Name: カスタムバッファーでのビーズビーティングとそれに続く NGS ワークフローを使用したマイコバクテリア DNA 抽出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学ぶ ビーズビーティングとDNAキャプチャービーズ精製を用いたMycobacterium tuberculosisからの高速DNA抽出法。資源制限環境でも次世代シーケンスに対応し、薬剤耐性検出を支援する実用的プロトコルです。

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この研究は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校(UCSF)で、施設内バイオセーフティ委員会(BUA #BU198320-01GBUA/BABB)の承認の下で実施され、UCSFの研究倫理ガイドラインに従っています。私たちは、IRBが承認した同意免除プロトコルに基づいて、ディスカバリーライフサイエンスが非結核呼吸器疾患を持つ個人から収集した残りの喀痰サンプルを入手しました。
1. バッファーの調製
<ol>
	<li>カスタムTritonバッファー(表1):100 mLのカスタムTritonバッファーを調製するには、まず2 mLの5 M NaCl、1 mLの1 M Tris-HCl(pH 8)、1 mLのTriton X-100、および0.2 mLの0.5 Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を組み合わせます。超純水を加えると、総容量が100mLになります。使用前にフィルター滅菌してください。最終的なバッファーには、100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、および1 % Triton X-100が含まれています。</li>
	<li>低EDTA TE(表2):100 mLの低EDTA TEバッファーを調製するには、1 mLの1M Tris-HCl(pH 8)と0.02 mLの0.5 M EDTAを組み合わせます。超純水を加えると、総容量が100mLになります。最終的なバッファーには、10 mM Tris-HCl と 0.1 mM EDTA が含まれています。</li>
</ol>
2. 溶解チューブの調製
<ol>
	<li>メスの刃を使用して、変曲点のすぐ下にある1.5mLのスクリューキャップチューブの底を慎重に切り取ります。</li>
	<li>P1000の先端から先端を切り取り、端近くでV字型のくさびを切り、その中に準備したスクリューキャップチューブの底をくさびで留めます。スクープの図については、 図 1 を参照してください。</li>
	<li>滅菌容器(リザーバーやシャーレなど)に0.1 mmのジルコニア-ケイ酸塩ビーズを入れ、準備したスコップを使用して、1スクープのビーズ(~200 mg)を1.5 mLのスクリューキャップチューブに分配します。</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68037/68037fig1.jpg"> 
図1:社内のビーズ配布スクープ。 このスコップは、~200 mg の 0.1 mm ジルコニウムビーズを処理チューブに簡単に移すことができるように設計されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68037/68037fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
3. インプットの準備
注:すべてのサンプル調製は、施設のバイオセーフティプロトコルに従って実施する必要があります。エアロゾルへの曝露のリスクを最小限に抑えるために、感染性物質をクラスIIバイオセーフティキャビネット(BSC)内で取り扱うことを強くお勧めします。
