キイロショウジョウバエのための持久力トレーニングのプロトコルと縦パフォーマンスアッセイ

本実験の目的は、新規の持久性運動プログラムを用いてDsofおよびMelanogasterをトレーニングし、運動トレーニングの効果を評価することです。これは、複数のショウジョウバエが入ったバイアルを繰り返し昇降させる自動装置を用いることで、ハエの本能的な登攀反応を活性化させ、運動セッションを行うことで達成されます。ハエは3週間のトレーニング期間にわたり、1日2〜3時間の段階的なスケジュールでトレーニングされます。

次に、運動の影響を測定するために、ショウジョウバエを用いてさまざまな行動解析を行います。結果として、急激に誘発される負の地軸（negative geo axis）またはリングアッセイで測定したところ、運動させたハエはより速く登ることが示されました。他の動物を用いた持久力トレーニングなどの既存の手法に対するこの手法の主な利点は、drosophilaの遺伝子操作に利用可能なツールが非常に豊富であることです。

持久性運動の研究において、我々がこの手法を考案したのは、多数の単一負地走性試験（single negative geo taxis assays）を実施していた時でした。ショウジョウバエがどのくらいの時間登り続けることができるのか、また、このような方法で持久力トレーニングが可能かどうかに関心を持ちました。パワータワーは、テーブルにクランプで固定した長方形の合板の上に構築されています。

毎分4.5回転。ギアモーターは数枚のボードの上に設置され、速度制御装置、ヒューズ、および電源スイッチに配線されています。ジャンクションボックス内では、金属製チューブに固定された3インチのファンが、冷却のためにモーターに向けられています。

モーターにはローラー付きの回転アームが接続されています。モーターとアームが回転すると、その先端が、合板に取り付けられた曲げ棒の一端を押し下げます。棒の反対側にはドアヒンジがあり、そこにホイールが取り付けられているため、プラットフォームに沿って転がることができます。

モーターの回転に合わせて上下に昇降し、モーターの出力は1回転の周期が15秒になるように調整されています。プラットフォームには、バンジーコードでショウジョウバエのバイアルラックが固定されており、ラックに配置されたバイアルは、同じくプラットフォームに固定されたスクリーンで securing されています。プラットフォームはバンジーコードによって標準的なドロワー（引き出し）スライダーに沿って上下にスライドし、落下時の衝撃は発泡スチロールのクッションで緩衝されます。パワータワーは、動物の飼育条件に合わせるため、温度管理された室内で運用されます。

運動実験を行うには、持久力および負の地軸方向への移動（登攀能）を縦断的にモニタリングするために、年齢を一致させた雄のハエが最低240匹必要です。ハエは1バイアルあたり20匹の集団で維持してください。バイアルを同数の2つのグループに分け、一方を運動群とします。運動群のバイアルはフラグで密閉し、対照群のバイアルはスポンジストッパーで密閉してください。

スポンジは、サイズを調整することでバイアルの底部付近に簡単に配置できるため、固定に使用されます。また、より柔らかいスポンジ素材を用いることで、硬いプラグによる損傷を軽減できます。餌を入れたバイアルは、試験前に1日おきに交換してください。

トレーニング中、ハエは餌入りのバイアル内に留まらせます。空のバイアルを使用すると、トレーニングに関連した外傷を負うハエが大幅に増加するためです。対照群のハエが入ったバイアルをパワータワーにセットする際は、スポンジ栓を餌の表面から約3 mm上の位置まで押し下げ、ハエの移動範囲を制限してください。

一貫した結果を得るための動作について。2組のショウジョウバエの両方を、1週間に5日連続でテストします。その際、3週間の期間にわたって1セッションあたりの時間を1日2時間から3時間へと段階的に増やすスケジュールを採用してください。もちろん、どのようなレジメンを用いても構いません。

3週間の期間にわたり、処置、実施時間、およびアッセイ方法の一貫性を維持することが不可欠です。慎重なスケジューリングと手順の練習により、疲労によるエラーの可能性を低減できます。アッセイは、トレーニングレジメンの前、後、または期間中に、ショウジョウバエを用いて縦断的に実施することが可能です。

また、環境変数に対するより安全な反応を評価するためにも使用できます。トレーニングを行わない日に疲労アッセイを実施してください。一日の始まりに、両群のハエをパワータワーにロードします。

装置を起動し、10分ごとに各バイアルを観察します。4回連続して、バイアル内の2インチ以上に登るショウジョウバエが5匹以下であった場合、そのコホートは疲労したとみなされます。装置を動作させたまま、疲労したハエをパワータワーから取り出し、取り出した時間を記録します。

すべてのバイアルを最大10時間観察し、結果をまとめてください。定量のためのアッセイを1回行います。トレーニングの効果は、ランニング速度の定期的測定により評価し、これはトレーニング期間中およびその後も継続して実施可能です。

トレーニングの長期的な効果を測定します。登攀速度またはリングアッセイを開始するには、まずハエを新しい空のバイアルに移し、6本のバイアルを1列にバイアルラックに配置します。バイアルをラックに固定するには、丸めたテープを使用します。

次に、バイアル内を均一に照らせるよう、X線ビューボックスなどの光源の前にラックを設置します。各バイアル内のショウジョウバエの位置が確認できるようにカメラを設置します。その後、6本のバイアルを軽く叩いてすべてのハエを底に落とし、時間を記録して写真を撮影します。

すべてのハエがノックダウンしてから2秒後に行います。カメラのフラッシュを使用する場合は、一貫して使用してください。パワータワーに進む前に、各バイアルセットに対してこの工程を4回繰り返します。

データを解析するために、ソフトウェアを用いて各写真を個別にスコアリングし、バイアルの上限と下限の境界を特定します。次に、各ショウジョウバエの登攀高を測定します。その後、登攀高をExcelにコピーします。

各バイアル内の個々のショウジョウバエに対し、クアドラントの高さに応じて0から4までのスコアを付けます。最高位置のクアドラントまで登った場合は4、全く登らなかった場合は0とします。バイアルごとに、20匹それぞれのハエのスコアを算出し、そのコホートの平均スコアを求めます。

これはクライミングインデックスと呼ばれます。データ解析には、その日の各コホートにおける4つのクライミングインデックスの平均値を使用します。画像処理ソフトウェアが利用できない場合は、空のバイアルに象限線を引き、ハエを各象限に手動で割り当てることができます。一方で、持久力プロトコルに反応したハエは、加齢に伴う登攀能力の低下が抑制されていました。

これは、生後5週間にわたる縦断的なリングアッセイに反映されているように、トレーニング終了後も持続しました。したがって、パワータワープログラムによる運動の誘発を行動学的入力として利用でき、遺伝的または環境的要因がこの効果を調節する能力を評価することが可能です。逆に、パワータワーを出力として使用することもできます。

例えば、飼料中のショ糖含有率を変化させたショウジョウバを用いて、疲労に至るまでの時間を測定した際、ショ糖含有量の増加は持久力の向上と相関していました。この手順を行う際は、すべてのショウジョウバのコホートの週齢を一致させ、実験期間を通じて一貫した方法で操作を行うことが重要です。

このビデオを視聴することで、あらゆる遺伝子型のショウジョウバエにおける持久力のトレーニングおよび評価方法について、十分に理解することができます。