のサンプル調製結核菌抽出

この手順の目的は、NMRメタボロミクスによる無細胞抽出物である結核菌を最初に培養し、適切な成長段階で細胞を採取することです。次に、細胞を溶解し、分析用の無細胞抽出物を取得します。凍結乾燥抽出物をNMR分析用のバッファーに再懸濁します。

最後に、NMRデータを収集し、ソフトウェアでスペクトルを分析して代謝物を同定します。最終的に、結核菌のNMR分析は、さまざまな治療による代謝物レベルの保存を示すために使用されます。NMRメタボロミクスは、結核菌の生理機能の重要な側面、例えば重要な代謝経路に適用することができます。

この理解は、薬剤の作用や耐性の作用メカニズムを解明し、創薬のための新規標的を特定するために重要です。一般的に、この方法に不慣れな人は、すべてのサンプルをまったく同じように扱うことができないため、苦労するでしょう。これにより、私の研究室から不必要なばらつきや結果がもたらされます。スティーブン・ルカ博士課程の大学院生がNMR処理のサンプルの取り扱い手順を実演します 私の研究室からは、研究室のマネージャーと研究技術者のロバート・フェントン3人が、結核菌の培養を処理する手順を実演します。

研究は、機関のガイドラインで定義されているバイオセーフティレベル3の実践に従っています。このビデオのラベルには、バイオセーフティーの考慮のために結核菌と記載されていますが、このデモンストレーションでは非病原性のマグマ酸菌を使用しています。まず、グリセロール50%の結核菌を氷上で解凍します。

250ミリリットルのERで110ミリリットルのM-A-D-C-T-Wブロスに0.15ミリリットルを接種し、フラスコで100RPMで約6日間振とうしながら、摂氏37度で培養します。抗生物質を使用しない場合は、代替の追加または他の治療が必要です。処理が必要な培養物の培養物を収穫します。

0.5ミリリットルのEloquaを氷上で培養、滴定、品質管理のために予約してください。その後、所望の処理を行い、処理時間後に培養物をシェーカーに戻します。1ミリリットルを取り外し、OD600を決定します。

また、培養、滴定、品質管理のために0.5ミリリットルのサンプルを予約してください。残りのプロトコル全体を通じて細胞を氷上に維持します。15ミリリットルの氷冷二重蒸留水で洗浄した後、遠心分離により4本の50ミリリットルチューブ内の細胞を回収します。

リースはペレットを10ミリリットルのアリコートに吊るします。2つのアリコートとペレットを遠心分離によって引き抜き、次に細胞ペレットを最終容量の1ミリリットルの二重蒸留水に再懸濁します。凝集のない単一細胞懸濁液が必要な場合は、細胞を27ゲージの針に通します。

3回は、1ミリリットルの細胞懸濁液を溶解マトリックスB.Positionを含む2ミリリットルのスクリューキャップに転送を進めますバイオセーフティキャビネット内の高速調製24溶解ホモジナイザー。サンプルをサンプルホルダーに入れ、保持スポークプレートを固定します。次に、毎秒6メートルの速度設定で60秒間処理します。

次に、サンプルを遠心分離して、細胞の破片と無傷の細胞をペレット化します。次に、すくい酸を0.2ミクロンのシリンジフィルターに通して滅菌チューブに入れ、生細胞の不在を制御します。MADCに0.1ミリリットルのサンプルをプレートします。寒天。

サンプルをエタノールドライアイス浴で凍結し、凍結乾燥してNMR施設で処理する準備ができるまで、摂氏マイナス80度で保存します。2か月後、プレートをチェックして、コロニー形成ユニットがないことを確認します。CF使用者が見つからなかった場合は、サンプルをBSL threeの研究室から取り出し、標準的なNMR施設でさらに分析することができます。

サンプルを乾燥させた後、0.7ミリリットルのNMRバッファーに再懸濁し、マイクロ遠心チューブ遠心分離機に13,000回で3分間移します。G、0.6ミリリットルを取り出し、5ミリメートルNMRチューブに移します。培地分析から、カスタマイズされたラックにより、複数のNMRチューブを正しい深さのスピナーにロードすることが容易になります。

次に、サンプルをNMR分光計に移し、A-B-A-C-S 1つの20サンプルチェンジャーに挿入します。未処理の培養物と薬物処理された培養物を交互に行います。最初のサンプルは、自動分析の開始時に磁石にプリロードする必要があります。

装置を校正するには、1つのサンプルで90度のパルス長を最適化し、残りのサンプルに対して装置を調整します。icon NMRとgrad shimを使用します。すべてのサンプルのロッキングシミングとNMRデータ収集を自動化します。

A 1次元水素1 NMRスペクトルの場合、水抑制と励起スカルプティングを備えたパルスシーケンスを選択します。合計 32 、 000 のデータポイント、128 スキャン、16 ダミースキャンを 2 つの DH 1 C 13 hs QC スペクトルに設定します。パルスシーケンスを選択します。

直接 H 1 次元に沿ってスイープ幅を持つ合計 2048 個のデータ ポイントと、間接 C 13 次元に沿ってスイープ幅を持つ 64 個のデータ ポイントを選択します。また、128回のスキャンと16回のダミースキャンでスペクトル収集を指定し、良好な信号対雑音比を実現します。結核mのスペクトルは、50の既知の代謝物を含む約400のピークを生成しました。

例えば、添付の原稿に詳述されているデータ処理により、Dアラニン経路に直接的または間接的に関連する代謝産物のスペクトルが生成されました。ピーク強度の大きさは、細胞抽出物中に存在する代謝物濃度に比例するため、サンプルと処理間で代謝物と代謝経路の相対的な摂動を定量化できます。LMRメタボロミクスは、視覚細菌や微生物、別の病原性または非病原性微生物の生理学と病因を調査するための細菌学分野の研究への道を開きます。

このビデオを見れば、NMRメタボロミクス用の複数の結核細胞抽出物の調製方法、そして重要なことに、信頼性の高い結果を得るためには、プロトコール全体を通して一貫性を維持することについて十分に理解できるはずです。