画像です。

結合組織の除去とその後の薄化の後、nplate バンドは各筋肉に輪郭が描かれます。ここに示されているのは、スー全体のマウント筋です。坐骨神経潰れの14日後。

矢印は、軸索によって再神経支配された神経筋接合部の領域を示しています。これは、除神経性神経筋接合部のデモンストレーションです。ギャップ43の陽性シュワン細胞プロセスは、矢印で示されています。

この除神経性神経筋接合部には軸索は見られません。このビデオを見た後、静止神経を再現性よく粉砕し、再生の分析のために筋肉ホルモンマウントを準備する方法についてよく理解しているはずです。