Name: TransFLP - 遺伝的に変更する方法コレラ菌自然形質転換およびFLP組換えに基づき (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: 学ぶV. choleraeの遺伝子操作法。自然形質転換とFLP組換えを用いて、遺伝子欠失や配列統合を迅速かつ効率的に行う手法を解説。PCRとシーケンスで検証可能。

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私は、技術支援のためのオルガ·デ·ソウザ·シルバを承認したいと思います。この作品は、スイス国立科学財団（SNSF）グラント31003A_127029によってサポートされていました。

TransFLP法（ 図1）は、3つの異なるアプローチが例示される：I）Vの病原性決定因子をコードする2つの隣接した遺伝子の欠失コレラ菌 （ 例えば 、ΔctxAB）、病原性島のⅡ）除去（ 例えば 、ΔVPI-1）、およびその後にそのを可能にする目的遺伝子の上流にT7 RNAポリメラーゼ依存性のプロモーター配列のIII）の統合それぞれのひずみ背景に人工的な発現（ 例えば、T7-tfoX）（ 図2）。 1。キチンフレークの調製<ol><li>標準1.5mlのプラスチックチューブでキチンフレークの重量50から80ミリグラム。これは大量に調製することができます。キチンフレークは、Sigma（カタログ番号C9213）から市販されている。 </li><li>チューブの蓋が開いたままのフレークをオートクレーブ。 </li><li>オートクレーブを冷却した後、直ちに蓋を閉じます。 </li><li>ストアオートクレーブ処理キチンフレーク室温で。 </li></ol> 2。オプション：Vの人工変換FLPリコンビナーゼをコードするプラスミドでコレラ <ol><li>エレクトロ準備V.標準的な方法11を用いて 菌の細胞。 -80℃でコンピテント細胞のアリコート℃で保存</li><li>エレクトロにプラスミドpBR-FLP 5のレギュラーミニ準備中1-2μlを加えV.コレラ菌は、細胞およびエレクトロポレーションキュベット（0.2 cm商品のギャップ幅）に混合物を移す。 </li><li> 1.6 kVでパルスを印加します。 </li><li> 0.9ミリリットルのSOC培地を加え、穏やかに、標準の14 mlチューブに細胞を移す。 30℃で2.5から3時間にわたり非移動インキュベート℃に</li><li>プレートを100μl、30℃で一晩100μg/ mlのアンピシリンとインキュベートを含むLBプレート上に300μlの。 </li><li>将来TransFLP実験のグリセロールストックのような単一のクローンや店舗を精製する。 </li></ol> 3。オリゴヌクレオチドの設計およびポリメラーゼ連鎖反応<ol><li>少なくとも6つのオリゴヌクレオチドは、目的とするDNA領域（複数可）と同様にPCRによりFRT-挟まれた抗生物質カセット（ 図3）を増幅する必要があります。また、挿入されたPCR断片外オリゴヌクレオチドプライミングのペアを含めることをお勧めします。これは、統合とFRT-挟ま抗生物質耐性カセット（ 例えば 図3〜図5に&#39;CHKアップ&#39;と&#39;CHKダウン&#39;プライマーとして描かれている）の正確な切除をチェックすることができます。 </li><li>オリゴヌクレオチド＃2、＃3、＃4、＃5の注意を払って設計を行ってください。彼らは十分に鋳型DNAに（ 例えば 〜28 bp）をアニールすることができるはずです。テンプレートDNA、プライマー＃2と＃5などpROD17 12及びプライマー＃3と＃4のPBR-FRT-KAN-FRT（本研究）（としてFRT-カンイFRT含有プラスミドDNAのゲノムDNA（gDNA）です図3A）。 </li><li> （それぞれ、＃2 /＃3、＃4 /＃5の間にそれらの5 &#39;末端の塩基対広範図3Aを許可＃5＃2プライマーを設計</stronグラム]&gt; [挿入図）。 PCR法の2つのラウンドが続きます。 </li><li> PCRの第1ラウンドとして3独立したPCR反応を行う。最初のものは、オリゴヌクレオチド＃1と＃2を用いて遺伝子/ DNA関心領域の上流領域を増幅する。 PCR法は、細胞内での相同組換えを可能にするために、長さが少なくとも500bpの断片をもたらすべきである。