Name: のサンプル調製結核菌抽出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 学ぶ結核菌のNMRメタボロミクス解析法。培養・細胞破砕・無細胞抽出物調製を通じて、代謝プロファイルを分析し、薬剤作用機序や耐性メカニズムの解明に役立つ重要な手法を習得できます。

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著者らは、プロトコルを開発しながら有益なコメントを博士バルレッタ博士とパワーズの研究室のすべてのメンバーに感謝したいと思います。我々は、原稿の役立つ議論と校正のためにウェンディオースティンに感謝します。本稿で説明する作業は、ネブラスカ州リンカーンレドックス生物学センター（親助成＃NCRR 2P20RR 017675、D.ベッカー、PI）の大学から上記の各調査官にシードパイロット補助金によって賄われていた。加えて、我々は研究を供給し、このパブリケーションに含まNMR法を標準化するために、氏Halouskaの部分的な給与のサポートのために彼女のR21を助成（1R21AI087561-01A1）から資金を提供するための博士OFELIAチャコンに感謝します。

<ol><li>Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Manipulation+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2(2007).</li>
<li>Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+Maintenance+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 1(2007).</li>
<li>Clarridge, J. E. 3rd, Shawar, R. M., Shinnick, T. M., Plikaytis, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+use+of+polymerase+chain+reaction+for+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+a+routine+mycobacteriology+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory.</a> J. Clin. Microbiol. 31, 2049-2056 (1993).</li>
<li>Nguyen, B. D., Meng, X., Donovan, K. J., Shaka, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOGGY%3A+solvent-optimized+double+gradient+spectroscopy+for+water+suppression.+A+comparison+with+some+existing+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">SOGGY: solvent-optimized double gradient spectroscopy for water suppression. A comparison with some existing techniques.</a> J. Magn. Reson. 184, 263-274 (2007).</li>
<li>Cui, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+identification+via+the+Madison+Metabolomics+Consortium+Database%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database.</a> Nat. Biotechnol. 26, 162-164 (2008).</li>
<li>Ulrich, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioMagResBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BioMagResBank.</a> Nucleic Acids Res. 36, 402-408 (2008).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMDB%3A+the+Human+Metabolome+Database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">HMDB: the Human Metabolome Database.</a> Nucleic Acids Res. 35, 521-526 (2007).</li>
<li>Kanehisa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KEGG+for+linking+genomes+to+life+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">KEGG for linking genomes to life and the environment.</a> Nucleic Acids Res. 36, 480-484 (2008).</li>
<li>Karp, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+BioCyc+collection+of+pathway%2Fgenome+databases+to+160+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of the BioCyc collection of pathway/genome databases to 160 genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33, 6083-6089 (2005).</li>
<li>Halouska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+NMR+metabolomics+to+analyze+the+targets+of+D-cycloserine+in+mycobacteria%3A+role+of+D-alanine+racemase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Use of NMR metabolomics to analyze the targets of D-cycloserine in mycobacteria: role of D-alanine racemase.</a> J. Proteome. Res. 6, 4608-4614 (2007).</li>
<li>Boshoff, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+responses+of+Mycobacterium+tuberculosis+to+inhibitors+of+metabolism%3A+novel+insights+into+drug+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action.</a> J. Biol. Chem. 279, 40174-40184 (2004).</li>
<li>Mehaffy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Descriptive+proteomic+analysis+shows+protein+variability+between+closely+related+clinical+isolates+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 10, 1966-1984 (2010).</li>
<li>Schnappinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Adaptation+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+Macrophages%3A+Insights+into+the+Phagosomal+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment.</a> J. Exp. Med. 198, 693-704 (2003).</li>
<li>Schnappinger, D., Schoolnik, G. K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+of+host+pathogen+interactions%3A+how+Mycobacterium+tuberculosis+and+the+macrophage+adapt+to+one+another%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes.+Infect%22%5BJournal%5D)">Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another.</a> Microbes. Infect. 8, 1132-1140 (2006).</li>
<li>Shui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+profiling+of+host-pathogen+interactions%3A+the+macrophage+response+to+Mycobacterium+tuberculosis+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids.</a> J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).</li>
