Name: のサンプル調製結核菌抽出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 学ぶ結核菌のNMRメタボロミクス解析法。培養・細胞破砕・無細胞抽出物調製を通じて、代謝プロファイルを分析し、薬剤作用機序や耐性メカニズムの解明に役立つ重要な手法を習得できます。

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著者らは、プロトコルを開発しながら有益なコメントを博士バルレッタ博士とパワーズの研究室のすべてのメンバーに感謝したいと思います。我々は、原稿の役立つ議論と校正のためにウェンディオースティンに感謝します。本稿で説明する作業は、ネブラスカ州リンカーンレドックス生物学センター（親助成＃NCRR 2P20RR 017675、D.ベッカー、PI）の大学から上記の各調査官にシードパイロット補助金によって賄われていた。加えて、我々は研究を供給し、このパブリケーションに含まNMR法を標準化するために、氏Halouskaの部分的な給与のサポートのために彼女のR21を助成（1R21AI087561-01A1）から資金を提供するための博士OFELIAチャコンに感謝します。

<ol><li>Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Manipulation+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2(2007).</li>
<li>Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+Maintenance+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 1(2007).</li>
<li>Clarridge, J. E. 3rd, Shawar, R. M., Shinnick, T. M., Plikaytis, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+use+of+polymerase+chain+reaction+for+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+a+routine+mycobacteriology+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory.</a> J. Clin. Microbiol. 31, 2049-2056 (1993).</li>
<li>Nguyen, B. D., Meng, X., Donovan, K. J., Shaka, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOGGY%3A+solvent-optimized+double+gradient+spectroscopy+for+water+suppression.+A+comparison+with+some+existing+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">SOGGY: solvent-optimized double gradient spectroscopy for water suppression. A comparison with some existing techniques.</a> J. Magn. Reson. 184, 263-274 (2007).</li>
<li>Cui, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+identification+via+the+Madison+Metabolomics+Consortium+Database%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database.</a> Nat. Biotechnol. 26, 162-164 (2008).</li>
<li>Ulrich, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioMagResBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BioMagResBank.</a> Nucleic Acids Res. 36, 402-408 (2008).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMDB%3A+the+Human+Metabolome+Database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">HMDB: the Human Metabolome Database.</a> Nucleic Acids Res. 35, 521-526 (2007).</li>
<li>Kanehisa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KEGG+for+linking+genomes+to+life+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">KEGG for linking genomes to life and the environment.</a> Nucleic Acids Res. 36, 480-484 (2008).</li>
<li>Karp, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+BioCyc+collection+of+pathway%2Fgenome+databases+to+160+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of the BioCyc collection of pathway/genome databases to 160 genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33, 6083-6089 (2005).</li>
<li>Halouska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+NMR+metabolomics+to+analyze+the+targets+of+D-cycloserine+in+mycobacteria%3A+role+of+D-alanine+racemase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Use of NMR metabolomics to analyze the targets of D-cycloserine in mycobacteria: role of D-alanine racemase.</a> J. Proteome. Res. 6, 4608-4614 (2007).</li>
<li>Boshoff, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+responses+of+Mycobacterium+tuberculosis+to+inhibitors+of+metabolism%3A+novel+insights+into+drug+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action.</a> J. Biol. Chem. 279, 40174-40184 (2004).</li>
<li>Mehaffy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Descriptive+proteomic+analysis+shows+protein+variability+between+closely+related+clinical+isolates+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 10, 1966-1984 (2010).</li>
<li>Schnappinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Adaptation+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+Macrophages%3A+Insights+into+the+Phagosomal+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment.</a> J. Exp. Med. 198, 693-704 (2003).</li>
<li>Schnappinger, D., Schoolnik, G. K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+of+host+pathogen+interactions%3A+how+Mycobacterium+tuberculosis+and+the+macrophage+adapt+to+one+another%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes.+Infect%22%5BJournal%5D)">Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another.</a> Microbes. Infect. 8, 1132-1140 (2006).</li>
<li>Shui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+profiling+of+host-pathogen+interactions%3A+the+macrophage+response+to+Mycobacterium+tuberculosis+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids.</a> J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).</li>