<ol>
	<li>細菌細胞培養<ol>
		<li>結核菌培養物(MGITまたは濁液培養物)を15 mLの円錐形遠心チューブに~5 mLを最高速度(≥ 3,000 x g)で10分間遠心分離します。</li>
		<li>10 mLの血清ピペットを使用して、ペレットを乱さずに~500 μLの上清を除くすべてを慎重に取り除きます。ペレットを乱さずに、P1000ピペットで残りの上清を取り除きます。</li>
		<li>ピペッティングを上下させて、ペレットを350 μLのカスタムTritonバッファーに再懸濁します。必要に応じて(つまり、BSL-3の外部で処理するためにサンプルを除去する場合)、標準の操作手順に従ってサンプルを不活性化します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>喀痰の準備<ol>
		<li>1〜5 mLの喀痰サンプル(自発的または誘発)を滅菌済みの50 mL遠心分離チューブに移します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DTT液化<ol>
		<li>4容量の100 mMジチオスレイトールを喀痰サンプルに加えます(容量は異なる場合があります)。市販の試薬を使用する場合は、メーカーの希釈手順に従ってください。</li>
		<li>30秒間徹底的に渦巻きます。室温(20-25°C)で7分間インキュベートします。再び30秒間渦巻きます。</li>
		<li>手順3.3.1を繰り返します。および 3.3.2.1x、非常に粘性のあるサンプルの場合、最大5回のインキュベーションボルテックスサイクルを実行します。</li>
		<li>最高速度(≥3,000× g)で10分間遠心分離します。10 mLの血清ピペットを使用して、上清の~500 μLを除くすべてを慎重に廃棄します。ペレットを乱さずに、P1000ピペットで残りの上清を取り除きます。</li>
		<li>ペレットを350 μLのカスタムTritonバッファーに再懸濁します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NALC-NaOH液化<ol>
		<li>NALC-NaOH溶液を調製するには、調製と希釈について製造元の指示に従ってください。</li>
		<li>喀痰サンプルに4容量のNALC-NaOH溶液を追加します(自発的または誘導的、容量は異なる場合があります)。</li>
		<li>30秒間渦巻きます。室温(20-25°C)で7分間インキュベートします。手順 3.4.1 と 3.4.2 を繰り返します。1倍です。非常に粘性の高いサンプルの場合は、最大5回のインキュベーションボルテックスサイクルを実行します。</li>
		<li>50mLのマークにPBSを加えます。渦を少し混ぜます。最高速度(≥3,000× g)で10分間遠心分離します。</li>
		<li>50 mLの血清ピペットを使用して、~500 μLの上清を除くすべての上清を慎重に廃棄します。ペレットを乱さずに、P1000ピペットで残りの上清を取り除きます。</li>
		<li>ペレットを350 μLのカスタムTritonバッファーに再懸濁します。必要に応じて(つまり、BSL-3の外部で処理するためにサンプルを除去する場合)、標準の操作手順に従ってサンプルを不活性化します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. DNAの抽出
<ol>
	<li>不活化細菌懸濁液(ステップ3から350μL)を、~250 μLの0.1 mmジルコニア-ケイ酸塩ビーズを含む新しい標識済みの1.5 mLスクリューキャップチューブに移します。</li>
	<li>Beadは、6.5 m/sでライセートを45秒間打ち負かし、実行の間に2分間の休憩を挟みました。合計3回のビーズ叩きサイクルを繰り返します。</li>