短い断片（約250 bp）は8で十分できますが、推奨されていません。 </li><li>並列にFRT-挟ま抗生物質カセットを増幅する第2のPCRを行う。例はここで提供されるために私達は主にAPH（館 R）を使用しました。この反応（ 図3A）のためのオリゴヌクレオチド＃3と＃4を使用します。 </li><li>付随して、PCR法（第三のサンプル）によって下流のDNA領域を増幅する。 PCR断片はまた、長さが少なくとも500bpである必要があります。テンプレートおよびオリゴヌクレオチド＃5と＃6（ 図3A）にgDNAを用いてPCRを行う。 </li><li>すべての3つのPCR産物の精製後断片は、PCRの第2ラウンドを行う。テンプレートとして、最初のラウンドで得られたすべての3つの断片の等量混合物を使用しています。増幅は、オリゴヌクレオチド＃1と＃6によって触媒される。得られたPCR断片（ 図3B）は、自然形質転換実験（ 図1）でDNAを変換として機能します。 </li></ol> 4。キチン誘起自然形質転換<ol><li>成長V. 30℃における富栄養培地で好気的にコレラ菌は、細胞は、約0.5の600nmでの光学密度に達するまで。 </li><li>遠心分離により菌体を回収します。 DASW 2容量の中に細胞を再懸濁する前に、一度定義する人工培地（DASW 6）でペレットを洗浄します。無菌キチンフレーク（ポイント1で説明）の50〜80 mgの培養液1 mlを加える。文化への細菌港プラスミドpBR-FLP（オプション2点）、ADDアンピシリン（50μg/ ml）の場合。運動せずに16から24時間30℃でインキュベートする。 </li><li> G＆追加eであり、第2回目のPCR由来断片（ポイント3で説明）は200 ng。広くキチン表面から細菌を切り離さずに慎重に混ぜる。運動なしで24時間30℃でインキュベートする。 </li><li>渦≥30秒広く文化。選択LB培地プレート（ここで提供される例については、 例えばカナマイシン、ゲンタマイシン含有LBプレート）上に100から300μlを広げた。細菌は他の抗生物質に付随してアンピシリンを追加することにより、PBR-FLPプラスミドを抱いている場合、ダブル選択プレートを使用しています。 16から24時間30℃でプレートをインキュベートするか、コロニーが見えるようになるまで。 </li><li>選択プレートから単一の形質転換体を単離する。このような形質転換体は、ダブルクロスオーバーイベントによるPCR断片によってオリジナルの染色体座を交換しました。抗生物質カセットを取り外す必要はありません場合にはこれらの株は直接さらなる実験のために使用することができます。 </li></ol> 5。 FLPによる選択カセットの除去（複数可）組換え<ol><li>自然形質転換試験の前に行われていない場合、ポイント2で説明したように人為的にPBR-FLPプラスミドを使って形質転換体を変換する。 </li><li> 16から24時間37℃でアンピシリンを含むLB寒天プレート上で細菌を培養。オプション：40に2〜3時間の間に温度を変更℃のプラスミドpBR-FLPからFLPの表現として、より高い温度での5,10 -デ抑制され、約後に新鮮なプレートへの転送細菌。インキュベーションの8時間。 </li><li>抗生物質含有および抗生物質を含まない寒天プレート上で並行してクローンをrestreakingによって、抗生物質感受性（ 図1カナマイシンにはここを実証）のテスト。シングル感受性コロニーを分離します。あなたはさらにTransFLPを使用して他の削除/挿入した株を変更する場合はグリセロールストックとしてアンピシリン耐性クローンをフリーズします。 </li></ol> 6。プラスミドキュア<ol><li>好気的条件下で一晩培養すると30℃どんな抗生物質を添加することなくリッチな培地を使用しています。 </li><li>オプション：新鮮な抗生物質を含まない培地で一晩培養した培養液の1:100希釈することにより、3から6時間、新鮮な培養する。 </li><li>板やスジ平野LB寒天プレート（S）で文化の希釈（s）および30℃にて8月16日時間のためのC（コロニーが見えるようになるまで）。 </li><li>抗生物質含有および抗生物質を含まない寒天プレート（ 図1）上で並行してクローンをrestreakingによるクローンのアンピシリン感受性をテストします。グリセロールストックとしてアンピシリン感受性株をフリーズします。 </li></ol>