<li>Talaat, A. M., Lyons, R., Howard, S. T., Johnston, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temporal+expression+profile+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).</li>
<li>Forgue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+metabolic+profiling+of+Aspergillus+nidulans+to+monitor+drug+and+protein+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity.</a> J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).</li>
<li>Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+by+numbers%3A+acquiring+and+understanding+global+metabolite+data%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data.</a> Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).</li>
<li>Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR-based+Metabolomic+Profiling+in+Mice+Infected+with+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).</li>
<li>Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+extraction+method+for+mycobacterial+metabolome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Biomed.+Anal%22%5BJournal%5D)">Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).</li>
<li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+of+Mycobacterium+tuberculosis+reveals+compartmentalized+co-catabolism+of+carbon+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates.</a> Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).</li>
<li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+metabolomic+profiling+of+enzymatic+function%3A+identification+of+Rv1248c+as+a+mycobacterial+2-hydroxy-3-oxoadipate+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase.</a> Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).</li>
<li>Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gluconeogenic+carbon+flow+of+tricarboxylic+acid+cycle+intermediates+is+critical+for+Mycobacterium+tuberculosis+to+establish+and+maintain+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+metabolism+in+Mycobacterium+smegmatis+during+the+transition+from+O2-rich+to+O2-poor+conditions+as+studied+by+isotopomer-assisted+metabolite+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis.</a> Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).</li>
<li>Kweon, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polyomic+approach+to+elucidate+the+fluoranthene-degradative+pathway+in+Mycobacterium+vanbaalenii+PYR-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1.</a> J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).</li>
<li>Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+6-phosphate+accumulation+in+mycobacteria%3A+implications+for+a+novel+F420-dependent+anti-oxidant+defense+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system.</a> J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).</li>
<li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li>
<li>Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+%28LC-MS%29+in+metabolic+profiling+and+metabolomic+studies+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Med%22%5BJournal%5D)">The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery.</a> Biomark Med. 1, 159-185 (2007).</li>
<li>Ludwig, C., Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+J-resolved+NMR+spectroscopy%3A+review+of+a+key+methodology+in+the+metabolomics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem.+Anal%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox.</a> Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).</li>
<li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSimpson%2C+RJ+%22Proteins+and+Proteomics%3A+A+Laboratory+Manual%22">Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual</a>. Inglis, J. , Cold Spring Laboratory Press. 425-595 (2003).</li>
<li>Beste, D. J., McFadden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-level+strategies+for+studying+the+metabolism+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).</li>
<li>Rhee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+carbon+metabolism+in+Mycobacterium+tuberculosis%3A+an+unexpected+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier.</a> Trends Microbiol. , (2011).</li>
<li>Who. Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Anti-tuberculosis+Drug+Resistance+in+the+World%3A+Report+No.+4%22">Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4</a>. , (2008).</li>
<li>Jassal, M., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensively+drug-resistant+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Extensively drug-resistant tuberculosis.</a> Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

