サイト固有の細菌染色体工学：ΦC31インテグラーゼを介したカセット取引所（IMCE）

本実験の全体的な目的は、目的のDNAコンストラクトを細菌染色体上のあらかじめ決定された遺伝子座に組み込むことです。これは、4種類の遺伝子組換え細菌株を用いた接合プロトコルによって達成されます。レシピエント株は、スペクチノマイシン耐性遺伝子と、ATPサイトに挟まれたE. coli β-グルクロニダーゼ遺伝子からなるランディングパッド配列が染色体に組み込まれています。

P JH one 10ドナー株は、スタッファー赤色蛍光タンパク質遺伝子を挟むattBサイトと抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミドを保持しています。PJC twoドナー株は、LACプロモーターの制御下にあるストレプトマイセスファージC 31由来の部位特異的インテグラーゼを含むプラスミドを保持しています。4番目の菌株であるMT 616は、細胞間でのプラスミド転移に必要な接合転移遺伝子を提供し、受容菌株におけるトランスジェニックの作製を可能にします。

インテグラーゼ介在性カセット交換（integrase mediated cassette exchange）に必要な2種類のプラスミドを入手します。PJ H one 10プラスミド由来のドナーカセットと、染色体上のランディングパッドカセットのマーカーを交換すると、ランディングパッドマーカーであるSPRおよびUIDAが消失し、結果として得られるトランスイミグラント（trans immigrant）においてドナーカセットのRFPおよびGMRが維持されます。相同組み換えなどの他の手法に対する本手法の主な利点は、プロトコルの簡便さと効率性にあります。

これは、多種多様な細菌への転移も可能です。本ビデオで使用する受容菌株はS. milletae株です。trans-integronsを作成するための接合操作の2日前に、単一のコロニーから5 mLのスペクチノマイシン含有TY培地へ接種します。S. milletae株を30 °Cで2日間、振盪培養します。接合操作の前日に、以下の各E. coli株を、適切な抗生物質を添加した5 mLのLB液体培地へ接種します。インテグラーゼ発現プラスミドを含むDH5αはテトラサイクリン含有培地へ、動員株であるMT616はクロラムフェニコール含有培地へ、そしてドナーカセットプラスミドを含むDH5αはゲンタマイシン含有培地へ接種します。接合操作に向けて、これら3種のE. coli株を37 °Cで一晩、定常的に振盪して培養します。4つの培養液からそれぞれ1.5 mLをチューブに移し、17,000 ×gで30秒間遠心分離して細胞ペレットを回収します。培地を除去し、各細胞ペレットを1 mLの滅菌0.85% NaClに再懸濁します。上清を除去した後、チューブを再度遠心分離します。ピペットを用いて、各ペレットを100 µLの滅菌0.85% NaClに再懸濁します。洗浄した各菌株の培養液を10 µLずつ、プレーンなTY寒天平板上に個別にスポットします。

これらのスポットはコントロールスポットです。次に、Pjc2を含むE. coli DH5αを除く各菌株を40 µLずつ滅菌チューブに加え、ピペッティングで混合します。この混合液を120 µL、プレーンなTY寒天プレートにスポットします。このスポットはインテグラーゼ欠損ネガティブコントロールとなります。

最後に、滅菌チューブに4つの菌株をそれぞれ40 µLずつ加えて混合し、その混合液160 µLを同一のTDY寒天培地にスポットします。このスポットが、インテグラーゼ媒介カセット交換接合スポットになります。

プレートをラミナーフローフード内に設置し、その後、スポットが乾燥するまで約20分間放置します。プレートを密封し、接合プロトコルのストリークを実施した翌日に、30 °Cで一晩インキュベートします。2つのコントロールスポットとIMCE接合スポットを、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシンを添加したTY寒天培地にストリークします。

S milli受容菌株は、IMCE効率を算出するためにストレプトマイシンに対する高レベルの耐性を付与する変異を保持しています。IMCE接合スポットの約4分の1を500 µLの滅菌済み0.85% Sodium chlorideに懸濁し、10⁻⁷まで10倍連続希釈を行います。転移体を回収するため、10⁻²から10⁻⁵までの希釈液を、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、およびxglを添加したTY寒天平板に播種します。また、転移体および潜在的な受容菌の両方を回収するため、10⁻³から10⁻⁷までの希釈液を、ストレプトマイシンおよびxglを添加したTY寒天平板に播種します。プレートを30 °Cで3日間インキュベートします。

緑色光下および赤色フィルターを通してRFPトランスジェニックを確認し、全レシピエントのCFUに対するトランス移民のCFUとしてIMCE効率の割合を算出します。ストレプトマイシンおよびジェンタマイシンを添加したTy培地で3日間培養した後、トランスジェニックの約半分は真の交換が起こり、白色で感受性を失った状態になります。以下のコントロール株では増殖が見られないはずです：インテグラーゼ欠損コントロール s milli latte UW 2 27、コントロール e coli MT 616、P JH one 10コントロールを含むコントロール e coli DH five alpha、およびPJC twoコントロールを含む e coli DH five alpha。対照的に、接合部位からのIMCEストリークでは、一次画線部分に融合的な増殖が認められ、二次画線部分に多くのコロニーが観察されるはずです。次の2つの画像は、接合部位を10⁻²に希釈して再懸濁したものを、TYストレプトマイシン xgl 寒天培地およびTYストレプトマイシン・ジェンタマイシン xgl 寒天培地で培養した様子を示しています。TYストレプトマイシン・ジェンタマイシン xgl 寒天培地において。

青色のコロニーは単一組換え体です。一方、白色のコロニーは、緑色光下で赤色フィルターを通して観察した際に真のカセット交換が起こったトランスインテグリンですが、TY strept cin xgl寒天培地上の交配スポット再懸濁液の-2倍希釈分は蛍光を欠いています。対照的に、Ty streptomycin Gentamycin Xgl寒天培地上の交配スポット再懸濁液の10⁻²倍希釈分は、2段階の蛍光を示しています。

より明るいコロニーは青色のコロニーに対応しており、RFPの発現レベルが高くなっています。これは、おそらくベクター内のLACプロモーターからのリードスルーが起こっているためと考えられます。明るさの低いコロニーは白色のコロニーに対応しており、これらは真正のカセット交換が行われており、RFPがその直近のプロモーターのみを保持し、LACプロモーターからのリードスルーがない状態です。これらの傾向にあるコロニーは、スペクチノマイシン感受性であるはずです。

総レシピエントに対するtrans移民の割合として表されるtrans統合の効率は、0.5%の範囲内である必要があります。このビデオを視聴することで、設計された菌株を用いた細菌接合により、DNAコンストラクトを細菌染色体に挿入する方法について十分に理解できるはずです。