<li>Talaat, A. M., Lyons, R., Howard, S. T., Johnston, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temporal+expression+profile+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).</li>
<li>Forgue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+metabolic+profiling+of+Aspergillus+nidulans+to+monitor+drug+and+protein+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity.</a> J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).</li>
<li>Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+by+numbers%3A+acquiring+and+understanding+global+metabolite+data%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data.</a> Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).</li>
<li>Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR-based+Metabolomic+Profiling+in+Mice+Infected+with+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).</li>
<li>Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+extraction+method+for+mycobacterial+metabolome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Biomed.+Anal%22%5BJournal%5D)">Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).</li>
<li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+of+Mycobacterium+tuberculosis+reveals+compartmentalized+co-catabolism+of+carbon+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates.</a> Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).</li>
<li>de Carvalho, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+metabolomic+profiling+of+enzymatic+function%3A+identification+of+Rv1248c+as+a+mycobacterial+2-hydroxy-3-oxoadipate+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase.</a> Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).</li>
<li>Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gluconeogenic+carbon+flow+of+tricarboxylic+acid+cycle+intermediates+is+critical+for+Mycobacterium+tuberculosis+to+establish+and+maintain+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+metabolism+in+Mycobacterium+smegmatis+during+the+transition+from+O2-rich+to+O2-poor+conditions+as+studied+by+isotopomer-assisted+metabolite+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis.</a> Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).</li>
<li>Kweon, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polyomic+approach+to+elucidate+the+fluoranthene-degradative+pathway+in+Mycobacterium+vanbaalenii+PYR-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1.</a> J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).</li>
<li>Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+6-phosphate+accumulation+in+mycobacteria%3A+implications+for+a+novel+F420-dependent+anti-oxidant+defense+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system.</a> J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).</li>
<li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+metabolome+analysis+using+capillary+electrophoresis+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).</li>
<li>Metz, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+%28LC-MS%29+in+metabolic+profiling+and+metabolomic+studies+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Med%22%5BJournal%5D)">The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery.</a> Biomark Med. 1, 159-185 (2007).</li>
<li>Ludwig, C., Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+J-resolved+NMR+spectroscopy%3A+review+of+a+key+methodology+in+the+metabolomics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem.+Anal%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox.</a> Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).</li>
<li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSimpson%2C+RJ+%22Proteins+and+Proteomics%3A+A+Laboratory+Manual%22">Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual</a>. Inglis, J. , Cold Spring Laboratory Press. 425-595 (2003).</li>
<li>Beste, D. J., McFadden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-level+strategies+for+studying+the+metabolism+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).</li>
<li>Rhee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+carbon+metabolism+in+Mycobacterium+tuberculosis%3A+an+unexpected+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier.</a> Trends Microbiol. , (2011).</li>
<li>Who. Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Anti-tuberculosis+Drug+Resistance+in+the+World%3A+Report+No.+4%22">Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4</a>. , (2008).</li>
<li>Jassal, M., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensively+drug-resistant+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Extensively drug-resistant tuberculosis.</a> Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