研究のかなりの数がMのトランスクリプトームとプロテオームのプロファイルを分析してきたin vitroおよび in vivo条件下での様々な環境下で結核 。11月16日最終的には、遺伝子発現と酵素活性の変化は、小分子量の分子の濃度の変動につながる。これらの化合物の完全な説明は、メタボロームを構成している。このように、代謝経路に薬や様々な成長条件の影響は、メタボローム解析が続くかもしれません。17,18いくつかの研究ではM内代謝経路を研究するためにこの方法論を利用してきました結核 （下記参照）と他のマイコバクテリア、Mのいずれかに感染したマウスにおける代謝の変化を分析する結核19 この方法論の潜在的な落とし穴は、試料中のいくつかの微生物が完全に溶解することがないかもしれないということです。必要であれば、溶解工程は、1つ以上を繰り返すことができます2回以上。溶解効率は、標準的なタン...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/機器の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> ADCの充実</td><td> BD BBLミドル</td><td> 212352 </td><td></td></tr><tr><td> BACS-120サンプルチェンジャー</td><td>ブルカー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブルカーアヴァンセNMR </td><td>ブルカー</td><td></td><td> 500 MHzの</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP1600-100 </td><td>フラクションV </td></tr><tr><td>遠心</td><td>ベックマン·コールター</td><td>アレグラ、X-15R </td><td>ベンチトップ</td></tr><tr><td>遠心管</td><td>コー​​ニング</td><td> 430291 </td><td> 50ミリリットル滅菌ポリプロピレン</td></tr><tr><td>クライオジェニックバイアル</td><td>コー​​ニング</td><td> 430488 </td><td> 2.0ミリリットル滅菌ポリプロピレン</td></tr><tr><td>シクロヘキサンximide </td><td> AGの科学</td><td> C-1189 </td><td>毒性</td></tr><tr><td> D（+） - グルコース</td><td>アクロス</td><td> 41095-0010 </td><td></td></tr><tr><td>酸化ジュウテリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 617385 </td><td></td></tr><tr><td>三角フラスコ</td><td> VWR </td><td> 89095-266 </td><td>滅菌、フラットベース、ポリカーボネート、0.22μmのPTFE膜ベントキャップ</td></tr><tr><td>フラッシュフリーズフラスコ</td><td> VWR </td><td> 82018-226 </td><td> 750ミリリットル</td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td> VWR </td><td> 82019-038 </td><td> 4.5 Lのベンチ</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>ギブコBRL </td><td> 15514-029 </td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>ニューブランズウィック州</td><td>イノーバ40 </td><td>ベンチシェーカー</td></tr><tr><td>行列Bを溶解</td><td> MPバイオメディカル</td><td> 6911-100 </td><td></td></tr><tr><td>溶解機</td><td> MPバイオメディカル</td><td> FastPrep-24 </td><td></td></tr><tr><td>遠心</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5415D </td><td>ベンチトップ</td></tr><tr><td>遠心</td><td>ベックマン·コールター</td><td>微量22R </td><td>ベンチトップ</td></tr><tr><td>ミドル7H9ブロス</td><td>ディフコ</td><td> 271310 </td><td></td></tr><tr><td> NMR管</td><td>ノレル</td><td> ST500-7 </td><td> 5mMの</td></tr><tr><td> OADC濃縮</td><td> BD BBLミドル</td><td> 212351 </td><td></td></tr><tr><td>オレイン酸</td><td>シグマ</td><td> O1008 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸二カリウム</td><td> VWR </td><td> BDH0266 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td><td> VWR </td><td> BDH0268 </td><td></td></tr><tr><td>ローター - 微量22R </td><td>ベックマン·コールター</td><td> F241.5P </td><td>密封されたとポリプロピレン</td></tr><tr><td>ローター - アレグラX-15R</td><td>ベックマン·コールター</td><td> SX4750 </td><td>バイオ認定のカバー付き</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム3 - トリメチルシリル-2,2,3,3-D4 </td><td>ケンブリッジアイソトープ</td><td> DLM-48 </td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>ベックマン·コールター</td><td> DU-530 </td><td></td></tr><tr><td>分光光度計のキュベット</td><td>命綱</td><td> LS-2410 </td><td> 1.5 mlのポリスチレン、2明確な側面</td></tr><tr><td>注射器</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 309585 </td><td>滅菌、3ミリリットルルアー</td></tr><tr><td>シリンジフィルター</td><td>ナルゲン</td><td> 190-2520 </td><td> 0.2μmの無菌酢酸セルロース</td></tr><tr><td>ツイーン80 </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP338-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

