Name: サイト固有の細菌染色体工学：ΦC31インテグラーゼを介したカセット取引所（IMCE） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 学ぶΦC31インテグラーゼを用いた細菌染色体へのDNAカセット統合法。ランディングパッド株と接合を活用し、遺伝子工学や合成生物学研究で効率的な遺伝子改変を実現する革新的な手法です。

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親切なインテグラーゼクローンを提供するためのマーガレットCMスミスへ からの資金調達のサポート： ゲノムカナダ/ゲノムプレーリー NSERC発見と戦略プロジェクトの助成金

1。文化の生産<ol><li> TY 10（5 g / lのトリプトン、3 g / lの酵母エキス、0.44 g / lの塩化カルシウムの脱水）、およびLB 11（10 g / lのトリプトン、5g / lの酵母エキス、5gの/：滅菌液体培地を準備します。塩化ナトリウム、pH 7）。 </li><li> 50μg/ mlのスペクチノマイシンとTYメディアの5ミリリットルに（）：SmUW227（建設はリクエストを承り構造の詳細を痛め、別の場所で説明されるS.根粒 LP-ひずみ：）は、単一のコロニーから接種する。 E.：与えられた抗生物質を補充する、LB液体培地5ml中に以下の菌株を接種する大腸菌は DH5α12 10μg/ mlのテトラサイクリンでpJC2、プラスミドインテグラーゼの発現を含む。E.大腸菌 MT616 13、動員、10μg/ mlのクロラムフェニコール、およびE.大腸菌 DH5α5μg/ mlのゲンタマイシンをpJH110、ドナープラスミドカセットを含む。 </li><li>インキュベートE. 37＆一晩大腸菌株度、一定に振とうしながらC。インキュベートS.振盪しながら2日間の30℃における根粒菌株 。 S.を得ることが可能である大規模な接種（飽和文化の1:500継代培養）で一晩根粒の文化。 </li></ol> 2。文化の調製とミキシング<ol><li> 30秒間17000×gで遠心分離によって細胞ペレットを集め、1 mlの滅菌0.85％NaClでの再懸濁することにより、各株の培養液1.5 mlを洗って、一回繰り返します。 </li><li>滅菌した0.85％NaClで100μlのペレットを再懸濁します。 </li><li>個別に平野TY寒天プレート上でそれぞれの株に洗浄した文化の10μlを見つける。これらのスポットは、コントロールスポットです。 </li><li> E.除く各株の40μlを加え大腸菌 DH5α滅菌チューブにpJC2を含む12、ミックス、プレーンTY寒天プレート上で、この混合物の120μlを見つける。このスポットはno-インテグラーゼ陰性コントロールです。 </li><li>無菌tに各株の40μlを加えUBE、ミックス、スポット平野TY寒天プレート上で、この混合物160μlの。このスポットはIMCE交配スポットです。 </li><li>スポットが層流フード内で乾燥させます。 </li><li>シール板と30°Cで一晩インキュベートします。 </li></ol> 3。トランス組込み体の単離<ol><li> 200μg/ mlのストレプトマイシン（SmUW227はストレプトマイシン14に高レベルの耐性を付与する突然変異を運ぶRm1021に基づいています）、30μg/ mlのゲンタマイシンを添加したTY寒天プレート上にストリークコントロールスポットとIMCEスポット。 </li><li> IMCE効率の計算については、約再懸濁し¼500μlの滅菌0.85％NaClでのIMCE交配スポット。 10 -7〜10倍希釈系列を作成します。 TY寒天プレート上10 -5を介してプレート希釈液10 -2は 、トランス組込み体を選択するために、200μg/ mlのストレプトマイシンおよび30μg/ mlのゲンタマイシンを補った。 10 -3 THRプレート希釈液トランス組込み体と潜在的な受信者の両方を選択するために、200μg/ mlのストレプトマイシンを補充したTY寒天プレート上でウワーッ10 -7、合計受信者、すなわち。 </li><li>マーカーレストランス組込み体を単離するための無菌の0.85％NaClで500μlに約IMCE交配スポットの四半期に再懸濁します。 10 -6〜10倍希釈系列を作成します。