蛍光による神経組織の持続的なDNAウイルスのゲノム転写物の検出その場でハイブリダイゼーションは、免疫染色と組み合わせる
2014年1月23日
我々は、動物モデルの組織切片内の永続的なDNAウイルスゲノムの検出のためのin situハイブリダイゼーションプロトコルにおいて蛍光を確立した。このプロトコルは、ウイルスゲノムのcodetection、そのRNA産物、および単一細胞内のウイルスまたは細胞タンパク質によって感染プロセスを研究できます。
この手順の全体的な目標は、蛍光in situハイブリダイゼーションにより、潜伏感染マウスの三叉神経節の切片である単純ヘルペスウイルスのゲノムを検出することです。これは、最初に動物の口唇にウイルスを接種し、次にウイルスが三叉神経節に確立される28日間の潜伏期間が続くことによって達成されます。次に、三叉神経節を採取し、埋め込み、クライオ切片にします。
切片は、クエン酸ナトリウム緩衝液で加熱する重要なステップを含む、いくつかの準備処理を受けます。最後に、ヘルペス特異的な蛍光ローブを使用して、蛍光in situハイブリダイゼーションを行います。最終的には、共焦点顕微鏡を使用することで、個別に感染したニューロンの核内にウイルスゲノムが位置していることを示すことができます。
多くの場合、さまざまなライフサイクルの研究には動物モデルの使用が必要です。ここで表現する手法の主な利点は、研究所の流暢化アプローチを使用してシングルセルレベルでデータを提供することです。HS感染症のロイヤルキラーモデルは、ヒトにおけるHSV1感染の自然史のほとんどの側面を再現しています。
それがウイルスの自然宿主です。一次感染は口腔組織で行われ、その後、ウイルスは唇から2つのアル神経節に進行します。これが、ヒトにおけるHS V潜伏の主な側面であり、2つの免疫と染色を組み合わせたものです。
この方法は、ウイルスが核成分とどのように相互作用するか、これらの相互作用が潜伏期間の維持、そして最終的にはウイルスの再活性化にどのように影響するかなど、ヘルペスウイルスの潜伏期間に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。まず、麻酔をかけたマウスとHSV One virusストック溶液を用意します。フェノールレッドフリー培地に再懸濁します。
双眼ステレオスコープを使用して、左上唇の上皮下層の粘膜皮膚境界に針を挿入します。0.5マイクロリットルのウイルス溶液を5秒間かけて注入し、同じ部位で2回目のウイルス注入を行います。マウスが目覚めるまで、マウスを摂氏37度のインキュベーターまたは加熱パッドに移します。
次に、テキストプロトコルに従ってperfuが修正する前に、必要な回復時間のためにホームケージに入れます。下顎の両側に切り込みを入れます。次に、切歯のすぐ後ろの鼻の先端を切って、鼻腔を露出させます。
口蓋をハサミで半分に切り、横に置きます。三叉神経節は口蓋の下にあります。それらは白い長方形の塊で、長さは2〜3ミリメートルで、三叉神経に接続されています。
神経節の両側にある三叉神経枝を切断して、脳幹から解放します。外科用ペンチを使用して、神経節を取り外し、PBSの20%スクロースに移し、24時間インキュベートします。翌日室温で、両方の三叉神経節を凍結切片の1つのブロックに埋め込みます。
埋込用培地を、ブロックをマイナス80°Cで凍結し、クライオスタットで切片化します。三叉神経節を縦に10ミクロンのセクションに切り、摂氏30度に温めたスーパーフロストスライドに集めます。1枚のスライドに4〜5つのセクションを収めることができます。
スライドに複数のシリーズラベルを付けると便利です。複数の下流用途を計画している場合は、スライスを5〜10分間乾燥させてから、摂氏マイナス80度で保管します。このプロトコルでは、プローブは、HSV 1ゲノムの30キロベース部分を含む宇宙をNICトランスレーションによるSI 3D CTPで標識することによって調製されます。
それは脱イオンされた形態のアミドで沈殿し、懸濁され、初日にS SI 3の取り込みによりピンク色に見えるはずです。スライドを室温のスライドホルダーに置き、切片を10分間乾かします。次に、1つのXPBSで切片を10分間水分補給します。
次に、1つのXPBSで0.5%Triton X 100の組織を20分間パーメします。次に、スライドを2つのXSSで1回の洗浄につき10分間3回洗浄し、マスキング解除バッファーが加熱されるまで2つのXSSCに保持します。マスキングを解除するには、クエン酸バッファーを電子レンジでバッファーが沸騰するまで予熱します。
これは、ガラススライドトレイに200ミリリットルのバッファーを充填することによって行われます。500ミリリットルの蒸留水で満たされた大きな容器にトレイを置き、沸騰するまでバッファーを予熱します。次に、スライドをトレイに移します。
電子レンジでバッファーで完全に覆われていることを確認します。バッファー内のスライドを約20秒間、バッファーが沸騰するまで加熱します。バッファーが沸騰しないようにしてください。
次に、スライドを室温で2分間冷却し、加熱サイクルをさらに6回繰り返します。マスキング解除ステップの再現性のためには、食事サイクルの数と期間を経験的に決定することが重要です。電子レンジ、トレイ、容器、トレイ内のバッファーの量。
加熱が終了したら、容器内の水の量を同じに保つ必要があります。スライドを2つのXSSCで5分間ヒュームフードの下で移し、メタノール、酢酸、PBSの3〜1〜4溶液で15分間インキュベートします。次に、新たに調製した3〜1個のメタノールと酢酸の混合物でスライドを15分間インキュベー
トします。次に、70%エタノールで10分間のインキュベーションを連続して行い、続いて純粋なエタノールで10分間のインキュベーションを2回行い、切片を脱水します。スライドを室温で10分間乾燥させ、プローブの準備をします。乾燥した部分に80マイクロリットルのプロービング溶液を滴下し、カバースリップで覆います。
プローブ溶液がカバースリップの表面全体に広がり、気泡がないことを確認します。次に、カバースリップをゴムセメントで密封し、乾かします。スライドを摂氏80度で5分間インキュベートすることにより、変性を進めます。
次に、スライドを氷の上の金属トレイにすばやく5分間移します。これに続いて、翌日摂氏37度で一晩のハイブリダイゼーションを行います。鉗子でゴムセメントを37°Cのヒートブロックにスライドして取り外します。
メスの刃先でカバースリップをそっと取り外します。次に、SSCで切片を繰り返し洗浄します。次に、DAPIなどの適切な色素またはフック3 3 3 4 2で、1つのXPBSで0.5マイクログラム/ミリリットルでサンプルを10分間染色します。