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特別な利害関係は宣言されません。

TransFLP方法は、上述の他の場所と5は広く、我々の研究室で使われてきました。実現可能である遺伝子操作の種類は、とりわけ以下のとおり、単一の遺伝子や遺伝子群の欠失、ゲノムの島々の欠失（ 例えば 、VPI-1）は、目的の遺伝子の上流配列の挿入（ 例えば 、プロモーター配列）と挿入を特定の遺伝子（ 例えば 、符号化アフィニティータグ）の末尾のシーケンス。 TransFLPのインポート前提条件は、そのそれぞれのV です 。 コレラ株は自然に変形可能である。これは、特にコレラ患者由来の分離株で、時々そうではありません。このような株は頻繁にクオラムセンシング、HapR 17の主要な調節因子をコードする遺伝子の中に、クオラムセンシング回路例内変異している。 hapRのコピーバックを提供することがexempliとしてこれらの菌株6に自然形質転換能を復元HapR欠損株N16961 <...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>キチンフレーク</td><td>シグマ</td><td> C9213 </td><td>必要なオートクレーブ</td></tr><tr><td>オプション：Micropulser場合（抗生物質カセットはPBR-FLP上にエンコードFlpリコンビナーゼによって切除されるべきである） </td><td>バイオラッド</td><td> 165-2100 </td><td>または同等のエレクトロポ</td></tr></tbody></table>

transflp - 遺伝的に変更する方法<em&gt;コレラ菌</em&gt;自然形質転換およびflp組換えに基づき

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

いくつかの方法は1-3細菌の染色体を操作することが可能です。これらのプロトコルの大部分は、条件付きで複製プラスミドの挿入（1,2 PIR依存または温度感受性レプリコンを宿すなど ）に依存しています。これらのプラスミドは、相同性媒介組換えに基づく細菌染色体に組み込まれています。このような挿入変異体はしばしば直接実験の設定に使用されています。あるいはまた、その損失が続くプラスミド切除の選択はしばしばsacB遺伝子4でエンコードされたカウンターで選択レバンスクラーゼの酵素に依存しているグラム陰性細菌に、これを行うことができます。切除は、事前挿入遺伝子型または染色体と改変された遺伝子のプラスミドにコードされたコピーの間の交流の結果を復元することができます。この手法の欠点は、時間がかかるということです。プラスミドは、最初にクローンする必要があり、それは Vへの水平転送を必要とするコレラ菌 （最大n<html> otably E.との交配によって大腸菌ドナー株）または後者の人工変換、およびプラスミドの切除は、ランダムであり、どちらかの初期遺伝子型を復元するか、正の選択が発揮されていない場合、必要な変更を作成することができます。ここでは、Vの迅速な操作のための方法を提示するコレラ菌染色体（S）5（ 図1）。このTransFLP法はこの生物6、などVのビブリオ属の他の代表の天然能力の最近発見されたキチン質を介した誘導に基づくシャリ 7。自然な能力は、PCRによって生成されたDNA断片を含む自由なDNAの取り込みを可能にします。一度取り上げ、染色体とDNAの再結合は、相同領域8に隣接するの250から500 bpの最小値の存在を与えられた。これらの隣接領域の中間の選択マーカーを含めることは頻繁に発生した形質転換体を容易に検出することができます。 tは&quot;&gt;このメソッドはコレラ菌の異なる遺伝子操作のために使用され、潜在的にも他の天然有能なバクテリアすることができます我々は、以前に公開された単一遺伝子欠失の研究とに加えて、この方法によって達成することができるものに3小説の例を提供アフィニティータグ配列5。キチン誘発自然変換6の初期のプロトコルに関しては、いくつかの最適化のステップはこのTransFLPプロトコルに組み込まれているのに加え、これらは他の市販のキチンフレーク8、PCRの寄付によってカニ殻断片の交換中に含める由来の材料9の変換など、DNA、およびFLP組換え標的部位の付加（FRT）5。FRT部位は、FLPリコンビナーゼ10によって媒介される選択マーカーの部位特異的切除を可能にします。