プレート希釈液200μg/ mlのストレプトマイシンおよび200μg/ mlのX-glucを添加した4 TY寒天プレート上で10 -6〜10 -4。 </li><li> 3日間30℃でプレートをインキュベートします。 </li><li>緑色の光（525 nm）の下に、赤のフィルタ（&gt; 610 nm）で15を介してビューRFPトランス組込み体。 </li><li>トランス組込み体のCFUは、全受信者のCFUと比較してパーセントIMCE効率を計算します。トランス組込み体の約半分は、敏感な彼らは、白とスペクチノマイシン作る真のカセット交換を受けています。 </li><li>マーカーレストランス組込み体（Wを見つけるにはここでドナーベクターは、白いコロニー（拡張潜伏期間、室温で1-2余分な日、X-gluc経由してコロニーの分化を向上させるための画面）pJH110のようにGmのrを含んでいませんが、これはS.必要である根粒 SmUW227）、抗生物質および100μg/ mlのスペクチノマイシンを含むTY寒天プレートなしのTY寒天プレート上でスクリーニングすることによってコロニーのスペクチノマイシン感受性を確認します。 </li></ol> 4。代表的な結果ストレプトマイシンとゲンタマイシン制御筋を添加したTY上でのインキュベーションの3日後には成長しているべきではありません。 IMCEストリークは、図2に見られるように、第二連勝で頭筋上のコンフルエントな成長と多くの植民地を持っている必要があります。合計受信者へのトランス組込み体の割合として表されるトランス統合の効率は、0.5％の範囲でなければなりません。約トランス組込み体の半分はスペクチノマイシンに敏感と白になります彼らは真のカセット交換を受けて表示しています。緑色の光（525 nm）の下、赤フィルター（&gt; 610 nm）で15を介して見たときpJH110からテスターのRFPドナーカセットを含有するトランス組込み体は、識別可能なRFP蛍光を表示する必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/3698/3698fig1.jpg" alt="図1"/> 図1コンジュゲートの混合図：pRK600からの転送遺伝子の発現による支援は、プラスミドのすべてが細胞から細胞へランダムに転送されます。 IMCE、インテグラーゼ（int）はヘルパープラスミドpJC2とドナープラスミドpJH110に必要な2つのプラスミドのLP-株の買収により、混合物中のトランス組込み体の作成 ​​にこの転送の結果、。プラスミド非複製ドナー（pJH110）からドナーカセットはLP-マーカー（Spの損失、その結果、染色体上にLP-カセットのマーカーとΦC31インテグラーゼ活性を介して交換されrとuidA）で処理し、得られたトランスインテグラのドナーカセットのメンテナンス（RFPとのGm R）。 <img src="/files/ftp_upload/3698/3698fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。 ：寒天表面上の乾燥した細胞混合物を示す非選択TYプレート上に嵌スポットプレートB：上からストレプトマイシン、ゲンタマイシン-X-glucプレート上にストリーク嵌スポットは、Sに、時計回りIMCEを全くインテグ制御を残っていない根粒、E.大腸菌 DH5αを含むpJC2制御、E.大腸菌 DH5aはpJH110コントロールを含む、E.大腸菌 MT616制御、およびS.根粒 UW227コントロールC：。TYストレプトマイシン-X-gluc寒天上で交配スポット再懸濁の10 -2希釈D：TYストレプトマイシン、ゲンタマイシン-X-gluc寒天（青コロニーは単一の組換え体であり、上の交配スポット再懸濁の10 -2希釈白色コロニーは、真の受けたカセット交換）E：。蛍光性の欠如を示すTYストレプトマイシン-X-gluc寒天上で交配スポット再懸濁の10 -2希釈F：2つのレベルを示すTYストレプトマイシン、ゲンタマイシン-X-gluc寒天上で交配スポット再懸濁の10 -2希釈蛍光の（明るいコロニーは青色のコロニーに対応しており、読み取りしかしコロニーが、真のカセット交換なしでlacプロモーターからのリードスルーでのみ、その即時プロモーターとRFPが含まれて受けたベクター配列からプロモーターに起因すると考えられる高いRFPを発現している不在であるベクトル、）。

