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マウスから単離した坐骨神経から始めます。
神経内のニューロンをトランスフェクトして、蛍光細胞質タンパク質を発現させました。
神経は損傷を誘発するために押しつぶされ、縫合糸でマークされました。
部位の損傷した軸索セグメントは変性し、動員されたマクロファージが破片を取り除きます。
シュワン細胞は増殖して誘導トラックを形成し、軸索の再成長を促進する神経栄養因子を分泌します。軸索はこれらのトラックに沿って伸び、神経を再生します。
神経を固定して細胞構造を保存し、付着した非神経組織をすべて除去します。
残留固定液を除去するためにバッファーで洗浄します。
神経を顕微鏡スライド上に置き、封入剤を塗布し、カバーガラスを置きます。
神経を平らにして、軸索を同じ焦点面内に配置してイメージングします。
落射蛍光顕微鏡を使用して、破砕部位から遠位端まで軸索をトレースし、
再生長を測定します。
DRGを神経根と坐骨神経と一緒に、解剖顕微鏡下でマイクロハサミとマイクロ鉗子で慎重に分離します。
次に、坐骨神経を摂氏4度で一晩4%PFAで直接移します。蛍光標識された感覚軸索を解剖顕微鏡で画像化して測定するには、固定坐骨神経の付着した組織と膜をマイクロハサミとマイクロ鉗子で慎重に剥がします。次に、PBSで神経を3回洗浄します。
次に、坐骨神経をスライドの上に置き、まっすぐに保ちます。神経の周りに80マイクロリットルの色あせ防止溶液を加え、その上にカバースリップを置きます。取り付けられた組織全体を圧力で平らにします。
その後、平らにした組織を、モザイク取得と画像処理用のアクセサリを備えた倒立落射蛍光顕微鏡の下に置きます。再生軸索の長さを測定するときは、坐骨神経内の識別可能なすべての蛍光標識軸索を、破砕部位から遠位軸索末端まで
追跡します。