3例の代表的な結果を6〜図4に示されている。隣接する遺伝子ctxAとctxBを削除することを目的と最初のアプローチ。彼らは一緒にVの主要な病原因子をエンコードするコレラ菌 、コレラ毒素。我々は、上記のようにTransFLPメソッドのオリゴヌクレオチドを設計し、 図3を参照に記載の方法。親株は、ctxABの元のDNA遺伝子座のFRT-挟まれた抗生物質耐性カセット及び最終ひずみctxABために削除され、耐性カセットの解放を宿す中間株はすべての彼らの遺伝子型（ 図4）について試験した。選択の方法は、全セルPCRだった。我々は、しかし唯一の染色体DNAに変換したPCR断片（ 図3）にアニールしないプライマーを使用していました。これは、私たちは染色体の相同領域（FでPCR断片の部位特異的な交換性を確認することができigure 4A）。 PCR断片（ <s...

のゲノムを変更するための簡単​​な方法<em&gt; V。コレラ</em&gt;記載されている。これらの変更は、単一の遺伝子、遺伝子クラスターおよびゲノムの島だけでなく、短い配列（例えばプロモーターエレメントまたはアフィニティータグ配列）の統合の削除があります。方法は自然形質転換およびFLP組換えに基づいています。

TransFLP - 遺伝的に変更する方法<em&gt;コレラ菌</em&gt;自然形質転換およびFLP組換えに基づき

細菌の染色体を操作するための方法はいくつか利用可能です1-3。これらのプロトコルの多くは、条件付き複製プラスミドの導入に基づいています...