<ol><li>Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+two+genomes+in+one+cell%3A+Stable+cloning+of+the+Synechocystis+PCC6803+genome+in+the+Bacillus+subtilis+168+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).</li>
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<li>Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+insertion+and+replacement+in+Schizosaccharomyces+pombe+mediated+by+the+Streptomyces+bacteriophage+FC31+site-specific+recombination+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system.</a> Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).</li>
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<li>Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Agrobacterium+strains+by+electroporation+of+genomic+DNA+and+its+utility+in+analysis+of+chromosomal+virulence+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

IMCE技術は、以前に設計された株のLP-遺伝子座への単一attB挟まれたDNAカセットの効率的な統合が可能になります。希望するコンストラクトがドナーカセットを作成するRFPの代わりにクローン化されると、技術は非常に堅牢な作り、その後のDNA精製と変換を必要としません。それは抗生物質耐性は、トランス組込み体の作成とない他の要因によるものであることを確実にするために、適切な成長のコントロールが含まれていることが重要です。 IMCEは約0.5％の効率でトランス組込み体を生成します。対照的に、相同組換えを介した二重クロスオーバーは、10 -6程度の頻度で発生します。 λ-赤16、別のファージベースのシステムを介して遺伝子改変は、特定の相同性を必要とし、E.の外の効果を変化させた大腸菌 17。まだ別のオプション、TN7部位特異的組換えは、attTn7サイト18が必要です</suγ-プロテオバクテリアの外で非常にまれに存在するP&...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ストレプトマイシン</td><td> Bioshopカナダ社</td><td> STP101 </td><td></td></tr><tr><td>スペクチノマイシン</td><td> Bioshopカナダ社</td><td> <a href="https://ssl34.alentus.com/bioshopcanada/detail.asp?Pin=SPE201">SPE201</a> </td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td> Bioshopカナダ社</td><td> GTA202 </td><td></td></tr><tr><td> Choramphenicol </td><td> Bioshopカナダ社</td><td> CLR201 </td><td></td></tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td> Bioshopカナダ社</td><td> TET701 </td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td> Bioshopカナダ社</td><td> KAN201 </td><td></td></tr><tr><td>細菌学的等級寒天</td><td&gt; Bioshopカナダ社</td><td> AGR001 </td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td> Bioshopカナダ社</td><td> TRP402 </td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td> Bioshopカナダ社</td><td> YEX401 </td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td> Bioshopカナダ社</td><td> SOD001 </td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td> Bioshopカナダ社</td><td> CCL444 </td><td></td></tr><tr><td> X-gluc </td><td>ゴールドバイオ株式会社</td><td> G1281C1 </td><td></td></tr><tr><td> 大腸菌 MT616株</td><td>リクエストも承ります</td><td></td><td>また、我々の研究室の外で使用</td></tr><tr><td> 大腸菌 pJC2株</td><td>リクエストにより、家の中で、利用可能な</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 大腸菌 pJH110株</td><td> requesによって家の中で、利用可能なトン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> SmUW227ひずみ</td><td>リクエストにより、家の中で、利用可能な</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