	<li>最高速度 (≥ 12,000 x g) で 2 分間遠心分離し、上清 150 μL を新しい標識チューブに移します。ビーズや細胞の破片を移さないように注意してください。</li>
	<li>クリーンアップ磁気ビーズを室温まで30分間平衡化させ、使用前に完全に再懸濁するように完全にボルテックスします。</li>
	<li>180 μL (1.2倍容量) のクリーンアップ磁気ビーズを加え、ピペッティングで 10 回上下させて混合します。室温で2分間インキュベートします。</li>
	<li>磁気ラックに置き、溶液がクリアするのを~2分間待ちます。P200ピペットを使用して、磁気ビーズを乱さないように上清を慎重に廃棄します。</li>
	<li>チューブを磁気ラックに置いたまま、調製したばかりの70 % (v / v) エタノール 500 μL を加え、反対側のチューブ壁に沿って磁気ビーズに分注します。30秒待ちます。</li>
	<li>手順4.5を繰り返します。- 4.7.合計2回の洗浄。最後の洗浄が終わったら、P10ピペットで残留エタノールを取り除きます。ビーズを短時間~2分間乾燥させます。</li>
	<li>ビーズペレットが不透明になった直後に、チューブを磁気ラックから取り出し、20 μL の Low EDTA Tris Buffer に再懸濁します。ビーズが乾燥してひび割れないようにしてください。</li>
	<li>ピペッティングまたはボルテックスで混合し、すべてのビーズが溶液中にあることを確認します。室温で5分間インキュベートします。</li>
	<li>マグネットラックに置き、溶液が透明になるのを~2分間待ちます。溶出したDNAを新しいウェルラベルチューブに移し、ダウンストリーム分析を行います。抽出したDNAを&lt;20 μLで吸引し、磁気ビーズのキャリーオーバーを回避します。</li>
</ol>
5. マイコバクテリアDNAのqPCR列挙
<ol>
	<li>マイコバクテリア atpE (Rv1305) の 99 ヌクレオチドを標的とする定量的 PCR を使用してマイコバクテリア DNA を定量するには、5 μL のユニバーサルプローブマスターミックス (2x)、フォワードプライマー (5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGG-3'、10 μM) の各 0.4 μL、およびリバースプライマー (5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3'、10 μM)、0.2 μL の TaqMan プローブ (5'-VIC-AGGAGGAACACCGGTGGCGA-MGB-3') を含む 1 サンプルあたり 10 μL の反応混合物を氷上に組み立てます。 10 μM)、2 μL の DNA テンプレート、2 μL のヌクレアーゼフリー水 (表 3)。</li>
	<li>次の熱サイクル条件を使用して反応を実行します:最初の変性を95°Cで60秒間、続いて95°Cで10秒間、60°Cで30秒間の35サイクル(ここでキャプチャし、2.11°C/sのランプレートを使用。 表4)。 注:この場合、qPCR は、QuantStudio 3 リアルタイム PCR システム上で VIC 標識プローブを用いた TaqMan アッセイを使用して実施しました。</li>
	<li>すべてのサンプル、標準試料、およびコントロールをテクニカルトリプリケートで分析します。精製した 結核菌 DNAの段階希釈液を使用して標準曲線を作成します。解析ソフトウェアを使用して相対定量分析を実行します。</li>
	<li>得られた相対定量値をCSV形式にエクスポートし、R Studio(バージョン2024.09.1+394)を使用して視覚化し、抽出方法間でDNA収量を比較する箱ひげ図を生成します。</li>
</ol>