本手順の目的は、自然形質転換とflip組換えに基づいた、迅速かつ効率的な手法を用いてvio crayを遺伝的に操作することです。まず、形質転換の天然の誘導物質であるキチンを適切に調製します。次に、2回のPCRを用いてDNA構築物を生成し、自然形質転換を行います。これにより、プラスミドPBR flipを保持する細菌にPCRフラグメントを取り込ませ、そのゲノムに組み込ませます。次に、温度を上昇させてプラスミドにコードされたリパーゼ酵素を誘導し、flip組み換え標的（FRT部位）に挟まれた抗生物質耐性カセットを除去します。最終ステップで、細菌からFLPコードプラスミドを脱落させます。最終的に、PCRおよびシーケンシングを用いて、遺伝子操作が成功したことを確認します。自殺プラスミドを用いて遺伝的に操作するなどの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は非常に迅速かつ効率的であることです。まず、標準的な1.5 milliliterプラスチックチューブに50 to 80 milligramのキチンフレークを量り取ります。次に、チューブの蓋を開けたままの状態でフレークをオートクレーブし、オートクレーブ完了後、直ちに蓋を閉めて、オートクレーブ済みのフレークキットを室温で保存します。目的のDNA領域およびFRTに挟まれた抗生物質カセットをPCRで増幅させるには、少なくとも6本のオリゴヌクレオチドが必要です。また、挿入されたPCRフラグメントの外側に、一対のオリゴヌクレオチドプライマーを含めることが推奨されます。これにより、FRTで挟まれた抗生物質耐性カセットの組み込みおよび正しい切り出しを確認できます。オリゴヌクレオチド2番、3番、4番、および5番を注意深く設計してください。プライマー2と5は、ゲノムDNAに十分にアニールできるよう、少なくとも28塩基対を含む必要があります。プライマー3と4は、FRT含有プラスミドをテンプレートとして構築してください。プライマー2と3、およびプライマー4と5の間で、それぞれ5'末端において広範な相補的塩基対形成が起こるようにプライマー2と5を設計してください。次に、PCRの1回目のラウンドにおいて、オリゴヌクレオチド1および2を用い、カスタム設計した構築物の目的実験領域の上流領域を増幅するための、3つの同時かつ独立したPCR反応のうちの1つを調製します。並行して、オリゴヌクレオチド3および4を用いて、FRTに挟まれた抗生物質カセットを増幅するための2つ目のPCR反応を調製します。例えば、本実験では、カナマイシン耐性をコードするA PH遺伝子が使用されました。オリゴヌクレオチド5および6を用い、ゲノムDNAを鋳型として3番目のPCR反応を準備し、下流のDNA領域を同時に増幅させます。次に、3つのPCRフラグメントすべてを精製した後、第1ラウンドで得られた3つのフラグメントを等量ずつ混合したものを鋳型として用い、全サンプルについて第2ラウンドのPCR反応を開始します。この増幅は、オリゴヌクレオチド1および6によって触媒されます。得られたPCRフラグメントを、自然形質転換実験における形質転換用DNAとして使用します。v cholera細胞を30°Cの好気的に濃縮された培地で培養した後、室温で遠心分離して細菌を回収します。次に、細菌培養液をフレーク状のカイチンに転移させ、細胞懸濁液を30 °Cで一晩インキュベートします。続いて、第2ラウンドPCR由来の断片を少なくとも200 ng、細菌細胞懸濁液に慎重に混合します。細菌がカイチン表面から広範囲に脱離しないよう注意しながら、この溶液を30 °Cで静置したまま、さらに1日インキュベートします。次に、培養液を少なくとも 30 seconds 間激しくボルテックスします。PBR flip プラスミドを保持する細菌の細胞溶液を 100 to 300 µL、アンピシリンを含む二重選択プレートに塗布します。プレート内のもう一方の抗生物質に加え、コロニーが視認できるようになるまで、細菌細胞培養液を 30 °C でインキュベートします。その後、選択プレートから単一の形質転換体を単離します。まず、アンピシリンを含むLB寒天培地で、細菌を37°Cで16〜24時間培養します。オプションのステップとして、温度を40°Cに変更して2〜3時間保持します。これは、PBR flipプラスミドからのflipの発現が高温で脱抑制されるためです。さらに37°Cで8時間培養した後、細菌を新しいプレートに継代します。次に、抗生物質含有アガールプレートと抗生物質不含アガールプレートの両方でクローンを並行して制限し、抗生物質感受性をテストした後、得られた抗生物質感受性コロニーを単離します。まず、抗生物質を含まない富栄養培地を用い、30 °Cの好気的条件下で一晩培養します。翌朝、一晩培養した物を新鮮な抗生物質不含培地で1:100の比率で希釈し、さらに3から6時間培養します。午後に、希釈した培養液を通常のLBアガールプレートにストリークまたは塗抹し、コロニーが見えるまで30 °Cでさらに8から16時間インキュベートします。隣接する遺伝子CTXAおよびCTXBの欠損を目的とした最初の実験について説明します。