サイト固有の細菌染色体工学：Φc31インテグラーゼを介したカセット取引所（imce）

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

細菌の染色体を安定的にメガ塩基の範囲1に外来DNAを維持するために使用されることがあります。染色体への統合は、このようなプラスミド複製、プラスミドの安定性、プラスミド不和合性、プラスミドコピー数の変動などの問題を回避します。このメソッドは、 放線菌ファージ（Φ）C31 2,3から、サイト固有のインテグラーゼを使用しています。 attBとattP（それぞれ34と39 bpの、）4：ΦC31インテグラーゼは、2つの特定のDNA部位の間の直接的な組換えを触媒する。この組換えは、安定していると5を戻すことはできません。スペクチノマイシン耐性遺伝子、aadA（SPR）、およびE.から成る&quot;ランディングパッド&quot;（LP）シーケンスattP部位によって挟まれた大腸菌 β-グルクロニダーゼ遺伝子（uidA）Sinorhizobium根粒、Ochrobactrum anthropiと、遺伝子間領域におけるAgrobacterium tumefaciensの染色体に組み込まれており、 午前それぞれpCの軌跡、そしてTETA軌跡、S.根粒は、このプロトコルで使用されています。スタッファー赤色蛍光タンパク質（RFP）遺伝子と抗生物質耐性遺伝子に隣接するattB部位を含む可動性ドナーベクターも構築されている。この例では、ゲンタマイシン耐性プラスミドpJH110が使用されます。 RFP遺伝子の 6は SPH I と Pst Iを用いて所望の構築物で置き換えることができますまたattB部位に隣接した合成構造などpK19mob 7のような可動性ベクターにサブクローン化されたかもしれません。 ΦC31インテグラーゼ遺伝子の発現（pHS62 8からクローニングされた）pRK7813 9可動性プラスミド広宿主範囲に、lacプロモーターによって駆動されます。 tetraparental交配プロトコルは、それによってドナーカセットでLPシーケンスにマーカーを置き換えるLP株にドナーカセットを転送するために使用されます。これらの細胞はトランジスタです。S-組込み体。トランス組込み体は、0.5％の典型的な効率で形成される。トランス組込み体は、通常、抗生物質感受性または5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - インドリル-β-D-グルクロン酸（X-gluc）を使用して青白色スクリーニングでスクリーニング第一500〜1,000コロニー内にあります。このプロトコルは、トランス組込み体を作成し、単離するための交配と選択プロシージャが含まれています。

既製のアクセプター株、と呼ばれる着陸パッド株に興味のある外来DNAを統合するための迅速かつ効率的な方法が記載されている。メソッドは、ΦC31インテグラーゼの結合と表現を通して、与えられた菌株の人工着陸パッドの座にDNAカセットの部位特異的に統合することができます。

サイト固有の細菌染色体工学：ΦC31インテグラーゼを介したカセット取引所（IMCE）

細菌の染色体を利用することで、メガベース（Mb）規模の外来DNAを安定的に保持させることが可能です1。染色体への組み込みにより、...といった問題が回避されます。