次に、スライドを1つのXPBSで1回の洗浄につき10分間3回洗浄します。3回目の洗浄後、スライドからできるだけ多くの液体を排出します。次に、各スライドの最後に、80マイクロリットルの封入剤と退色防止剤を塗布します。
高光学品質のカバースリップで媒体をゆっくりと覆い、気泡の形成を防ぎます。次に、スライドをマニキュアで密封し、摂氏4度の暗闇に保管します。このプロトコルを開発するにあたり、いくつかのソルトバッファーをアンマスキングのためにテストしました。
一方、EDTAバッファーは組織を損傷する傾向がありました。クエン酸ナトリウムトリス、HCL、および蒸留水は、HSV 1 検出に適しており、プロトコールが市販のプローブで機能することを確認しました。HSV 1潜伏ゲノム検出は、Enzo Biochemから得られたPAN HSV One Biotinylatedプローブを用いて行い、HSV Oneゲノムの単一および複数のスポットパターンを検出することができた。
さらに、DNA魚のプロトコルは、一般的に使用される3つのHSV One株に感染したマウスとウサギでテストされました。すべての場合において、HSV oneゲノムは、明るさと強度が変動するむらのあるシグナルを示しました。さらに、プロトコルの適用性は、一般的なヘルペス感染を受けたマウスの組織上でDNAフィッシュを行うことにより、HSV Oneの複製サイクルでテストされました。
これらの動物では、HSV Oneゲノムの大きくて明るい凝集体が、DRGの眼や脳を含むさまざまな組織で検出されました。DNAフィッシュプロトコルは非常に汎用性が高いです。これにより、HSV、1ゲノム、ウイルスまたは細胞のRNAおよびタンパク質の同時検出が可能になります。
例えば、HSV one genome with the HSV one lat RNAの共検出は、Centro MERICタンパク質CE NPA Aなどの細胞タンパク質とHSV oneゲノムの共検出が可能で、HSV oneとクロマチンおよびPML核体との共検出が利用されました。関連プロテインA TRXは、HSV 1D NAを赤色で示すトリプル染色で視覚化しました。そのRNA産物は青でlat、緑でTRXです。
マスキング解除が設定されると、DNAフィッシュの手順は非常に堅牢になります。20枚以上のスライドのバッチで24時間以内に行うことができます。この技術の開発により、ヘルペスウイルスやその他の持続性ウイルスを研究している研究者は、細胞成分と核構造がこれらのウイルスの生物学にどのように影響するかをシングルセルレベルで調査できるようになります。
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概要
この記事では、潜伏感染したマウスの三叉神経節切片から単純ヘルペスウイルス1型ゲノムを検出するために設計された蛍光in situハイブリダイゼーションプロトコルを紹介しています。この方法により、個々のニューロン内でのウイルスゲノムとそのRNA産物の可視化が可能となり、感染プロセスに関する洞察を提供します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- ウイルス学
- 細胞生物学
背景
- 単純ヘルペスウイルス1型は三叉神経節で潜伏状態を確立できます。
- ウイルスゲノムの位置づけを理解することは、その感染メカニズムの研究に不可欠です。
- 蛍光in situハイブリダイゼーションは、組織切片内の核酸を可視化する強力なツールです。
- 共焦点顕微鏡は、個々の細胞の詳細なイメージングを可能にします。
研究目的
- 組織切片における単純ヘルペスウイルスゲノムを検出するためのプロトコルを開発すること。
- 感染したニューロン内でのウイルスゲノムとそのRNA産物を可視化すること。
- 細胞レベルでの感染プロセスの理解を深めること。
使用した方法
- 動物の唇へのウイルス接種。
- 三叉神経節でのウイルス確立のための28日間のインキュベーション期間。
- 三叉神経節の採取、埋め込み、凍結切片作成。
- ヘルペス特異的な蛍光プローブを使用した蛍光in situハイブリダイゼーション。
主な結果
- 組織切片における単純ヘルペスウイルスゲノムの成功的な検出。
- 感染ニューロンの核内におけるウイルスゲノムの位置の可視化。
- 共焦点顕微鏡による方法の有効性の実証。
- 単一細胞レベルでの感染プロセスへの洞察。
結論
- 開発されたプロトコルは、単純ヘルペスウイルスの潜伏状態の研究に有効です。
- 蛍光in situハイブリダイゼーションは、ウイルス感染のダイナミクスに関する貴重な情報を提供します。
- この方法は神経科学における他のウイルス研究にも適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables single-cell detection of persistent viral genomes in neuronal tissues, addressing a critical gap in virology research where low-copy viral reservoirs are difficult to visualize. By combining DNA-FISH with RNA-FISH and immunostaining, it provides mechanistic insights into virus-host interactions that inform target validation and antiviral screening strategies. The approach supports preclinical de-risking by clarifying viral latency mechanisms in relevant animal models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral genome positioning relative to nuclear components to assess mechanisms of latency maintenance.
- Scientific Value: Supports functional validation of viral and host targets by co-detecting genomes, transcripts, and proteins in individual neurons.