研究のかなりの数がMのトランスクリプトームとプロテオームのプロファイルを分析してきたin vitroおよび in vivo条件下での様々な環境下で結核 。11月16日最終的には、遺伝子発現と酵素活性の変化は、小分子量の分子の濃度の変動につながる。これらの化合物の完全な説明は、メタボロームを構成している。このように、代謝経路に薬や様々な成長条件の影響は、メタボローム解析が続くかもしれません。17,18いくつかの研究ではM内代謝経路を研究するためにこの方法論を利用してきました結核 （下記参照）と他のマイコバクテリア、Mのいずれかに感染したマウスにおける代謝の変化を分析する結核19 この方法論の潜在的な落とし穴は、試料中のいくつかの微生物が完全に溶解することがないかもしれないということです。必要であれば、溶解工程は、1つ以上を繰り返すことができます2回以上。溶解効率は、標準的なタン...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/機器の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> ADCの充実</td><td> BD BBLミドル</td><td> 212352 </td><td></td></tr><tr><td> BACS-120サンプルチェンジャー</td><td>ブルカー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブルカーアヴァンセNMR </td><td>ブルカー</td><td></td><td> 500 MHzの</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP1600-100 </td><td>フラクションV </td></tr><tr><td>遠心</td><td>ベックマン·コールター</td><td>アレグラ、X-15R </td><td>ベンチトップ</td></tr><tr><td>遠心管</td><td>コー​​ニング</td><td> 430291 </td><td> 50ミリリットル滅菌ポリプロピレン</td></tr><tr><td>クライオジェニックバイアル</td><td>コー​​ニング</td><td> 430488 </td><td> 2.0ミリリットル滅菌ポリプロピレン</td></tr><tr><td>シクロヘキサンximide </td><td> AGの科学</td><td> C-1189 </td><td>毒性</td></tr><tr><td> D（+） - グルコース</td><td>アクロス</td><td> 41095-0010 </td><td></td></tr><tr><td>酸化ジュウテリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 617385 </td><td></td></tr><tr><td>三角フラスコ</td><td> VWR </td><td> 89095-266 </td><td>滅菌、フラットベース、ポリカーボネート、0.22μmのPTFE膜ベントキャップ</td></tr><tr><td>フラッシュフリーズフラスコ</td><td> VWR </td><td> 82018-226 </td><td> 750ミリリットル</td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td> VWR </td><td> 82019-038 </td><td> 4.5 Lのベンチ</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>ギブコBRL </td><td> 15514-029 </td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>ニューブランズウィック州</td><td>イノーバ40 </td><td>ベンチシェーカー</td></tr><tr><td>行列Bを溶解</td><td> MPバイオメディカル</td><td> 6911-100 </td><td></td></tr><tr><td>溶解機</td><td> MPバイオメディカル</td><td> FastPrep-24 </td><td></td></tr><tr><td>遠心</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5415D </td><td>ベンチトップ</td></tr><tr><td>遠心</td><td>ベックマン·コールター</td><td>微量22R </td><td>ベンチトップ</td></tr><tr><td>ミドル7H9ブロス</td><td>ディフコ</td><td> 271310 </td><td></td></tr><tr><td> NMR管</td><td>ノレル</td><td> ST500-7 </td><td> 5mMの</td></tr><tr><td> OADC濃縮</td><td> BD BBLミドル</td><td> 212351 </td><td></td></tr><tr><td>オレイン酸</td><td>シグマ</td><td> O1008 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸二カリウム</td><td> VWR </td><td> BDH0266 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td><td> VWR </td><td> BDH0268 </td><td></td></tr><tr><td>ローター - 微量22R </td><td>ベックマン·コールター</td><td> F241.5P </td><td>密封されたとポリプロピレン</td></tr><tr><td>ローター - アレグラX-15R</td><td>ベックマン·コールター</td><td> SX4750 </td><td>バイオ認定のカバー付き</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム3 - トリメチルシリル-2,2,3,3-D4 </td><td>ケンブリッジアイソトープ</td><td> DLM-48 </td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>ベックマン·コールター</td><td> DU-530 </td><td></td></tr><tr><td>分光光度計のキュベット</td><td>命綱</td><td> LS-2410 </td><td> 1.5 mlのポリスチレン、2明確な側面</td></tr><tr><td>注射器</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 309585 </td><td>滅菌、3ミリリットルルアー</td></tr><tr><td>シリンジフィルター</td><td>ナルゲン</td><td> 190-2520 </td><td> 0.2μmの無菌酢酸セルロース</td></tr><tr><td>ツイーン80 </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP338-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

