単純ヘルペスウイルスの待ち時間と再活性化の研究の主ニューロン培養システム

本実験の目的は、単純ヘルペスウイルスの潜伏感染および再活性化の研究に、初代ニューロン培養システムをどのように利用できるかを示すことです。まず、ラット胚から上頸神経節ニューロンを単離し、非ニューロン細胞を除去した後に解離神経節から単離したニューロンを培養します。次に、溶菌性複製阻害剤の存在下で、EGFPウイルスを用いてニューロンに感染させ、HSVの潜伏感染を成立させます。

次のステップは、潜伏感染した培養細胞の再活性化を誘導することです。最後に、EGFPの発現を経時的にモニタリングすることで、再活性化の効率を評価します。最終的に、化学的阻害剤、RNA干渉、および遺伝子導入を用いることで、異なる神経シグナル伝達経路が単純ヘルペスウイルスの潜伏および再活性化をどのように制御しているかを示す結果を得ることができます。

既存の手法に対する本手法の主な利点は、宿主ニューロンにおける単純ヘルペスウイルスの潜伏を制御する相互作用を、分子レベルで詳細に研究できる点にあります。本手法は、潜伏ゲノムを抑制して作用するシグナルは何であるか、また、分子レベルで再活性化はどのように誘発されるかといった、単純ヘルペスウイルスの潜伏分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。ニューロンにおいて、本手法はHSV-1の潜伏に関する知見を提供することができます。

本手法は、他の神経向性αヘルペスウイルスにも適用可能です。本手順のデモンストレーションを行うのは、当研究室の大学院生であるmarigo、Kochi、およびJulian Kimです。本プロトコルで使用する上頸神経節（SCG）ニューロンは、妊娠したラットから摘出した胎生21日（E 21）のラット胎児から分離します。解剖フードを使用し、肩のすぐ上の首の付け根に鋏を当て、胴体から頭部を切り離すことで、各胎児を安楽死させます。神経節を露出させるため、23ゲージの針を用いて、頭部の首側を上にして3箇所を固定します。

まず、脊髄をピンで固定します。次に、前方の皮膚を鼻の方へ引っ張ってピンで固定し、3番目に食道と気管を首の後ろから離してピンで固定します。総頸動脈の分岐点を確認し、SCGを探します。

頸動脈は対をなす構造です。首の両側に分岐部が1つずつあり、したがって1個体あたり2つのSCGが存在します。SCGは、その分岐部の直下に位置しています。

2つの端を持って分叉部を広げ、動脈からSCGを分離させます。SCGは、分叉部を囲む不透明な黄色い脂肪組織と比較して、半透明で無色です。神経節を12 millilitersのL 15に入れます。

氷上で15 mLコニカルチューブに入れ、グルコースを添加した培地を用意する。胚からすべてのSCGを回収し、慎重に引き出した後、神経節を600 RPMで1分間遠心分離し、過剰な培地を除去する。

トリプシンおよびコラゲナーゼを含む L 15 中に神経節を 1 mL 分懸濁させ、37 °C で 24 分間インキュベートします。

8分ごとに攪拌します。次に、10 mLの海水培地を加え、トリプシン遠心分離を1分間行い不活性化させます。600 RPMで、トリプシン・コラゲナーゼ培地を可能な限り除去し、10 mLのC培地を用いて600 RPMで1分間遠心分離し、神経節を洗浄します。

この洗浄を1回繰り返します。洗浄液を除去し、神経節を1 mLのC mediaに再懸濁させ、5 mLシリンジに取り付けた21Gの針を用いて、最大15回の上下ストロークでトリチュレーション（t tritrate）を行い解離させます。その後、塊の大部分が解離するまで、23Gの針を用いてトリチュレーションを完了させてください。

解離させたニューロンを70 micronのナイロンフィルターでろ過し、50 milliliterのコニカルチューブに回収することで、残っている細胞の凝集塊を除去します。ろ過後の細胞懸濁液から10 microliter分を取出し、triam blueを混合して生存細胞数を測定します。ヘモサイトメーターを用いて、色素を取り込まなかった細胞数をカウントします。

次に、コラーゲンとラミニンで事前コーティングし、C mediaに50 ng/mLの神経成長因子を添加した96ウェル組織培養プレートの各ウェルに、C media 100 µLあたり5,000から6,000個の全生存細胞を分注します。37 °Cで一晩インキュベートし、翌日（in vitro 1日目またはDIV 1）に、ニューロンが適切に接着しているか、および一部の軸索突起が伸長しているかを確認します。

ウェルのC培地を、NGF、Acho、および5-fluoro-2'-deoxyuridineを含む50 µLの神経基底培地（NBM）に交換します。細胞が乾燥しないよう、1行ずつ培地を交換してください。その後、培養物を37 °Cで5日間インキュベートします。