- Scientific Value: Facilitates hypothesis testing about viral reactivation triggers through spatial correlation of viral and cellular signals.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Produces low-background, high-resolution signals compatible with confocal and wide-field microscopy for reliable readouts.
- Operational Value: Works with both custom and commercially available probes, enabling assay flexibility and reagent standardization.
- Operational Value: Accommodates a wide range of antibodies, supporting multiplexed screening of viral and cellular markers.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Uses a clinically relevant HSV-1 latency model in mice that mirrors human neuronal infection patterns.
- Translational Value: Enables longitudinal assessment of viral reservoir dynamics in tissues, informing predictive confidence in reactivation risk.
- Translational Value: Supports biomarker discovery by linking viral genome localization to cellular regulatory proteins.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation, particularly for neurotropic viruses where tissue-specific reservoir analysis is essential.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by revealing how viral genomes interact with nuclear architecture during latency.
- Screening: Generates quantitative spatial data on viral genome copies per cell, enabling compound effect assessment in infection models.
- Analytics: Delivers multiplexed readouts (DNA, RNA, protein) that allow correlation of viral gene expression with host responses.
- Translational Research: Connects findings in rodent ganglia to human-relevant neuropathogenesis, supporting cross-species extrapolation.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other persistent DNA viruses and tissue types, promoting platform reuse across virology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in viral persistence studies through direct visualization of viral nucleic acids.
- Operational Value: Enables reproducible tissue processing with heat-based unmasking that works across antibody and probe types.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying reservoir biology that influences reactivation-driven pathogenesis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antiviral candidates based on latency-relevant mechanism data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, tissue sectioning, and nucleic acid hybridization techniques.
- Dependent on access to cryostat, hybridization oven, and confocal or wide-field fluorescence imaging systems.
- Necessitates standardization of unmasking cycles and probe concentration across labs for consistent signal-to-noise ratios.
- Adaptation to new tissue types may require optimization of permeabilization and antigen retrieval steps.
- Protocol duration of 2.5 days necessitates batch processing planning for high-throughput applications.