のサンプル調製<em&gt;結核菌</em核磁気共鳴代謝研究のための&gt;抽出

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

結核菌は、地球規模での人間の死亡率の主要な原因である。両方のマルチ（MDR）と広範囲に（XDR）の薬剤耐性株の出現は、現在の疾病制御の努力を脱線させると脅している。したがって、現時点で入手可能なものよりも有効である薬やワクチンの開発が急務とされている。 Mのゲノム結核は、10年以上のために知られて、まだ遺伝子の機能と本質に関する我々の知識の重要なギャップがあるされています。多くの研究では、以来、遺伝子発現の全体的なパターンに対する薬剤、酸化剤、および増殖条件の影響を決定するためにトランスクリプトームとプロテオームの両方のレベルで遺伝子発現解析を用いてきた。最終的に、これらの変更の最終的な応答は、数千の小さな分子量の化学物質を含む細菌の代謝物に反映されています。未処理またはTRか、野生型と変異株の代謝プロファイルを比較特定の薬物とeated、効果的にターゲットの識別を可能にすることができ、抗結核活性を持つ新規阻害剤の開発につながる可能性があります。同様に、メタボローム上の2つ以上の条件の影響も評価することができる。核磁気共鳴（NMR）は代謝中間体を同定し、定量化するために使用される強力な技術です。このプロトコルでは、Mの準備のための手順NMRメタボローム解析のための結核の細胞抽出物が記載されている。代謝物の保全を最大にするために低温を維持しながら、細胞培養物は、適切な条件と必要な生物学的安全性レベル3封じ込め、1収穫の下で栽培され、機械的な溶解に供される。細胞溶解物を回収し、滅菌濾過し、超低温で保存されています。これらの細胞抽出物からのアリコートを、生細胞の有無を確認するためのコロニー形成単位のためのミドル7H9寒天上にメッキが施されています。 37℃でのインキュベーションの際に二ヶ月℃、無viの場合できるコロニーが観察され、サンプルが下流の処理のための封じ込め施設から削除されます。抽出物は、凍結乾燥重水素化緩衝液に再懸濁し、その後統計的分析に供されている分光データをキャプチャし、NMR装置に注入される。説明する手順は、1次元（1D）1 H NMRおよび2次元（2D）の1 H-13 C NMR分析の両方に適用することができます。この方法論は、クロマトグラフ法よりも信頼性の高い低分子量代謝物の同定と細胞抽出物の代謝物のより信頼性が高く、敏感な定量的な分析を提供しています。細胞溶解工程の後に記載された手順のバリエーションも平行プロテオーム解析に適合させることができる。

のメタボロームプロファイル<em&gt;結核菌</em&gt;ブロス培養で成長した後に決定されています。条件は、この微生物の代謝プロファイルに栄養補助剤、酸化剤、抗結核剤の効果をテストするために変化させることができる。抽出物調製のための手順は、1Dの両方に適用されます<sup&gt; 1</sup&gt; Hと2D<sup&gt; 1</sup&gt; H-<sup&gt; 13</sup&gt; C NMR分析。

結核菌（Mycobacterium tuberculosis）は、世界規模で人間の死亡の主要な原因となっている。多剤耐性（MDR）および広剤耐性（XDR）の両方が出現したことで……

本手順の目的は、NMRメタボロミクスを用いて結核菌（mycobacterium tuberculosis）の細胞遊離抽出物を分析することです。まず、適切な増殖段階で培養および細胞の回収を行います。次に、細胞を溶解させて分析用の細胞遊離抽出物を取得します。最後に、凍結乾燥した抽出物をNMR分析用のバッファーで再懸濁します。最後に、NMRデータを収集し、ソフトウェアを用いてスペクトルを解析して代謝物を同定します。最終的に、mycobacterium tuberculosisのNMR解析を用いて、さまざまな処理における代謝物レベルの保持を示します。NMRメタボロミクスは、重要な代謝経路など、mycobacterium tuberculosisの生理学的側面の主要な要素に適用できます。この理解は、薬理作用および耐性のメカニズムを解明し、創薬のための新たな標的を特定する上で極めて重要です。一般的に、この手法に不慣れな人は、すべてのサンプルを完全に同一に扱うことが困難であり、それが不必要なばらつきを招き、当研究室における結果に影響を及ぼす可能性があります。大学院生のSteven Luka博士候補生が、NMR処理のためのサンプル取り扱い手順を実演します。続いて、当研究室のリサーチラボマネージャーと、リサーチテクニシャン3のRobert Fentonが、M tuberculosisを用いる際のMycobacterium tuberculosis培養物の取り扱い手順を実演します。研究は施設ガイドラインで定義されたバイオセーフティーレベル3の慣行に従って行われました。バイオセーフティー上の考慮から、このビデオ内のラベルにはmicrobacterium tuberculosisと記載されていますが、このデモンストレーションでは非病原性のmycobacterium magmaticを使用しました。まず、M tuberculosisの50% glycerolストックを氷上で解凍することから始めてください。0.15 mLを250 mLのエルレンマイヤーフラスコに入った110 mLのM-A-D-C-T-Wブロスに接種し、37 °Cで100 RPMで振盪しながら約6日間培養します。抗生物質、代替添加物、またはその他の処理が必要な場合は、処理が必要な培養物を回収します。培養、力価測定、および品質管理用に、0.5 milliliter の Eloqua を氷上で確保します。次に、目的の処理を行い、処理時間が経過した後、培養物をシェーカーに戻します。1 milliliter を分取し、OD 600 を測定します。また、培養、滴定、および品質管理用に0.5 milliliterのサンプルを分けておきます。以降のプロトコル全体を通して、細胞を氷上で保持してください。15 milliliterの氷冷2

