TransFLP - 遺伝的に変更する方法

本手順の目的は、自然形質転換とflip組換えに基づいた、迅速かつ効率的な手法を用いてvio crayを遺伝的に操作することです。まず、形質転換の天然の誘導物質であるキチンを適切に調製します。次に、2回のPCRを用いてDNA構築物を生成し、自然形質転換を行います。これにより、プラスミドPBR flipを保持する細菌にPCRフラグメントを取り込ませ、そのゲノムに組み込ませます。

次に、温度を上昇させてプラスミドにコードされたリパーゼ酵素を誘導し、flip組み換え標的（FRT部位）に挟まれた抗生物質耐性カセットを除去します。最終ステップで、細菌からFLPコードプラスミドを脱落させます。最終的に、PCRおよびシーケンシングを用いて、遺伝子操作が成功したことを確認します。

自殺プラスミドを用いて遺伝的に操作するなどの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は非常に迅速かつ効率的であることです。まず、標準的な1.5 milliliterプラスチックチューブに50 to 80 milligramのキチンフレークを量り取ります。次に、チューブの蓋を開けたままの状態でフレークをオートクレーブし、オートクレーブ完了後、直ちに蓋を閉めて、オートクレーブ済みのフレークキットを室温で保存します。目的のDNA領域およびFRTに挟まれた抗生物質カセットをPCRで増幅させるには、少なくとも6本のオリゴヌクレオチドが必要です。また、挿入されたPCRフラグメントの外側に、一対のオリゴヌクレオチドプライマーを含めることが推奨されます。

これにより、FRTで挟まれた抗生物質耐性カセットの組み込みおよび正しい切り出しを確認できます。オリゴヌクレオチド2番、3番、4番、および5番を注意深く設計してください。プライマー2と5は、ゲノムDNAに十分にアニールできるよう、少なくとも28塩基対を含む必要があります。プライマー3と4は、FRT含有プラスミドをテンプレートとして構築してください。プライマー2と3、およびプライマー4と5の間で、それぞれ5'末端において広範な相補的塩基対形成が起こるようにプライマー2と5を設計してください。

次に、PCRの1回目のラウンドにおいて、オリゴヌクレオチド1および2を用い、カスタム設計した構築物の目的実験領域の上流領域を増幅するための、3つの同時かつ独立したPCR反応のうちの1つを調製します。並行して、オリゴヌクレオチド3および4を用いて、FRTに挟まれた抗生物質カセットを増幅するための2つ目のPCR反応を調製します。例えば、本実験では、カナマイシン耐性をコードするA PH遺伝子が使用されました。

オリゴヌクレオチド5および6を用い、ゲノムDNAを鋳型として3番目のPCR反応を準備し、下流のDNA領域を同時に増幅させます。次に、3つのPCRフラグメントすべてを精製した後、第1ラウンドで得られた3つのフラグメントを等量ずつ混合したものを鋳型として用い、全サンプルについて第2ラウンドのPCR反応を開始します。この増幅は、オリゴヌクレオチド1および6によって触媒されます。

得られたPCRフラグメントを、自然形質転換実験における形質転換用DNAとして使用します。v cholera細胞を30°Cの好気的に濃縮された培地で培養した後、室温で遠心分離して細菌を回収します。

次に、細菌培養液をフレーク状のカイチンに転移させ、細胞懸濁液を30 °Cで一晩インキュベートします。続いて、第2ラウンドPCR由来の断片を少なくとも200 ng、細菌細胞懸濁液に慎重に混合します。細菌がカイチン表面から広範囲に脱離しないよう注意しながら、この溶液を30 °Cで静置したまま、さらに1日インキュベートします。

次に、培養液を少なくとも 30 seconds 間激しくボルテックスします。PBR flip プラスミドを保持する細菌の細胞溶液を 100 to 300 µL、アンピシリンを含む二重選択プレートに塗布します。プレート内のもう一方の抗生物質に加え、コロニーが視認できるようになるまで、細菌細胞培養液を 30 °C でインキュベートします。その後、選択プレートから単一の形質転換体を単離します。

まず、アンピシリンを含むLB寒天培地で、細菌を37°Cで16〜24時間培養します。オプションのステップとして、温度を40°Cに変更して2〜3時間保持します。これは、PBR flipプラスミドからのflipの発現が高温で脱抑制されるためです。さらに37°Cで8時間培養した後、細菌を新しいプレートに継代します。