<ol><li>Jouet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+amplicon+sequencing+for+culture-free+prediction+of+susceptibility+or+resistance+to+13+anti-tuberculous+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Deep amplicon sequencing for culture-free prediction of susceptibility or resistance to 13 anti-tuberculous drugs.</a> Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).</li>
<li>George, S., et al. DNA Thermo-Protection Facilitates Whole Genome Sequencing of Mycobacteria Direct from Clinical Samples by the Nanopore Platform. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGeorge%2C+S+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2020).</li>
<li>Doyle, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+whole-genome+sequencing+of+sputum+accurately+identifies+drug-resistant+mycobacterium+tuberculosis+faster+than+MGIT+culture+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct whole-genome sequencing of sputum accurately identifies drug-resistant mycobacterium tuberculosis faster than MGIT culture sequencing.</a> J Clin Microbiol. 56 (8), e00666-e00718 (2018).</li>
<li>Noordhoek, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+Specificity+of+PCR+for+Detection+of+Mycobacterium+Tuberculosis%3A+A+Blind+Comparison+Study+among+Seven+Laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and Specificity of PCR for Detection of Mycobacterium Tuberculosis: A Blind Comparison Study among Seven Laboratories.</a> J Clin Microbiol. 32, (1994).</li>
<li>Jaber, M., Rattan, A., Verma, A., Tyagi, J., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+DNA+extraction+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tubercle+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">A simple method of DNA extraction from Mycobacterium tuberculosis.</a> Tubercle Lung Dis. 76 (6), 578-581 (1995).</li>
<li>Käser, M., Ruf, M. T., Hauser, J., Marsollier, L., Pluschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+method+for+preparation+of+DNA+from+pathogenic+and+environmental+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimized method for preparation of DNA from pathogenic and environmental mycobacteria.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (2), 414-418 (2009).</li>
<li>De Almeida, I. N., Da Silva Carvalho, W., Rossetti, M. L., Costa, E. R. D., De Miranda, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Six+Different+DNA+Extraction+Methods+for+Detection+of+Mycobacterium+Tuberculosis+by+Means+of+PCR-IS6110%3A+Preliminary+Study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Six Different DNA Extraction Methods for Detection of Mycobacterium Tuberculosis by Means of PCR-IS6110: Preliminary Study.</a> BMC Res Notes. 6, 561(2013).</li>
<li>Pan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+DNA+extraction+methods+for+detecting+Mycobacterium+tuberculosis+by+real-time+PCR+and+its+clinical+application+in+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of four DNA extraction methods for detecting Mycobacterium tuberculosis by real-time PCR and its clinical application in pulmonary tuberculosis.</a> J Thorac Dis. 5 (3), 251-257 (2013).</li>
<li>Kelly-Cirino, C., Niles, J., Ray, B., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKelly-Cirino%2C+C+%22Maximizing+Mycobacterium+Tuberculosis+DNA+Yield+for+Molecular+Methods+with+PrepIT.MAX%22">Maximizing Mycobacterium Tuberculosis DNA Yield for Molecular Methods with PrepIT.MAX</a>. PD-WP-00045 (Issue 2/2015-11), Accessed January 27 (2020).</li>
<li>Votintseva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Same-day+diagnostic+and+surveillance+data+for+tuberculosis+via+whole-genome+sequencing+of+direct+respiratory+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Same-day diagnostic and surveillance data for tuberculosis via whole-genome sequencing of direct respiratory samples.</a> J Clin Microbiol. 55 (5), 1285-1298 (2017).</li>
<li>Odumeru, J., Gao, A., Chen, S., Raymond, M., Mutharia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Bead+Beater+for+Preparation+of+Mycobacterium+Paratuberculosis+Template+DNA+in+Milk%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Use of the Bead Beater for Preparation of Mycobacterium Paratuberculosis Template DNA in Milk.</a> Can J Vet Res. 65 (4), 201-205 (2001).</li>
<li>Oh, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Effective+Method+of+RNA+Extraction+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An Effective Method of RNA Extraction from Mycobacterium tuberculosis.</a> Ann Clin Microbiol. 19 (1), 20-23 (2016).</li>
<li>Miyata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+quality+of+dna+extracted+by+two+techniques+from+mycobacterium+tuberculosis+for+fast+molecular+identification+and+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of the quality of dna extracted by two techniques from mycobacterium tuberculosis for fast molecular identification and genotyping.</a> Braz J Microbiol. 42 (2), 774-777 (2011).</li>
