サイト固有の細菌染色体工学：ΦC31インテグラーゼを介したカセット取引所（IMCE）

既製のアクセプター株、と呼ばれる着陸パッド株に興味のある外来DNAを統合するための迅速かつ効率的な方法が記載されている。メソッドは、ΦC31インテグラーゼの結合と表現を通して、与えられた菌株の人工着陸パッドの座にDNAカセットの部位特異的に統合することができます。

次の実験の全体的な目標は、所望のDNA構築物を所定の遺伝子座で細菌の染色体に統合することです。これは、4つの遺伝子操作された細菌株を含む交配プロトコルによって達成されます。レシピエント株は、その染色体に統合されたATP部位に隣接する特異マイシン耐性遺伝子と大腸菌ベータグルクロニダーゼ遺伝子からなるランディングパッド配列を有する。

P JH one 10ドナー株は、スタッファー赤色蛍光タンパク質遺伝子と抗生物質耐性遺伝子に隣接するB部位にプラスミドを含有する。PJC 2ドナー株は、LACプロモーターの制御下で、ストレプトマイセスファージC 31由来の部位特異的インテグラーゼを含むプラスミドを運びます。第4の株MT 616は、細胞から細胞へのプラスミドの転写に必要な転写遺伝子を提供し、その結果、レシピエント株を介したトランスの産生をもたらす。

インテグラーゼ媒介カセット交換に必要な2つのプラスミドの取得。PJ H one 10プラスミドからのドナーカセットを染色体上のランディングパッドカセットのマーカーと交換すると、ランディングパッドマーカー、SPRおよびUIDAが失われ、結果として生じるトランス移民のドナーカセットRFPおよびGMRが維持されます。相同組換えなどの他の方法に対するこの手法の主な利点は、プロトコルの容易さと効率性です。

また、さまざまな細菌にも移行できます。このビデオで使用されているアクセプター株は、交配手順の2日前に、スペクトマイシンを含むTY培地の5ミリリットルに単一のコロニーから接種するトランスインテグリンを作成するためのSミリラテ株であり、交配手順の前日に振とうしながら摂氏30度でSミリ株を2日間インキュベートし、次の各大腸菌株を5ミリリットルのLB液体培地に接種しますテトラサイクリンMT 616を含む培地にインテグラーゼ発現プラスミドを含む適切な抗生物質DH 5α、クロラムフェニコールを含む培地、およびドナーカセットプラスミドを含むDHファイブアルファをゲンタマイシンを含む培地にインキュベートし、3つの大腸菌株を摂氏37度で一晩インキュベートし、絶え間なく振とうしながら交配手順のための細胞を準備します。4つの培養物のそれぞれ1.5ミリリットルをチューブに移し、17, 000回Gで30秒間遠心分離して細胞ペレットを収集し、培地を廃棄し、各細胞ペレットを1ミリリットルの滅菌0.85%塩化ナトリウムに再懸濁し、上清を廃棄した後、チューブを再度遠心分離しますResusは、ピペットを使用して滅菌0.85%塩化ナトリウムの各ペレットを100マイクロリットルに懸濁し、それぞれに10マイクロリットルの洗浄済み培養物を個別にスポットしますプレーンなTY寒天プレートで濾します。

これらのスポットはコントロール スポットです。次に、滅菌チューブ内にPjc 2を含む大腸菌DH 5αを除く各株の40マイクロリットルを加え、プレーンTY寒天プレート上にこの混合物のスポット120マイクロリットルをピペッティングして混合する。このスポットは、インテグラーゼなしのネガティブコントロールです。

最後に、滅菌チューブミックスとスポットに4つの菌株のそれぞれ40マイクロリットルを加えます。 この混合物の160マイクロリットルを同じTDY寒天プレート上に置きます。このスポットは、インテグラーゼ媒介カセット交換交配スポットです。

プレートを層流フードに置き、その後、スポットを約20分間乾燥させます。プレートを密封し、交配プロトコルストリークの翌日に摂氏30度で一晩インキュベートします。2つのコントロールスポットとIMCE交配スポットをSTY寒天プレートにストレプトマイシンとゲンタマイシンを添加しました。

Sミリアクセプター株は、IMCE効率の計算のためにストレプトマイシンに高レベルの耐性を付与する突然変異を運びます Resusは、500マイクロリットルの滅菌0.85%塩化ナトリウムのIMCE嵌合スポットの約4分の1を中断し、10に10倍の連続希釈を行い、ネガティブな第7プレートに希釈は、ストレプトマイシンを補充したTY寒天プレート上のネガティブな2から10に傾向があります。 Gentamycin、およびトランス移民のために選択するXGL。プレートの希釈は、TY寒天プレートでネガティブ3から10からネガティブ7になる傾向があり、ストレプトマイシンとxglを補充して、トランス移民と潜在的なレシピエントの両方を選択します。IEの全レシピエントは、プレートを摂氏30度で3日間インキュベートします。

緑色の光の下でRFPトランスを表示し、赤いフィルターを介して、トランス移民のCFUとしてIMCE効率のパーセントを計算し、総受信者のCFUと比較して、トランスの約半分は、ストレプトマイシンとゲンタマイシンを補給したTyでの3日間のインキュベーション後に、彼らを白く、鈍感にする真の交換を受けているでしょう、次のコントロール株の成長はありません。 インテグラーゼ制御なし、ミリラテ、UW 2、27、制御、大腸菌、MT 616、制御、大腸菌DH、5アルファ、P、JH、10、および大腸菌DH5アルファ、PJC2制御を含む。対照的に、交配スポットからのIMCEストリークは、ヘッドストリークでコンフルエント成長し、2番目のストリークで多くのコロニーを持つ必要があります。これらの次の 2 つの画像は、TY ストレプトマイシン xgl 寒天、および TY ストレプトマイシン ゲンタマイシン xgl 寒天上の TY ストレプトマイシン ゲンタマイシン xgl 寒天上の嵌合スポットの 10 から 10 の陰性 2 希釈の懸濁液を示しています。

青色のコロニーは単一の組換え体です。白色コロニーは、緑色光の下で赤色のフィルターを通して観察すると真のカセット交換を受けたトランスインテグリンですが、TYストレプトシンxgl寒天培地上の交配スポット蘇生懸濁液の負の2希釈は蛍光を欠く傾向があります。対照的に、Ty streptomycin Gentamycin Xgl Agarの交配スポット蘇生懸濁液の10〜マイナス2希釈は、2つのレベルの蛍光を示します。

明るいコロニーは青色のコロニーに対応し、RFP発現が高くなりますが、これはおそらくベクターのLACプロモーターからのリードスルーを促進するためです。明るさの低いコロニーは、真のカセット交換を受け、直接のプロモーターのみでRFPを含み、LACプロモーターからの読み取りがない白いコロニーに対応します。これらの傾向の移民はまた、斑点マイシン感受性であるべきです。

トランス統合の効率は、全受取人に対するトランス移民の割合として表される0.5%の範囲である必要がありますこのビデオを見た後、DNAコンジャンクションを細菌の染色体に挿入するために、当社の人工株を使用して細菌結合を使用する方法をよく理解しているはずです。