sample-preparation-mycobacterium-tuberculosis-extracts-for-nuclear

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

微生物のプランクトンコミュニティからの代謝物抽出のための方法が示されています。コミュニティ全体のサンプリングが特別に用意されたフィルター上にろ過することにより達成される。凍結乾燥後、水性の水溶性代謝物が抽出されます。このアプローチは、自然または実験的な微生物群集のトランスオミクス研究への環境メタボロミクスの応用が可能になります。...

核磁気共鳴分光法を用いた環境メタボロミクスのための低密度プランクトンコミュニティからの代謝物の濃度

このビデオでは、代謝物プロファイリングのための乳がん細胞サンプルの準備技術について説明しています。乳がん細胞は、エストロゲン受容体αに結合して代謝物組成の変化を引き起こすエストラジオールで治療されます。...

メタボロミクスのためのサンプル調製:代謝物プロファイリングのための細胞サンプル調製法

哺乳類の脳の神経化学は、多くの神経疾患や全身疾患で変化しています。脳代謝産物の特徴的なプロファイルは、脳組織の粗抽出物に基づいて効率的に取得できます。そのために、高分解能NMR分光法を採用し、代謝物濃度の詳細な定量分析(メタボロミクス)を可能にしています。...

組織抽出物の高分解能核磁気共鳴分光法によるラット脳のメタボローム解析

この論文では、植物の代謝プロファイリングにおけるPSYCHEとSAPPHIRE-PSYCHEの使用を紹介し、サンプル調製と最適なPure Shift...

ピュアシフト核磁気共鳴:植物メタボロミクスのための新しいツール

このプロトコルでは、多くのサンプルの効率的で迅速なサンプル調製を組み合わせた最適化されたワークフローを紹介します。さらに、代謝GWAS研究のハイスループット評価のための分析変動を減らすためのステップバイステップガイドを提供します。...

大規模マルチオミクスゲノムワイド関連研究(Mo-GWAS):サンプル調製と正規化のためのガイドライン

このプロトコールは、サイズ排除クロマトグラフィー、培養上清から 結核菌 群細胞外小胞を富化するための容易で再現性のある技術を記載する。...

結核 菌サイズ排除クロマトグラフィーによる細胞外小胞濃縮

核磁気共鳴(NMR)分光法は、さまざまな疾患を持つ患者の代謝産物の調節不全を特定するために使用されます。この技術により、乱れた代謝物の定量化が可能になり、病態生理学的な洞察が解き明かされます。ここでは、患者の代謝特性評価のためのNMRベースのアプローチの段階的な手順について説明します。...

NMRベースのメタボロミクスを用いた重症患者における代謝異常物の同定と定量

このプロトコルは、等電点に基づく分取等電点フォーカシング(IEF)を使用して、不溶性細胞壁および膜タンパク質を単純な画分(1〜5タンパク質)に分離し、続いて分子量による分離を行います。得られた画分は、それ以上の精製を行わずに、免疫学的およびプロテオミクス分析に直接使用できます。...

下流のタンパク質分析のための結 核菌 からの細胞壁および細胞膜タンパク質の分離と分画

このプロトコルは、DNAキャプチャビーズ精製と組み合わせたビーズビード精製により、 結核菌...

カスタムバッファーでのビーズビーティングとそれに続く NGS ワークフローを使用したマイコバクテリア DNA 抽出

このプロトコルは、マイコバクテリアから高品質なDNAを抽出するためのCTAB法を説明し、硬く菌酸豊富な細胞壁による課題を克服します。このプロセスには、酵素による消化、CTABによる細胞溶解、有機抽出およびエタノール沈殿によるDNA精製が含まれます。この方法は分子研究に適したDNAを生成し、マイコバクテリア研究にも信頼性があります。...

セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイド技術によるマイコバクテリウム種からの全ゲノムデオキシリボ核酸抽出

学ぶ結核菌のNMRメタボロミクス解析法。培養・細胞破砕・無細胞抽出物調製を通じて、代謝プロファイルを分析し、薬剤作用機序や耐性メカニズムの解明に役立つ重要な手法を習得できます。

のサンプル調製

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