カスタムバッファーでのビーズビーティングとそれに続く NGS ワークフローを使用したマイコバクテリア DNA 抽出

私たちの診断研究は、スピードと実用主義に重点を置き、限られたリソース環境での結核の薬剤耐性の検出を改善することに焦点を当てています。結核診断では、より包括的な遺伝子型アッセイがあり、さらには新しい迅速表現型アッセイも数多くあり、これらの検査をポイントオブケアに近づけるための一貫した推進力があります。しかし、現実的な障壁がまだ存在する。

試薬からインフラ、物流に至るまで、資源の課題は引き続き大きな障壁となっています。Cepheid Xpertアッセイの技術的洗練を超えるものでは、さまざまな設定でプロトコルの標準化が困難です。したがって、この研究で詳述されているMTB DNA抽出は、その代表的な例です。

シーケンシングベースの結核診断を拡大することが非常に必要ですが、多くの検査室では、高品質のDNAを抽出するための信頼できる方法がまだ不足しています。私たちの目標は、シンプルで実用的で、リソースの少ないポイントオブケア環境に適した方法を共有することです。ここでは、リソースが限られた設定で使用するために設計されたシンプルで低コストのプロトコルを紹介します。

NGSアプリケーションで検証されており、自動リキッドハンドリングシステムと互換性があります。まず、塩化ナトリウム溶液の塩酸トリス緩衝液、Triton X 100、およびEDTAを組み合わせて、Triton緩衝液を作ります。撹拌しながら混合し、超純水を加えて最終容量 100 ミリリットルに達します。

フィルターは使用前にバッファーを滅菌します。次に、1ミリリットルの1モルTris-HClと20マイクロリットルの0.5モルEDTAを組み合わせて、100ミリリットルの低EDTA Tris-EDTAバッファーを調製します。超純水を混ぜて満たし、最終容量 100 ミリリットルに達します。

次に、バッファーをフィルター滅菌します。溶解チューブを準備するには、メスの刃を使用して、変曲点のすぐ下にある1.5ミリリットルのスクリューキャップチューブの底を慎重に切り取ります。P1000ピペットチップからチップを切り取り、端近くにV字型のくさびを作ります。

スクリューキャップチューブの切断された底をV字型のピペットチップにくさびで留めてスクープを形成します。滅菌容器に0.1ミリメートルのジルコニアケイ酸塩ビーズを入れます。準備したスクープを使用して、約200ミリグラムのビーズを1.5ミリリットルのスクリューキャップチューブに移します。

細菌細胞培養物の調製のために、5ミリリットルの結核菌培養物を15ミリリットルの円錐形遠心分離管に移します。最高速度で10分間遠心分離します。次に、10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、ペレットを乱すことなく、約500マイクロリットルの上清を除くすべての上清を慎重に除去します。

P1000ピペットを使用して、残りの上清を除去します。ペレットを350マイクロリットルのカスタムトリトンバッファーに再懸濁し、上下にピペッティングしてよく混合します。サンプルを乾熱浴で摂氏95度で30分間加熱します。

喀留液を調製するには、1〜5ミリリットルの喀痰サンプルを滅菌50ミリリットルの遠心分離管に移します。ジチオスレイトール液化を行うには、喀痰サンプルに4容量の10ミリモルジチオスレイトールを加え、30秒間完全にボルテックスします。サンプルを最高速度で10分間遠心分離します。

次に、10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、500マイクロリットルを除くすべての上清を廃棄します。ペレットを乱すことなく、P1000ピペットで残りの上清を取り除きます。ペレットを350マイクロリットルのカスタムトリトンバッファーに再懸濁します。

NALC水酸化ナトリウム液化を行うには、4容量のNALC水酸化ナトリウム溶液を喀痰サンプルに加えます。混合物を30秒間渦にします。次に、チューブを室温で7分間インキュベートします。

次に、PBSを50ミリリットルのマークまで加算します。チューブの内容物をボルテックスしてよく混合し、チューブを最高速度で10分間遠心分離します。遠心分離後、50ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、前述のように上清を廃棄します。

次に、ペレットを350マイクロリットルのカスタムトリトンバッファーに再懸濁します。まず、350マイクロリットルの不活化サンプルを、250マイクロリットルの0.1ミリメートルのケイ酸ジルコニアビーズを含む標識された1.5ミリリットルのスクリューキャップチューブに移します。ビーズは、サイクルの間に2分間休憩し、毎秒6.5メートルで45秒間ライセートを叩きました。

サンプルを最高速度で2分間遠心分離し、150マイクロリットルの上清を新しい標識チューブに移します。次に、室温で30分間等価化された磁気ビーズをボルテックスクリーンアップして再懸濁させます。180マイクロリットルの磁気ビーズをDNAサンプルに移します。

上下に10回ピペットで混ぜます。室温で2分間インキュベートした後、チューブを磁気ラックに置き、溶液が透明になるまで2分間待ちます。次に、200マイクロリットルのピペットを使用して上清を廃棄します。

チューブを磁気ラックに置いたまま、反対側の壁に沿って500マイクロリットルの調製したての70%エタノールを加え、30秒間待ちます。最後の洗浄の最後に、10マイクロリットルのピペットで残留エタノールを取り除き、2分間自然乾燥させます。ビーズが不透明になったらすぐに、磁気ラックからチューブを取り外します。

20マイクロリットルの低EDTA Trisバッファーに再懸濁します。室温で5分間インキュベートする前に、ピペッティングまたはボルテックスで混合し、すべてのビーズが溶液中にあることを確認します。次に、チューブを磁気ラックに透明になるまで2分間置きます。

次に、20マイクロリットル未満の溶出されたDNAを新しい標識チューブに移し、ビーズのキャリーオーバーを防ぎます。抗酸菌atpEの99ヌクレオチドを標的とする定量的PCRを使用して抗酸菌DNAを定量するには、QPCRマスターミックスを氷上に組み立てます。サンプルの量と標準物質に基づいてマスターミックスを調整し、ピペッティング損失を考慮して10%の超過分を含めます。

サーマルサイクラーを摂氏95度で60秒間実行し、続いて摂氏95度で10秒間、摂氏60度で30秒間、毎秒2.11度のランプレートで35サイクル実行します。すべてのサンプル、標準試料、コントロールを3回分けて実行します。ここでは、結核菌培養物は、すべてのテスト条件の中で最も高いDNA濃度をもたらしました。

急増した喀痰サンプルは、特に10, 000の細菌グループで、DNA収量が徐々に低下し、細菌の入力が減少するにつれて変動が増加しました。