蛍光による神経組織の持続的なDNAウイルスのゲノム転写物の検出その場でハイブリダイゼーションは、免疫染色と組み合わせる

この手順の全体的な目的は、潜在感染したマウスの三叉神経節切片において、蛍光in situハイブリダイゼーションにより単純ヘルペスウイルス1型のゲノムを検出することです。まず、動物の唇にウイルスを接種し、その後28日間の潜伏期間を設けてウイルスを三叉神経節に定着させます。次に、三叉神経節を採取して包埋し、凍結切片を作成します。

切片に対して、クエン酸ナトリウム緩衝液中での加熱という重要なステップを含む、いくつかの前処理が行われます。最後に、ヘルペス特異的な蛍光プローブを用いて蛍光in situハイブリダイゼーションを実施します。最終的に、共焦点顕微鏡を用いることで、個々に感染したニューロンの核内におけるウイルスゲノムの位置を確認することができます。

多くの場合、さまざまなライフサイクルの研究には動物モデルの使用が必要です。ここで提示する手法の主な利点は、in situ ハイブリダイゼーション法を用いて、単一細胞レベルでのデータを提供できる点にあります。HS感染のウサギモデルは、ヒトにおけるHSV-1感染の自然史の大部分を再現しています。

それがウイルスの自然宿主です。一次感染は口腔組織で起こり、その後、ウイルスは口唇から三叉神経節へと移行します。そこがヒトにおけるHSV潜伏感染の主要な部位です。免疫染色と染色の2つを組み合わせて解析します。

この手法は、ウイルスが核成分とどのように相互作用するか、また、これらの相互作用が潜伏感染の維持や最終的なウイルスの再活性化にどのように影響するかなど、ヘルペスウイルスの潜伏感染に関する重要な疑問を解明するのに役立ちます。まず、麻酔をかけたマウスと、フェノールレッド不含培地で再懸濁したHSV-1ウイルスストック溶液を用意してください。

実体顕微鏡を用いて、左上唇の粘膜皮膚境界部の皮下上皮層に針を刺します。ウイルス溶液 0.5 µL を 5 秒かけて注入し、次に同じ部位に 2 回目のウイルス注入を行います。マウスを 37 °C のインキュベーターまたはヒーティングパッドに移し、覚醒するまで保持します。

その後、テキストプロトコルに従って灌流固定を行うまで、必要な回復時間の間、ホームケージに戻します。下顎の両側を切開します。次に、切歯のすぐ後ろで鼻端を切断し、鼻腔を露出させます。

ハサミで口蓋を半分に切り、脇に除けます。口蓋の下に三叉神経節があります。これらは長さ2〜3 mmの白い楕円形の塊で、三叉神経に接続しています。

神経節の両側で三叉神経分枝を切断し、脳幹から切り離します。外科用鉗子を用いて神経節を取り出し、PBSで調製した20%Sucroseに転移させ、24時間インキュベートします。翌日、室温で両方の三叉神経節を単一の凍結切片作成用ブロックに包埋します。

包埋剤に入れ、クライオスタットで切片を作成するまでマイナス 80 °C でブロックを凍結させます。三叉神経節を縦方向に 10 µm の厚さで切断し、30 °C に温めた Super Frost スライドガラス上に回収します。1 枚のスライドに 4 〜 5 枚の切片を配置できます。

スライドに複数のシリーズラベルを付けることが有用な場合があります。後続のアプリケーションを複数予定している場合は、スライスを5〜10分間乾燥させた後、-80°Cで保存してください。本プロトコルでは、HSV-1ゲノムの30kb断片を含むcosmidを、NIC翻訳によりSI 3D CTPで標識してプローブを調製します。

沈殿させ、脱イオンホルムアミドに懸濁させます。1日目のS SI threeの取り込みにより、ピンク色に見えるはずです。スライドを室温でスライドホルダーに置き、切片を10分間乾燥させます。その後、1 XPBSで切片を10分間再水和させます。

次に、組織を0.5% Triton X 100含有 1×PBSで20分間透過処理します。その後、スライドを2×XSSで1回10分間、計3回洗浄し、アンマスキングバッファーが加熱されるまで2×XSSCに浸漬しておきます。アンマスキングのため、クエン酸バッファーを電子レンジで沸騰するまで予熱します。

これは、ガラススライドトレイに200 millilitersの緩衝液を満たすことで行います。トレイを500 millilitersの蒸留水を入れた大きめの容器に入れ、緩衝液が沸騰するまで予熱します。その後、スライドをトレイに移します。