のサンプル調製<em&gt;結核菌</em核磁気共鳴代謝研究のための&gt;抽出

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

結核菌は、地球規模での人間の死亡率の主要な原因である。両方のマルチ（MDR）と広範囲に（XDR）の薬剤耐性株の出現は、現在の疾病制御の努力を脱線させると脅している。したがって、現時点で入手可能なものよりも有効である薬やワクチンの開発が急務とされている。 Mのゲノム結核は、10年以上のために知られて、まだ遺伝子の機能と本質に関する我々の知識の重要なギャップがあるされています。多くの研究では、以来、遺伝子発現の全体的なパターンに対する薬剤、酸化剤、および増殖条件の影響を決定するためにトランスクリプトームとプロテオームの両方のレベルで遺伝子発現解析を用いてきた。最終的に、これらの変更の最終的な応答は、数千の小さな分子量の化学物質を含む細菌の代謝物に反映されています。未処理またはTRか、野生型と変異株の代謝プロファイルを比較特定の薬物とeated、効果的にターゲットの識別を可能にすることができ、抗結核活性を持つ新規阻害剤の開発につながる可能性があります。同様に、メタボローム上の2つ以上の条件の影響も評価することができる。核磁気共鳴（NMR）は代謝中間体を同定し、定量化するために使用される強力な技術です。このプロトコルでは、Mの準備のための手順NMRメタボローム解析のための結核の細胞抽出物が記載されている。代謝物の保全を最大にするために低温を維持しながら、細胞培養物は、適切な条件と必要な生物学的安全性レベル3封じ込め、1収穫の下で栽培され、機械的な溶解に供される。細胞溶解物を回収し、滅菌濾過し、超低温で保存されています。これらの細胞抽出物からのアリコートを、生細胞の有無を確認するためのコロニー形成単位のためのミドル7H9寒天上にメッキが施されています。 37℃でのインキュベーションの際に二ヶ月℃、無viの場合できるコロニーが観察され、サンプルが下流の処理のための封じ込め施設から削除されます。抽出物は、凍結乾燥重水素化緩衝液に再懸濁し、その後統計的分析に供されている分光データをキャプチャし、NMR装置に注入される。説明する手順は、1次元（1D）1 H NMRおよび2次元（2D）の1 H-13 C NMR分析の両方に適用することができます。この方法論は、クロマトグラフ法よりも信頼性の高い低分子量代謝物の同定と細胞抽出物の代謝物のより信頼性が高く、敏感な定量的な分析を提供しています。細胞溶解工程の後に記載された手順のバリエーションも平行プロテオーム解析に適合させることができる。

のメタボロームプロファイル<em&gt;結核菌</em&gt;ブロス培養で成長した後に決定されています。条件は、この微生物の代謝プロファイルに栄養補助剤、酸化剤、抗結核剤の効果をテストするために変化させることができる。抽出物調製のための手順は、1Dの両方に適用されます<sup&gt; 1</sup&gt; Hと2D<sup&gt; 1</sup&gt; H-<sup&gt; 13</sup&gt; C NMR分析。

結核菌（Mycobacterium tuberculosis）は、世界規模で人間の死亡の主要な原因となっている。多剤耐性（MDR）および広剤耐性（XDR）の両方が出現したことで……