<li>Votintseva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+DNA+extraction+for+whole-genome+sequencing+from+early+positive+liquid+%28MGIT%29+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial DNA extraction for whole-genome sequencing from early positive liquid (MGIT) cultures.</a> J Clin Microbiol. 53 (4), 1137-1143 (2015).</li>
<li>Kolia-Diafouka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Lysis-Extraction+Method+Combined+With+IS6110-Amplification+for+Detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+Paucibacillary+Sputum+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimized Lysis-Extraction Method Combined With IS6110-Amplification for Detection of Mycobacterium tuberculosis in Paucibacillary Sputum Specimens.</a> Front Microbiol. 9, 2224(2018).</li>
<li>Bonnet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Evaluation+of+GeneLEAD+VIII+DNA+Platform+Combined+to+Deeplex+Myc-TB+Assay+to+Detect+in+8+Days+Drug+Resistance+to+13+Antituberculous+Drugs+and+Transmission+of+Mycobacterium+tuberculosis+Complex+Directly+From+Clinical+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Evaluation of GeneLEAD VIII DNA Platform Combined to Deeplex Myc-TB Assay to Detect in 8 Days Drug Resistance to 13 Antituberculous Drugs and Transmission of Mycobacterium tuberculosis Complex Directly From Clinical Samples.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 707244(2021).</li>
<li>Mann, B. C., et al. Systematic review and meta-analysis of protocols and yield of direct from sputum sequencing of Mycobacterium tuberculosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMann%2C+BC+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Schwab, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+evaluation+of+nanopore+targeted+next-generation+sequencing+to+predict+drug-resistant+tuberculosis+from+native+sputum+in+South+Africa+and+Zambia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Field evaluation of nanopore targeted next-generation sequencing to predict drug-resistant tuberculosis from native sputum in South Africa and Zambia.</a> J Clin Microbiol. 63 (3), e0139024(2025).</li>
<li>Colman, R. E., Seifert, M., De la Rossa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+culture-free+targeted+next-generation+sequencing+for+diagnosing+drug-resistant+tuberculosis%3A+a+multicentre+clinical+study+of+two+end-to-end+commercial+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluating culture-free targeted next-generation sequencing for diagnosing drug-resistant tuberculosis: a multicentre clinical study of two end-to-end commercial workflows.</a> Lancet Infect Dis. 25 (3), 325-334 (2025).</li>
<li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-On-Magnetic-Beads+%28BOMB%29%3A+Open+platform+for+high-throughput+nucleic+acid+extraction+and+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB): Open platform for high-throughput nucleic acid extraction and manipulation.</a> PLoS Biol. 17 (1), e3000107(2019).</li>
<li>Limberis, J. D., Metcalfe, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turbolysis%3A+A+low-cost%2C+small+footprint+alternative+to+commercial+bead+beaters+for+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22HardwareX%22%5BJournal%5D)">Turbolysis: A low-cost, small footprint alternative to commercial bead beaters for cell lysis.</a> HardwareX. 19, e00576(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.1 mm ジルコニア ケイ酸塩ビーズ</td><td>バイオスペック製品</td><td>11079101z</td><td>マイコバクテリア細胞を溶解するためのビーズビートステップに使用されるビーズ</td></tr><tr><td>AMPure XPビーズ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63880</td><td>溶解後のDNAクリーンアップ用磁気ビーズ</td></tr><tr><td>EDTA(0.5M、pH 8.0)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9260G</td><td>カスタムTriton/低EDTAバッファーコンポーネント</td></tr><tr><td>ファストプレップ 24</td><td>MPbio, アメリカ</td><td>116004500</td><td>6.5 m/sのビードビート用装置</td></tr><tr><td>フォワードプライマー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>カスタム合成</td><td>プライマー配列:AATTCCTGGTGTAGCGGTGG</td></tr><tr><td>H2O(水、分子生物学グレード)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2819-1</td><td>カスタムTriton/低EDTAバッファーコンポーネント</td></tr><tr><td>ルナユニバーサルプローブ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M3004</td><td>マイコバクテリアDNA計数用qPCR試薬</td></tr><tr><td>MycoPrepキット</td><td>BDの</td><td>SKU/REF 240863</td><td>NALC-NaOH喀痰処理のためのBD MycoPrep検体消化</td></tr><tr><td>NaCl(塩化ナトリウム、5M溶液)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9759</td><td>カスタムTriton/低EDTAバッファーコンポーネント</td></tr><tr><td>PBSの</td><td>ミリポアシグマ</td><td>P2272</td><td>喀痰処理</td></tr><tr><td>リバースプライマー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>カスタム合成</td><td>プライマー配列:GTTTACGGCGTGGACTACCA</td></tr><tr><td>TaqManプローブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>カスタム合成</td><td>プローブシーケンス:AGGAGGAACACCGGTGGCGA</td></tr><tr><td>トリス-HCl(1M、pH 8.0)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9855G</td><td>カスタムTriton/低EDTAバッファーコンポーネント</td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>28314</td><td>カスタムTriton/低EDTAバッファーコンポーネント</td></tr></tbody></table>