非神経細胞の死滅とニューロンの成長を確認するため、培養状態を毎日観察します。in vitro 6日目にこの手順を開始する際は、大部分の非神経性支持細胞が排除されているかを確認してください。常に、ニューロンへの不必要な物理的操作を最小限に抑えることが極めて重要です。

培地の除去と交換は、非常に穏やかかつゆっくりと行う必要があります。そうしない場合、生じうる機械的ストレスがニューロンの生存率に影響を及ぼす可能性があります。各ウェルの既存の培地に、アシクロビルまたはコントロールvehicle（CV）を最終濃度100 micromolarになるように添加します。翌日の細胞に機械的な力が悪影響を及ぼさないよう、CVはゆっくりと穏やかに添加してください。

DIV 7に、ウイルス溶菌タンパク質 US 11 に融合させた EGF レポーターを発現する組換え HSV 1 を、感染多重度 1～2 で SCG 培養細胞に感染させます。希釈したウイルスをウェル内の既存の培地に直接添加してください。擬似感染コントロールと溶菌感染を含めてください。

CVを含まない培地を用いたポジティブコントロール。感染を37°Cで2〜3時間進行させます。次に、感染培地をNGFおよびCVを含む新鮮なNBMに交換します。感染培地を交換する際は、極めて慎重に行うことが重要です。プレートを自分の方へ傾け、ウェルの底からゆっくりと培地を取り除いてください。

次に、ピペットの先端をウェルの底ではなく壁面に向け、培地が細胞の上に静かに流れ落ちるようにします。細胞の乾燥を防ぐため、培地の交換は1列ずつ行ってください。HSV 1の潜伏感染を維持する能力を損なわないよう、可能な限り丁寧に扱いながら、培養物をインキュベーターに戻します。

培養物を37°Cで6日間維持し、その間にウイルスに潜伏感染を確立させます。この期間中、溶菌性複製を示す指標として、蛍光顕微鏡を用いてus 11 EGFPの発現をモニタリングしてください。

予想通り、擬似感染コントロールではGFPの発現は見られないはずです。S 11 EGFPは、感染させたウェルでのみ検出されるはずです。CV処理を行っていないポジティブコントロールウェルでは、一次感染が成功し、有効な溶菌サイクルによる複製が行われたことが示されます。

DIV 14における再活性化を評価するため、前回と同様に、CVを含む培地をCVを含まない新鮮な培地に慎重に交換します。ピペットのチップをウェルの底ではなく壁面に向け、必要に応じて培地が細胞上に緩やかに流れ込むようにします。20 micromolarのLY 2 9 0 0 4などの薬理学的または生物学的変数を加えてください。

A CV処理した潜伏感染培養液では、GFP発現が検出されないはずです。細胞を37 °Cに戻し、5〜6日間培養します。蛍光顕微鏡を用いて生存培養液をモニタリングし、再活性化が起こっているニューロンを検出します。

再活性化頻度は、EGFP陽性ニューロンを含むウェルの数を数え、それをサンプルウェルの総数の割合として算出します。この図は、再活性化の既知の誘導剤であるトリガースタチンを、感染後のSCG培養物に適用した例を示しています。薬物処理後、5日間にわたり蛍光顕微鏡を用いて毎日再活性化のモニタリングとスコアリングを行いました。

TSAを用いた場合、再活性化は2日以内に最大値の50%に達し、5日後には60%に達します。DMSOで示されるベースラインまたは自発的な再活性化は、本実験における処置対照群の培養細胞では約10%であり、このin vitroシステムを用いた場合は通常5%から20%の範囲となります。感染したSCG培養細胞の後半段階においても、LY 2 9 0 0 4による処理が行われました。

LYによって再活性化を誘導した再活性化培養系を、ウイルスDNA合成阻害剤であるPAAで処理したもの、および両化合物を併用して処理したものと比較した結果をここに示します。LY 2 9 4 0 0 2で再活性化を誘導した培養系において、US 11 EGFPの発現がPAAによって抑制されたことは、US 11 EGFPの発現がウイルスDNA複製に依存していることを示しています。本手順を実施する際は、無菌操作に細心の注意を払い、ストレスや物理的な刺激による自発的な再活性化の増加を避けるため、CG培養細胞をできるだけ優しく扱うことが重要です。培養ニューロンにHSV 1の潜在感染を成立させる本手順に従い、shRNAによるノックダウンや、野生型および変異型遺伝子の異所性発現などの他の手法を用いることで、HSV 1の潜伏および再活性化を制御するニューロン機能の特性解析を行うことが可能です。

HSV-1はBSL-2の安全対策が必要なヒト病原体であることを忘れないでください。本手順を実施する前に、BSL-2条件下での操作に習熟しておく必要があります。このビデオを視聴することで、潜在性HSV-1感染を成立させるためのSCG培養の確立方法と、ニューロンにおける効果的な再活性化誘導法について十分に理解できるはずです。