TransFLP - 遺伝的に変更する方法コレラ菌自然形質転換およびFLP組換えに基づき

この手順の目的は、自然な形質転換とフリップの組み合わせに基づくこの迅速で不十分な方法を使用して、ビオクレイを遺伝的に操作することです。これは、キチンが形質転換の自然な誘導因子であるため、最初に適切なキチン源を準備することによって達成されます。第2ステップでは、2ラウンドのPCRを用いてDNAコンストラクトを作製し、その自然形質転換を行うことで、プラスミドPBRフリップを含む細菌がPCRフラグメントを取り込み、そのゲノムに取り込むことができます。

次に、温度アップシフトを使用して、プラスミドにコードされたリパーゼ酵素を誘導し、フリップ組換えターゲットまたはFRT部位に隣接する抗生物質耐性カセットを除去します。最終ステップでは、細菌はプラスミドをコードするFLPから硬化します。最終的に、PCRとシーケンシングを使用して、遺伝子操作が成功したことを示します。

この手法は、自殺プラスミドを使用して遺伝子を操作するなどの既存の方法に対する主な利点は、この方法が非常に高速で効率的であることです。標準的な1.5ミリリットルのプラスチックチューブに50〜80ミリグラムのキチンフレークのサンプルを秤量することから始め、次にチューブの蓋を開いたままにし、オートクレーブが呼び出された後、フレークをオートクレーブしますすぐに蓋を閉じ、オートクレーブキットを室温でフレークに保管します目的のDNA領域を増幅するには、少なくとも6つのオリゴヌクレオチドが必要です。 また、FRTはPCRによって抗生物質カセットを挟みました。また、挿入されたPCRフラグメントの外側に一対のオリゴヌクレオチドプライマーを含めることも推奨されます。

これにより、FRTに隣接する抗生物質耐性カセットの設計、2番、3番、4番、5番のオリゴヌクレオチドの統合と正しい切除を慎重にチェックできます。プライマー2とプライマー5は、ゲノムDNAとプライマーに十分にひざまずくことができるように、少なくとも28塩基対を含んでいなければなりません。3と4は、テンプレートとしてプラスミドを含むFRTで構築する必要があります プライマー2と5 プライマー2と5の間の5プライムエンドでそれぞれ広範な補完ベースペアリングを可能にするために、プライマー2と5。

次に、PCRの最初のラウンドでは、オリゴヌクレオチド1とオリゴヌクレオチド2を使用して、カスタム設計コンストラクトの実験対象領域の上流領域を増幅するための3つの同時かつ独立したPCR反応の最初の反応を準備します。並行して、オリゴヌクレオチド3および4を使用して2回目のPCR反応を調製し、FRTに隣接した抗生物質カセットを増幅します。例えば、この実験では、カニン耐性をコードするA PH遺伝子を用いた。

同時に、オリゴヌクレオチド5および6およびゲノムDNAをテンプレートとして使用して3回目のPCR反応を調製することにより、下流のDNA領域を増幅します。次いで、PCR断片の3つすべてを精製した後、3つのサンプルすべてについてPCR反応を開始し、第1ラウンドで得られた3つのフラグメントすべての等量との混合物をテンプレートとして使用して、第2ラウンドのPCRを実施する。この増幅は、オリゴヌクレオチド1とオリゴヌクレオチド6によって触媒されます。

得られたPCRフラグメントは、自然形質転換実験で形質転換DNAとして機能します。Vコレラ細胞を増殖させた後、好気的に濃縮された培地を摂氏30度で調製します。室温で遠心分離することにより、細菌を回収します。

次に、細菌培養物をフレーク状のカイトに移し、細胞懸濁液を摂氏30度で一晩インキュベートします。次に、少なくとも200ナノグラムの第2ラウンドPCR由来フラグメントを細菌細胞懸濁液に慎重に混合します。キチン質の表面から細菌を広範囲に剥がさないように注意し、この溶液を摂氏30度で動かさずに別の日のためにインキュベートします。

次に、ボルテックス、PBRフリッププラスミドを保有する細菌について少なくとも30秒間精力的に培養し、アンピシリンを含む二重選択プレート上に細胞溶液の100〜300マイクロリットルを広げます。プレート内の他の抗生物質に加えて、コロニーが見えるまで、細菌細胞培養物を摂氏30度でインキュベートします。次に、選択プレートから単一の形質転換体を分離します。

このステップは、アンピシリンを含むLB寒天プレートで37°Cで16〜24時間細菌を増殖させることから始めます。オプションのステップとして、PBRフリッププラスミドからのフリップの発現が高温で抑制されるため、温度を摂氏40度に2〜3時間変更します。摂氏37度でさらに8時間のインキュベーションを行った後、細菌を新しいプレートに移します。