trans flip法に用いるオリゴヌクレオチドを作製し、親株、C-T-X-A-Bの元のDNA遺伝子座の代わりにFRTに挟まれた抗生物質耐性カセットを保持する中間株、およびC-T-X-A-Bが欠損し耐性カセットが除去された最終株のすべてについて、ジェノタイプを確認しました。本実験では、形質転換用PCR断片ではなく、染色体DNAにのみアニーリングするプライマーを用いてホールゲノムPCRを行いました。PCR断片は標準的なアガロースゲル電気泳動により分離し、そのサイズを決定しました。レーン1では、世界的なB型コレラ菌株が期待される断片サイズである3,143 base pairsに検出されました。レーン2では、菌株delta C-T-X-A-B-F-R-T can. FRT由来のPCR断片が3,162 base pairsに検出されました。そしてレーン3では、1 KBラダーと比較して、delta ctx A B FFR TP CRフラグメントが1, 769 bpに位置していました。ゲノムアイランド全体を除去した2番目の例では、Vibrio病原性アイランド1（VPI-1）を本実験の標的として選択しました。trans-flip法は、以下の2つのステップで修正されました。まず、PI 1の開始位置にある単一のFRTサイトを用いて、カナマイシン耐性遺伝子の組み込みを行いました。次に、2回目の自然形質転換を実施し、病原性島（pathogenicity island）の末端に、もう一つの抗生物質耐性マーカーであるゲンタマイシン耐性と、それに続く2つ目のFRTサイトを挿入させました。それぞれのプライマーペアは各ゲル写真の上に示されており、引き続き先ほど実演したtrans FLP法を適用しました。親株、中間株、および最終株はすべて、1レーンの精製ゲノムDNAを用いたPCRによって確認されました。2レーンには、野生型V cholera株のPCR断片を流しました。さらに、VPI one FRT can GM FRT株から得られたPCR断片を流しました。また、レーン3では、delta VPI one FRT由来株のPCR産物を分析しました。プライマーペアは各ゲルの画像の上に記載しています。最終的な株では、VPI one全体が欠損しています。この3番目の例では、標準プロトコルをわずかに変更したtrans flip法を用い、自然形質転換の主要調節因子であるGene T foxの上流にT7 RNAポリメラーゼ依存性プロモーター配列を組み込みました。T7 RNA依存性プロモーターのコンセンサス配列をオリゴヌクレオチド4番と5番のオーバーハングとして含めることで、このDNA配列が染色体内に保持されるようにしました。抗生物質耐性カセットを切り出した後、この構築物をT7 RNAポリメラーゼ含有V colorized株に導入しました。本株では、T7 RNAポリメラーゼ依存的なT-Foxの発現を検証するため、LAC UV5プロモーターによってT7 RNAポリメラーゼ遺伝子の発現を制御しました。自然形質転換アッセイはLB培地で行いました。T-Fox遺伝子の前方にT7依存的プロモーターを欠く親株は、富栄養培地において、かつ天然の誘導物質であるキチンの不在下ではT-Foxが転写されないため、これらの条件下では自然形質転換能を持ちません。この表現型は、IPTGによってT7 RNAポリメラーゼを人工的に誘導したかどうかにかかわらず認められました。しかし、コンピテンス遺伝子T Foxの上流にT7 RNAポリメラーゼ依存性プロモーターを含むtrans flip生成株は、LB培地におけるLAC UV5プロモーターのリークにより、実際に富栄養培地で自然形質転換能を示しました。産生されたT7 RNAポリメラーゼが、IPTGによる誘導なしにT7 RNAポリメラーゼ依存性プロモーターからT FOXを転写していました。これにより自然コンピテンスと形質転換が開始され、組み込まれたT7 RNAポリメラーゼ依存性プロモーター配列の機能性が確認されました。この表現型は、LAC UV 5プロモーターの誘導剤であるIPTGの添加によるT7 RNAポリメラーゼの完全な誘導によって、著しく増強されました。このビデオを視聴することで、キチン誘導自然形質転換とFlip組換えを組み合わせて、どのようにV. choleraを遺伝的に操作するかについて十分に理解できるはずです。この技術を習得すれば、わずか数日で遺伝子やゲノムアイランドの欠損、および部位特異的なDNA配列の組み込みが可能になります。

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Immunology and Infection

免疫学と感染症

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学ぶV. choleraeの遺伝子操作法。自然形質転換とFLP組換えを用いて、遺伝子欠失や配列統合を迅速かつ効率的に行う手法を解説。PCRとシーケンスで検証可能。

TransFLP - 遺伝的に変更する方法

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