電子レンジ内で、スライドがバッファーに完全に浸っていることを確認します。バッファーが沸騰するまで、約20秒間加熱します。バッファーが沸騰して溢れ出さないように注意してください。

その後、スライドを室温で2分間冷却し、加熱サイクルをさらに6回繰り返します。アンマスキング工程の再現性を確保するためには、加熱サイクルの回数と時間を経験的に決定することが極めて重要です。これは、電子レンジ、トレイ、容器、およびトレイ内のバッファー量によって異なります。

加熱終了後、容器内の水の量を一定に保ってください。スライドを2回XSSCで5分間処理し（ドラフト内で行う）、その後、メタノール、酢酸、PBSを3:1:4の比率で混合した溶液中で15分間インキュベートします。次に、調製したばかりのメタノールと酢酸の3:1混合液中で15分間インキュベートします。

次に、70% ethanolで10分間のインキュベーションを繰り返し、続いて純エタノールで10分間のインキュベーションを2回行い、切片を脱水します。プローブの準備のため、スライドを室温で10分間乾燥させます。乾燥した切片にプローブ溶液を80 µLずつ滴下し、カバーガラスで覆います。

プローブ溶液がカバーガラスの全表面に広がり、気泡がないことを確認します。次に、ゴムセメントでカバーガラスを密封し、乾燥させます。スライドを80°Cで5分間インキュベートし、変性させます。

次に、スライドを速やかに氷上の金属製トレイに移し、5分間静置します。その後、翌日に37 °Cで一晩ハイブリダイゼーションを行います。37 °Cのヒートブロック上で、ピンセットを用いてゴムセメントを除去します。

メス刃の先端を用いて、カバースリップをそっと取り除きます。次に、切片をSSCで繰り返し洗浄します。その後、1 XPBSに溶解した0.5 µg/mLのDAPIやHoechst 33342などの適切な染料を用いて、サンプルを10分間染色します。

次に、スライドを1×PBSで10分間ずつ3回洗浄します。3回目の洗浄後、スライドから可能な限り液体を除去します。その後、各スライドの末端に、退色防止剤を含む封入剤を80 µL滴下します。

気泡が入らないように注意しながら、高光学品質のカバーグラスでゆっくりと培地を覆います。その後、スライドをマニキュアで封印し、4°Cの暗所で保存します。このプロトコルの開発において、アンマスキングのためにいくつかの塩緩衝液が検討されました。

EDTA緩衝液は組織を損傷させる傾向があった。ナトリウムクエン酸トリス、HCl、および蒸留水はHSV 1検出に適しており、市販のプローブを用いて本プロトコルが機能することが確認された。HSV 1潜伏ゲノムの検出は、Enzo Biochemから入手したPAN HSV 1ビオチン化プローブを用いて行い、HSV 1ゲノムのシングルスポットおよびマルチスポットパターンの両方が検出可能であった。

さらに、DNA FISHプロトコルを、一般的によく用いられる3種類のHSV-1株に感染させたマウスおよびウサギで検証しました。いずれの場合においても、HSV-1ゲノムは輝度と強度が不均一な斑状のシグナルを示しました。加えて、全身性ヘルペス感染を起こしたマウスの組織に対してDNA FISHを行うことで、HSV-1の複製サイクルにおける本プロトコルの適用性を検証しました。

これらの動物において、DRG（後根神経節）、目、脳を含むさまざまな組織に、HSV-1ゲノムの大きく明瞭な凝集体が検出されました。このDNA-FISHプロトコルは非常に汎用性が高く、HSV-1ゲノムと、ウイルスまたは細胞のRNAおよびタンパク質の共検出が可能です。

例えば、HSV-1ゲノムとHSV-1 LAT RNAの共検出が可能です。また、Centro MERICタンパク質であるCENP-Aなどの細胞タンパク質を用いたHSV-1ゲノムの共検出や、クロマチンおよびPML核体との共検出も利用されました。関連タンパク質であるATRXは、HSV-1 DNAを赤色、そのRNA産物であるLATを青色、そしてATRXを緑色で示すトリプル染色によって可視化されました。

アンマスキングが完了すれば、DNA fishの手順は非常に堅牢です。20枚以上のスライドを1バッチとして、24時間以内に完了させることができます。本技術の開発により、ヘルペスウイルスやその他の持続性ウイルスを研究する研究者は、細胞成分や核構造がこれらのウイルスの生物学にどのように影響するかを、単一細胞レベルで探索することが可能になります。