次に、抗生物質含有寒天プレートと抗生物質不使用の寒天プレートでクローンを並行して制限して、抗生物質感受性をテストし、得られた単一の抗生物質感受性コロニーを単離します。このステップは、摂氏30度の好気性条件下で一晩培養し、抗生物質を使用せずに培地を濃縮することから始めます。翌朝、午後のストリークまたはプレーンLB寒天プレート上での培養物のプレート希釈で新鮮な抗生物質を含まない培地で一晩培養物を1対100の比率で希釈することにより、3〜6時間新しい培養物を増殖させ、その後、コロニーが見えるまで30°Cでさらに8〜16時間プレートをインキュベー

この最初の実験では、隣接する遺伝子CTXAとCTXBを削除することを目指しました。トランスフリップ法のためのオリゴヌクレオチドは、親株をちょうど示したように生成し、C-T-X-A-Bの元のDNA遺伝子座の代わりにFRTに隣接する抗生物質耐性カセットを保有する中間株、およびC-T-X-A-Bについて削除され、耐性カセットから遊離された最終株は、その遺伝子型について全て試験され、トランスフォーミングPCRフラグメントにひざまずかないプライマーを用いて、この実験のために全面的にPCRを行った。 しかし、染色体DNAに限られます。PCR断片を標準的なエアロゲル電気泳動によって分離し、そのサイズを決定しました。

レーン1では、世界のB型コレラ株が予想されるフラグメントサイズである3,143塩基対に位置していました。レーン 2 では、デルタ株 C-T-X-A-B-F-R-T に由来する PCR フラグメントを使用できます。FRTは3, 162塩基対に位置していました。

そしてレーン3では、デルタctx A B FFR TP CRフラグメントは、1KBのはしごと比較して1, 769塩基対に位置していました。ゲノム島全体を除去した2番目の例では、Vibrio Pathogenicity島またはVPI島がこの実験のターゲットとして選択されました。トランスフリップ方式は2つのステップで変更されました。

まず、カナマイシン耐性遺伝子の組み込みは、PI oneの開始時に単一のFRT部位によって進められました。次に、2回目の自然形質転換が行われ、追加の抗生物質耐性マーカー、すなわちゲンタマイシン耐性の挿入が可能になり、続いて病原性アイランドの端に2番目のFRT部位が挿入されました。それぞれのプライマーペアは各ゲル写真の上に示されており、トランスFLP法は今示したように続けられました。

親株、中間株、最終株はすべて、レーン1の精製されたゲノムDNAのPCRによって検証されました。野生型Vコレラ株のPCR断片をレーン2で実行した。このPCR断片をGM FRTの1株VPI株から得られたものをGM FRTに走査した。

そしてレーン3では、FRT由来PCR産物のデルタ株VPI株を解析しました。プライマーペアは、各ゲル写真の上に示されています。最後のひずみには、VPI全体のひずみがありません。

この3番目の例では、A T 7 RNAポリメラーゼ依存性プロモーター配列を、標準プロトコルからわずかに変更を加えたトランスフリップ法を用いた自然形質転換の主要な調節因子であるGene T foxと上流に組み込みました。T seven RNA依存性プロモーターコンセンサス配列は、オリゴヌクレオチド番号4および5番にオーバーハングとして含まれていたため、このDNA配列は染色体内で維持されました。抗生物質耐性カセットを切除した後でも、コンストラクトをV色化株を含むT7 RNAポリメラーゼに統合しました。

この株では、T 7 RNAポリメラーゼ遺伝子の発現をLAC UV 5プロモーターによって駆動し、T FoxのT seven RNAポリメラーゼ依存性発現をテストするために、LB培地で自然形質転換アッセイを行った。Gene T Foxに先行するT 7依存性プロモーターを欠く親株は、リッチ培地でのT FOX転写の欠如およびその天然誘導剤キチンの不在により、これらの条件下で自然に形質転換することはできません。この表現型は、T seven RNAポリメラーゼがIPTGによって人工的に誘導されたかどうかとは無関係でした。

しかし、コンピテンシーGene T Foxの上流にT seven RNAポリメラーゼ依存性プロモーターを含むトランスフリップ生成株は、LB培地中のLAC UV 5プロモーターの漏れにより、実際には自然に形質転換可能な濃縮培地でした。産生されたT seven RNAポリメラーゼは、IPTGによる誘導なしに、T seven RNAポリメラーゼ依存性プロモーターからT FOXをすでに転写しています。これにより、自然な能力と形質転換が開始され、統合されたT-7 RNAポリメラーゼ依存性プロモーター配列の機能が確認されました。

この表現型は、LAC UV 5プロモーターIPTGの誘導剤の添加によるT seven RNAポリメラーゼの完全誘導によって有意に増強されました。このビデオを見た後、キチン誘発性自然形質転換とフリップ組換えの組み合わせを使用してVIコレラを遺伝的に操作する方法についてよく理解しているはずです。この手法を習得すると、遺伝子やゲノムアイランドを削除したり、わずか数日でDNA配列を部位特異的に統合