本手順の目的は、NMRメタボロミクスを用いて結核菌（mycobacterium tuberculosis）の細胞遊離抽出物を分析することです。まず、適切な増殖段階で培養および細胞の回収を行います。次に、細胞を溶解させて分析用の細胞遊離抽出物を取得します。最後に、凍結乾燥した抽出物をNMR分析用のバッファーで再懸濁します。最後に、NMRデータを収集し、ソフトウェアを用いてスペクトルを解析して代謝物を同定します。最終的に、mycobacterium tuberculosisのNMR解析を用いて、さまざまな処理における代謝物レベルの保持を示します。NMRメタボロミクスは、重要な代謝経路など、mycobacterium tuberculosisの生理学的側面の主要な要素に適用できます。この理解は、薬理作用および耐性のメカニズムを解明し、創薬のための新たな標的を特定する上で極めて重要です。一般的に、この手法に不慣れな人は、すべてのサンプルを完全に同一に扱うことが困難であり、それが不必要なばらつきを招き、当研究室における結果に影響を及ぼす可能性があります。大学院生のSteven Luka博士候補生が、NMR処理のためのサンプル取り扱い手順を実演します。続いて、当研究室のリサーチラボマネージャーと、リサーチテクニシャン3のRobert Fentonが、M tuberculosisを用いる際のMycobacterium tuberculosis培養物の取り扱い手順を実演します。研究は施設ガイドラインで定義されたバイオセーフティーレベル3の慣行に従って行われました。バイオセーフティー上の考慮から、このビデオ内のラベルにはmicrobacterium tuberculosisと記載されていますが、このデモンストレーションでは非病原性のmycobacterium magmaticを使用しました。まず、M tuberculosisの50% glycerolストックを氷上で解凍することから始めてください。0.15 mLを250 mLのエルレンマイヤーフラスコに入った110 mLのM-A-D-C-T-Wブロスに接種し、37 °Cで100 RPMで振盪しながら約6日間培養します。抗生物質、代替添加物、またはその他の処理が必要な場合は、処理が必要な培養物を回収します。培養、力価測定、および品質管理用に、0.5 milliliter の Eloqua を氷上で確保します。次に、目的の処理を行い、処理時間が経過した後、培養物をシェーカーに戻します。1 milliliter を分取し、OD 600 を測定します。また、培養、滴定、および品質管理用に0.5 milliliterのサンプルを分けておきます。以降のプロトコル全体を通して、細胞を氷上で保持してください。15 milliliterの氷冷2回蒸留水で洗浄した後、遠心分離により細胞を4本の50 milliliterチューブに回収します。ペレットを10 mLずつ分注して懸濁させます。2本の分注液を取り出し、遠心分離によりペレット化させ、その後、細胞ペレットを最終容量1 mLの二回蒸留水に再懸濁します。凝集のない単一細胞懸濁液が必要な場合は、細胞を27Gの針に通してください。1 mLの細胞懸濁液を、溶解マトリックスBを含む2 mLスクリューキャップチューブに3回に分けて移します。FastPrep-24ライシスホモジナイザーをバイオセーフティキャビネット内に設置します。サンプルをサンプルホルダーに入れ、保持スポークプレートで固定します。次に、速度設定6 m/sで60秒間処理します。次に、サンプルを遠心分離して、細胞の残骸と生存細胞をペレット化します。その後、生存細胞が不在であることを確認するため、上清を0.2 micronのシリンジフィルターに通して滅菌チューブに回収します。サンプルの0.1 milliliterをMADC.Agarに塗布します。サンプルをエタノール・ドライアイスバスで凍結し、凍結乾燥およびNMR施設での処理を行うまで-80 °Cで保存します。2か月後、プレートを確認し、コロニー形成単位（CFU）が存在しないことを検証します。CFUが認められない場合、サンプルをBSL3研究室から搬出し、標準的なNMR施設でさらなる解析を行うことができます。サンプルを完全に乾燥させた後、0.7 millilitersのNMR緩衝液で再懸濁し、マイクロ遠心チューブに移して13,000 ×gで3分間遠心分離します。0.6 millilitersを分取し、5 mm NMRチューブに移します。メディア分析において、カスタムラックを使用することで、複数のNMRチューブを適切な深さまでスピナーにロードすることが容易になります。次に、サンプルをNMR分光計に移動させ、A-B-A-C-S 20サンプルオートサンプラーにセットします。その際、未処理の培養液と薬剤処理した培養液を交互に配置します。最初のサンプルは、自動運転の開始時にあらかじめマグネット内にロードしておく必要があります。装置を校正するために、単一のサンプルを用いて90度パルス幅を最適化し、残りのサンプルに向けて装置の調整を行ってください。icon NMRおよびgrad shimを使用します。各サンプルについて、ロッキング、シミング、およびNMRデータ収集を自動化してください。1D ¹H NMRスペクトルの場合は、水抑制およびエキサイテーション・スカルプティング（excitation sculpting）を含むパルスシーケンスを選択します。2D ¹H-¹³C HSQCスペクトルの場合は、総データポイント数を32,000点、スキャン数を128回、ダミースキャン数を16回に設定します。パルスシーケンスを選択してください。直接次元のH 1方向に掃引幅を持つデータポイントを合計2048点、間接次元のC 13方向に掃引幅を持つデータポイントを64点選択します。また、良好なS/N比を得るために、128回のスキャンと16回のダミースキャンでスペクトルを収集するように指定します。m tuberculosisのスペクトルでは、既知の代謝物50種を含む約400本のピークが生成されました。例えば、付属の原稿に詳述されているデータ処理により、D アラニン経路に直接的または間接的に関連する代謝物のスペクトルが得られました。ピーク強度の大きさは細胞抽出物中に存在する代謝物濃度に比例するため、サンプル間および処理間で、代謝物および代謝経路の相対的な変動を定量化できます。LMRメタボロミクスは、細菌学分野の研究者が、視覚的かつ微小細菌的に、他の病原性または非病原性微生物の生理学および病原性を探索するための道を切り開くものです。このビデオを視聴することで、NMRメタボロミクス用に複数の結核菌細胞抽出液を調製する方法を十分に理解し、さらに重要な点として、信頼性の高い結果を得るためにプロトコル全体を通じて一貫性を維持する方法を習得することができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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学ぶ結核菌のNMRメタボロミクス解析法。培養・細胞破砕・無細胞抽出物調製を通じて、代謝プロファイルを分析し、薬剤作用機序や耐性メカニズムの解明に役立つ重要な手法を習得できます。

のサンプル調製

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