本実験の全体的な目的は、目的のDNA構築物を細菌染色体上のあらかじめ決定された遺伝子座に組み込むことです。これは、4つの操作された細菌株を用いた接合プロトコルによって達成されます。レシピエント株は、スペクチノマイシン耐性遺伝子と、ATP部位に挟まれた大腸菌β-グルクロン酸分解酵素遺伝子からなるランディングパッド配列を染色体内に保持しています。P JH one 10ドナー株は、スタッファーとして赤色蛍光タンパク質遺伝子を挟むattBサイトと、抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミドを保持しています。PJC twoドナー株は、LACプロモーターの制御下にあるstreptomycesファージC 31由来の部位特異的インテグラーゼを含むプラスミドを保持しています。4つ目の株であるMT 616は、細胞間でのプラスミド転移である接合に必要な転移遺伝子を提供し、受容株を通じてトランスジェニック細胞を作成させます。インテグラーゼ媒介カセット交換に必要な2種類のプラスミドを調製します。PJ H one 10プラスミド由来のドナーカセットと、染色体上のランディングパッドカセットのマーカーを交換すると、結果として得られるトランス移民からはランディングパッドマーカーであるSPRおよびUIDAが消失し、ドナーカセットのRFPおよびGMRが保持されます。相同組換えなどの他の手法と比較して、本手法の主な利点はプロトコルの簡便さと効率性にあります。これはまた、多種多様な細菌へと転移可能です。本ビデオで使用する受容菌株はS. milli latte株です。trans-integronを作成するための接合操作の2日前に、単一のコロニーからスペクチノマイシンを含む5 mLのTY培地に接種してください。S. milli株を30 °Cで2日間、振盪培養します。接合操作の前日に、以下の各E. coli株を、適切な抗生物質を添加した5 mLのLB液体培地に接種します。インテグラーゼ発現プラスミドを保持するDH5αはテトラサイクリン添加培地に、動員菌であるMT616はクロラムフェニコール添加培地に、そしてドナーカセットプラスミドを保持するDH5αはゲンタマイシン添加培地に接種してください。これら3種のE. coli株を37 °Cで一晩、定常的に振盪して培養し、接合操作に向けた細胞準備を行います。4つの培養液からそれぞれ1.5 mLをチューブに移し、17,000 ×gで30秒間遠心分離して細胞ペレットを回収します。培地を除去し、各細胞ペレットを1 mLの滅菌0.85%塩化ナトリウム溶液に再懸濁します。上清を除去した後、チューブを再度遠心分離してください。ピペットを用いて、各ペレットを100 µLの滅菌0.85%塩化ナトリウム溶液に再懸濁します。洗浄した各菌株の培養液10 µLを、プレーンなTYアガープレート上に個別にスポットします。これらのスポットはコントロールスポットです。次に、Pjc2を含むe coli DH5α以外の各菌株を40 µLずつ滅菌チューブに入れ、ピペッティングで混合します。この混合液を120 µL、プレーンなTYアガープレートにスポットします。このスポットが、インテグラーゼ欠損のネガティブコントロールとなります。最後に、滅菌チューブに4つの株をそれぞれ40 µLずつ加え、混合します。この混合液160 µLを同じTDY寒天プレートにスポットします。このスポットが、インテグラーゼ介在カセット交換（integrase mediated cassette exchange）接合スポットとなります。プレートを層流クリーンベンチ内に配置し、その後、スポットが乾燥するまで約20分間放置します。プレートを密閉し、交配プロトコルのストリーク操作を行った翌日に、30°Cで一晩インキュベートします。2つのコントロールスポットとIMCE交配スポットを、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシンを添加したTY寒天培地にストリークします。S milli 受容菌株は、IMCE効率の算出のため、ストレプトマイシンに対して高レベルの耐性を付与する変異を有しています。IMCE交配スポットの約4分の1を 500 µL の滅菌 0.85% Sodium chloride に懸濁し、10⁻⁷ まで10倍段階希釈を行います。トランス移民（trans immigrants）を選択するため、10⁻² から 10⁻⁵ までの希釈液を、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、および xgl を添加した TY 寒天培地に塗布します。また、トランス移民および潜在的な受容菌の両者を選択するため、10⁻³ から 10⁻⁷ までの希釈液を、ストレプトマイシンおよび xgl を添加した TY 寒天培地に塗布します。プレートを 30 °C で3日間培養します。緑色光の下でRFPトランスジェニックを確認し、赤色フィルターを通して、全レシピエントのCFUに対するトランス移民のCFUの割合としてIMCE効率（%）を算出します。ストレプトマイシンとゲンタマイシンを添加したTy培地で3日間培養した後、トランスジェニックの約半分は真の交換が起こり、白色となり感受性を失います。以下のコントロール株では増殖が見られないはずです：インテグラーゼ欠損コントロールS. mille latte UW 2 27、コントロールE. coli MT 616、P JH one 10コントロールを含むコントロールE. coli DH5α、およびPJC twoコントロールを含むE. coli DH5α。対照的に、交配スポットからのIMCEストリークでは、一次ストリークで融合的な増殖が見られ、二次ストリークで多くのコロニーが見られるはずです。次の2つの画像は、交配スポットの10⁻²希釈懸濁液を、TYストレプトマイシン X-Gal寒天培地およびTYストレプトマイシン・ゲンタマイシン X-Gal寒天培地に播種した様子を示しています。青色のコロニーは単一組換え体です。一方、白色のコロニーは、緑色光下で赤色フィルターを通して観察した際に真のカセット交換が起こったトランスインテグリンです。TY strept cin xgl agar上の交配スポット再懸濁液の10⁻²希釈系列では、蛍光が見られません。対照的に、Ty streptomycin Gentamycin Xgl Agar上の交配スポット再懸濁液の10⁻²希釈系列では、2段階の蛍光レベルが認められます。より明るいコロニーは青色のコロニーに相当し、ベクター内のLACプロモーターからのリードスルーが生じているためと思われるが、RFPの発現レベルが高い。明るさの低いコロニーは白色のコロニーに相当し、これらは真のカセット交換が行われており、RFPがその直近のプロモーターのみを保持し、LACプロモーターからのリードスルーがない状態である。これらの傾向にあるコロニーは、スペクチノマイシン感受性であるはずである。全レシピエントに対するトランス移行菌の割合として表されるトランス統合の効率は、0.5%の範囲内である必要があります。このビデオを視聴することで、我々が構築したエンジニアリング株を用いた細菌接合により、DNAコンストラクトを細菌染色体に挿入する方法について深く理解できるはずです。

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