メタボロミクスのためのサンプル調製:代謝物プロファイリングのための細胞サンプル調製法

メタボロミクスは、細胞内に存在する代謝物を同定し、定量する研究です。サンプルを調製するには、まず、乳がん細胞と増殖培地を、テストとコントロールとラベル付けされた2つのプレートに播種します。摂氏37度で3日間インキュベートします。次に、培地を取り出し、テストプレートにエストラジオールを、コントロールプレートにプレーン培地を追加した新しい培地を追加します。

エストラジオールは、乳がん細胞のエストロゲン受容体アルファに結合して特定の発現を誘導し、代謝産物組成の変化を引き起こします。プレートを所望の期間インキュベートします。培地を氷冷リン酸緩衝生理食塩水またはPBSに交換して細胞を洗浄し、氷冷アセトンを加えます。氷冷試薬はプロテアーゼの作用を止め、タンパク質の分解を防ぎます。

次に、スクレーパーを使用して細胞をプレートから取り外し、ピペットを使用して細胞をチューブに移します。この細胞懸濁液の20マイクロリットルを血球計算盤に取り、細胞の数を数えます。サンプルは、さらなる分析に使用するまで摂氏マイナス80度で保管します。以下のプロトコールでは、ガスクロマトグラフィーおよび質量分析のためにMCF-7細胞からサンプルを調製します。

テキストプロトコールに従って培養したMCF-7細胞を使用して、5ミリリットルの氷冷1x PBSをプレートに加えます。次に、PBSを取り外す前に、プレートを数回傾けます。最後の洗浄後、できるだけ多くのPBSを取り外して、さらに2回繰り返します。各プレートに750マイクロリットルの予冷アセトンを加えて細胞をこすり落とし、次に2つのプレートから細胞を氷上の2ミリリットルのチューブに結合します。

ノーマライゼーションのために細胞をカウントするには、各処理について、細胞定量用に2つの追加のプレートを使用します。次に、細胞をプレートから分離するために、2ミリリットルのHEバッファーを加え、5分間インキュベートします。HEバッファーでピペッティングして細胞を完全に混合します。

次に、血球計算盤で20マイクロリットルの細胞溶液を使用して、顕微鏡で細胞数をカウントします。サンプルをマイナス80°Cで保存してから、ガスクロマトグラフィー質量分析を使用して代謝物を同定および定量します。テキストプロトコルに従って統合解析を実行します。