カスタムバッファーでのビーズビーティングとそれに続く ngs ワークフローを使用したマイコバクテリア dna 抽出

Mycobacterial DNA Extraction using Bead Beating in Custom Buffer Followed by NGS Workflow

我々は、培養 された結核菌 と 結核菌 のスパイク喀痰サンプルの両方でDNA抽出プロトコルを試験した(各条件でn = 3)。培養 した結核菌 H37Rv mc² 7901を用いて、50μLあたり8.4×106 細胞にインプットを標準化しました。これは、200GUでMGIT培養物1mLに相当します。喀痰実験では、非結核呼吸器疾患(市販)の患者からプールした1 mLの喀痰に2つの異なる細菌濃度(50,000、約1+の喀痰塗抹グレード、および10,000桿菌、約わずかな喀痰塗抹グレード)でスパイクして、さまざまな細菌負荷に対するこの方法の性能を評価しました。
当社は、単一コピー遺伝子を標的とするカスタム TaqMan qPCR を使用して DNA 収量を評価しました(図 2)。純粋な培養物やスパイクした喀痰を含むすべてのサンプルで結 核菌 DNAを検出し、複製間の変動はほとんどありませんでした。しかし、わずか10,000個の細胞でスパイ...

カスタムバッファーでのビーズビーティングとそれに続く NGS ワークフローを使用したマイコバクテリア DNA 抽出

Tuberculosis is a deadly disease, and the emergence of antibiotic drug resistance in the causative agent bacterium, Mycobacterium tuberculosis, worsens ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

2つの植物細胞小器官DNA濃縮方法の比較および最適化が提示される：従来の分画遠心分離およびメチル化状態に基づく全gDNAの分画。得られたDNAの量と品質を評価し、短期間の次世代シーケンシングでの性能を実証し、長時間読み取り単一分子シークエンシングで使用する可能性について検討します。...

次世代シークエンシングに適した植物オルガネラDNA濃縮法の最適化と比較分析

シーケンスの生体分子のナノ細孔技術、幅広い病原体、食品安全監視、ゲノム解析、metagenomic 環境の監視、および細菌の特性の識別を含む生命科学で抗生物質耐性。この記事でメタゲノム土壌 DNA...

ナノポア DNA シーケンス メタゲノム土壌分析用

ここでは、土壌、根圏、ルート endosphere 内細菌叢解析・増幅シーケンス...

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

長い読み取りシーケンス大きく複雑なゲノム構造の変化の特徴付けとアセンブリを容易にします。ナノポア ベースのシーケンスのプラットフォームで超長いシーケンスを生成する方法について述べる。アプローチは、人間の細胞から中程度の範囲でプラスミド読み取りの数百人を生成する変更したライブラリの準備に続いて最適化された DNA...

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ここでは、自由に利用可能なツールを使用して16S...

2段階PCRと次世代16S rRNA遺伝子シーケンシングを用いての微生物叢解析

ここで説明するDNA抽出プロトコルは、蚊から高品質のDNA抽出を生成するために磁気ビーズを使用する。これらの抽出は、下流の次世代シーケンシングアプローチに適しています。...

次世代シーケンシングのための磁気ビーズベースの蚊DNA抽出プロトコル

遺伝子発現は、遺伝子プロモーターと遠位調節要素との相互作用によって調節される。ここでは、低入力のCapture...

希少細胞集団におけるプロモーター中心の時空間ゲノム構造を研究するための統合ワークフロー

本稿では、マトリックスベースの抽出法と磁気ビーズ精製を組み合わせた、除染された喀痰からのDNA抽出に最適化された方法を提示し、ダウンストリームの標的次世代シー ケンシングに取り組みます。...

除染された喀痰サンプルの標的次世代シーケンシングのためのマトリックスベースのDNA抽出

このプロトコルは、マイコバクテリアから高品質なDNAを抽出するためのCTAB法を説明し、硬く菌酸豊富な細胞壁による課題を克服します。このプロセスには、酵素による消化、CTABによる細胞溶解、有機抽出およびエタノール沈殿によるDNA精製が含まれます。この方法は分子研究に適したDNAを生成し、マイコバクテリア研究にも信頼性があります。...

セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイド技術によるマイコバクテリウム種からの全ゲノムデオキシリボ核酸抽出

ここでは、標的濃縮を使用して、臨床サンプルからの細菌性感染症の全ゲノム配列決定を可能にするプロトコルを提示します。この新しい症候群パネルベースの方法は、豊富なヒト DNA と低い細菌量という課題を克服し、 クラミジア トラコマチス、 淋菌、梅 毒トレポネーマ、 マイコプラズマ...

ターゲットエンリッチメントワークフローを使用した臨床サンプルからの全細菌ゲノムの生成

本研究では、染色体配列が既に知られている場合や興味がない場合のプラスミドのナノ孔シーケンシングのワークフローを記述しています。初期のプラスミドDNA濃縮ステップは、最適なプラスミド配列深度を確保し、フローセルあたりのシーケンス可能なサンプル数を最大化します。...

ナノ孔シーケンシングを用いたロングリードプラズミドシーケンシングおよびアセンブリ ワークフロー

学ぶ ビーズビーティングとDNAキャプチャービーズ精製を用いたMycobacterium tuberculosisからの高速DNA抽出法。資源制限環境でも次世代シーケンスに対応し、薬剤耐性検出を支援する実用的プロトコルです。

カスタムバッファーでのビーズビーティングとそれに続く NGS ワークフローを使用したマイコバクテリア DNA 抽出

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