次に、抗生物質含有アガールプレートと抗生物質不含アガールプレートの両方でクローンを並行して制限し、抗生物質感受性をテストした後、得られた抗生物質感受性コロニーを単離します。まず、抗生物質を含まない富栄養培地を用い、30 °Cの好気的条件下で一晩培養します。翌朝、一晩培養した物を新鮮な抗生物質不含培地で1:100の比率で希釈し、さらに3から6時間培養します。午後に、希釈した培養液を通常のLBアガールプレートにストリークまたは塗抹し、コロニーが見えるまで30 °Cでさらに8から16時間インキュベートします。

隣接する遺伝子CTXAおよびCTXBの欠損を目的とした最初の実験について説明します。trans flip法に用いるオリゴヌクレオチドを作製し、親株、C-T-X-A-Bの元のDNA遺伝子座の代わりにFRTに挟まれた抗生物質耐性カセットを保持する中間株、およびC-T-X-A-Bが欠損し耐性カセットが除去された最終株のすべてについて、ジェノタイプを確認しました。本実験では、形質転換用PCR断片ではなく、染色体DNAにのみアニーリングするプライマーを用いてホールゲノムPCRを行いました。PCR断片は標準的なアガロースゲル電気泳動により分離し、そのサイズを決定しました。

レーン1では、世界的なB型コレラ菌株が期待される断片サイズである3,143 base pairsに検出されました。レーン2では、菌株delta C-T-X-A-B-F-R-T can. FRT由来のPCR断片が3,162 base pairsに検出されました。

そしてレーン3では、1 KBラダーと比較して、delta ctx A B FFR TP CRフラグメントが1, 769 bpに位置していました。ゲノムアイランド全体を除去した2番目の例では、Vibrio病原性アイランド1（VPI-1）を本実験の標的として選択しました。trans-flip法は、以下の2つのステップで修正されました。

まず、PI 1の開始位置にある単一のFRTサイトを用いて、カナマイシン耐性遺伝子の組み込みを行いました。次に、2回目の自然形質転換を実施し、病原性島（pathogenicity island）の末端に、もう一つの抗生物質耐性マーカーであるゲンタマイシン耐性と、それに続く2つ目のFRTサイトを挿入させました。それぞれのプライマーペアは各ゲル写真の上に示されており、引き続き先ほど実演したtrans FLP法を適用しました。

親株、中間株、および最終株はすべて、1レーンの精製ゲノムDNAを用いたPCRによって確認されました。2レーンには、野生型V cholera株のPCR断片を流しました。さらに、VPI one FRT can GM FRT株から得られたPCR断片を流しました。

また、レーン3では、delta VPI one FRT由来株のPCR産物を分析しました。プライマーペアは各ゲルの画像の上に記載しています。最終的な株では、VPI one全体が欠損しています。

この3番目の例では、標準プロトコルをわずかに変更したtrans flip法を用い、自然形質転換の主要調節因子であるGene T foxの上流にT7 RNAポリメラーゼ依存性プロモーター配列を組み込みました。T7 RNA依存性プロモーターのコンセンサス配列をオリゴヌクレオチド4番と5番のオーバーハングとして含めることで、このDNA配列が染色体内に保持されるようにしました。抗生物質耐性カセットを切り出した後、この構築物をT7 RNAポリメラーゼ含有V colorized株に導入しました。

本株では、T7 RNAポリメラーゼ依存的なT-Foxの発現を検証するため、LAC UV5プロモーターによってT7 RNAポリメラーゼ遺伝子の発現を制御しました。自然形質転換アッセイはLB培地で行いました。T-Fox遺伝子の前方にT7依存的プロモーターを欠く親株は、富栄養培地において、かつ天然の誘導物質であるキチンの不在下ではT-Foxが転写されないため、これらの条件下では自然形質転換能を持ちません。この表現型は、IPTGによってT7 RNAポリメラーゼを人工的に誘導したかどうかにかかわらず認められました。

しかし、コンピテンス遺伝子T Foxの上流にT7 RNAポリメラーゼ依存性プロモーターを含むtrans flip生成株は、LB培地におけるLAC UV5プロモーターのリークにより、実際に富栄養培地で自然形質転換能を示しました。産生されたT7 RNAポリメラーゼが、IPTGによる誘導なしにT7 RNAポリメラーゼ依存性プロモーターからT FOXを転写していました。これにより自然コンピテンスと形質転換が開始され、組み込まれたT7 RNAポリメラーゼ依存性プロモーター配列の機能性が確認されました。

この表現型は、LAC UV 5プロモーターの誘導剤であるIPTGの添加によるT7 RNAポリメラーゼの完全な誘導によって、著しく増強されました。このビデオを視聴することで、キチン誘導自然形質転換とFlip組換えを組み合わせて、どのようにV. choleraを遺伝的に操作するかについて十分に理解できるはずです。この技術を習得すれば、わずか数日で遺伝子やゲノムアイランドの欠損、および部位特異的なDNA配列の組み込みが可能になります。