Name: 蛍光による神経組織の持続的なDNAウイルスのゲノム転写物の検出その場でハイブリダイゼーションは、免疫染色と組み合わせる (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: 学ぶヘルペス単純ウイルス1型ゲノムの蛍光in situハイブリダイゼーション法。三叉神経節切片で潜伏感染を可視化し、個々のニューロン核内のウイルス動態を単細胞レベルで解析する技術です。

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我々は、HSV-1からのサンプルを提供するためのN.ソーテル（シンシナティ小児病院医療センター、オハイオ州シンシナティ、米国）、S. Efstathiou（英国ケンブリッジ大学）とジェームズ·ヒル（LSU健康科学センター、ニューオーリンズ、米国）に感謝それぞれ、マウスおよびウサギの感染、および試薬のために、有用な議論のためのH·桝本（かずさDNA研究所、千葉県、日本）とS. Khochbin（研究所アルバートBonniot、グルノーブル、フランス）。 この作品は、フランス国立研究機構（ANR）は（ANR-05-MIIM - 、（PLに対してATIPプログラム、http://www.cnrs.fr）センター·国立·デ·ラ·ルシェルシュ科学研究（CNRS）からの補助金によって賄われていた008から01、CENTROLAT、 <a href="http://www.agencenationale-recherche.fr">http://www.agencenationale-recherche.fr</a> ）、FINOVI財団（ <a href="http://www.finovi.org/:fr:start">http://www.finovi.org/:fr:start</a> ）、LabEX DEVweCAN（ANR-10-LABX-61 ）大学リヨンの、プログラム内の「InvestissemenTS D&#39;アベニール」（ANR-11-IDEX-0007）ANR（が運営<a href="http://www.agence-nationale-recherche.fr">http://www.agence-nationale-recherche.fr</a> ）、L&#39;協会（LAルシェルシュコントルルがんを注ぐARC-7979とARC- 4910、 <a href="http://www.arc-cancer.net">http://www.arc-cancer.net</a> ）、ラ·リーグ国立コントルルがん（LNCC、 <a href="http://www.ligue-cancer.net">http://www.ligue-cancer.net</a> ）、およびINCA（EPIPROプログラム、 <a href="http://www.e-cancer.fr">http://www.e - cancer.fr</a> ）。FCとPLはCNRSの研究者である。

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

ここで説明するプロトコルは、マウス神経組織切片のニューロン内のHSV-1潜伏ゲノムの検出を可能にする。ウイルス遺伝子発現を調節する経路の我々の理解は、神経組織内でその場で HSV-1ゲノムDNAを検出する方法の欠如によって制限されてきた。感染した神経細胞のゲノムコピー数及び割合に関する情報は、解離したニューロン11,12上のPCR分析から主になった。 HSV-1の待ち時間に役割を宿主細胞核構造の解明では、潜伏感染したマウスの神経細胞の核内のDNA-FISHにより潜伏HSV-1ゲノムの局在を決定するために設定してください。我々は、DNA-FISHプロトコルや組織の治療の様々なテストし、ウイルスDNA-FISH検出の重要なステップとして、熱ベースの「エピトープアンマスキング」を発見した。このような処理は日常的に、免疫組織化学のためにパラフィン包埋切片内タンパク質エピトープを明らかにするために使用される。それはほぼ普遍的に使用されていますが病理学においては、従来のDNA-FISHでは使用されません。多くの研究は、この技術は、光学顕微鏡のスケールでの組織の形態を保持することをサポートしていますが、エンドユ...

<html>単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）は、複製し、普及するために定期的に再活性化する末梢神経系の三叉神経節（TG）のニューロンの長期潜伏感染を確立し、永続的なヒト神経向性ウイルスである。 HSV-1ゲノムは、宿主細胞ゲノム1,2に統合しない限り多コピーchromatinizedプラスミドを、残っているホストニューロンの核内150キロバイトのdsDNAローカライズです。レイテンシーの間に、HSV-1複製サイクル遺伝的プログラムが強く抑制され、遺伝子発現は、待ち時間設立から再活性化3の開始に潜伏関連転写産物（LAT）遺伝子座に制限されている。 LATは、主要な2キロバイト安定したラリアットに加工ロング8.5キロバイト非コードRNA、およびいくつかのmiRNA 4-7を生成します。 HSV-1待ち時間は、このようにウイルスゲノムDNA、RNA LAT、および検出可能な複製サイクルタンパク質の非存在の存在によって特徴付けられる。 「ontent&gt;動物モデル、主にマウスやウサギは、人間における待ち時間のいくつかの機能をrecapitulating実験モデルである。それらのモデルの主な利益の一つは、彼らが免疫担当宿主におけるHSV-1のレイテンシの生理的な側面を研究できることです。過去数十年にわたってこのような遺伝的に改変されたウイルスおよびマウスなどの多くの実験ツールは、動物組織から、生理学、遺伝学、およびHSV-1の潜伏の細胞生物学を研究するために開発されてきた。これまで、ウイルスゲノムDNAをサザンブロットによって検出および定量し、そして解離のTGからのqPCRはあるが、組織切片8上のin situハイブリダイゼーションにより、HSV-1ゲノムを検出するために利用可能な方法が現在のところ存在しないため、待ち時間は、日常的にではなく、in situハイブリダイゼーション RNAによるLAT RNAを検出することにより、組織切片上で評価されるウイルスゲノムの検出。それは、ウイルスゲノムの存在に基づいて感染細胞を特徴付けるためにTHIのは不可能であったのでの技術的な限界は、ウイルスゲノムおよび細胞およびウイルス遺伝子発現または宿主細胞性免疫応答9,10との間の関係のような宿主-ウイルス相互作用の多くの局面の分析の主な欠点となっている。 最も重要なことは、潜伏感染の細胞間不均一性は、比較的未調査のままであり、マウスおよびSCIDマウスに移植したヒト11-17感覚神経節ニューロンにおける待ち時間の重要な特徴であることが示されている。典型的には、細胞あたりのHSV-1ゲノムのコピー数が5から数百まで変化することをqPCRにより示された。 LATが遅延と再活性化の重要な調節因子として表示されますが、孤立したニューロンと、その場のPCR での定量PCRのデータは、潜在的に感染したニューロンのサブセットのみ、と低く、30％は、LAT遺伝子座11,12,18-21を発現することを示した。どのように宿主細胞とウイルス潜伏の確立上の組織への影響内細胞環境とウイルス遺伝子発現は、不明なままである。ここでは、動物の神経組織切片内の低コピーHSV-1のゲノムDNAを効率的に検出する方法（FISH）in situハイブリダイゼーションロバストな蛍光を記載している。この方法は、宿主細胞の核内のコンポーネント22とウイルスゲノムとの相互作用を検討する必要がある高解像度の顕微鏡イメージングへのアクセスを得るために私達によって設計され、使用されている。さらに、我々は、ウイルス遺伝子発現を調節するウイルス - 宿主相互作用を説明するためのユニークなツールであるRNAおよびタンパク質を有するウイルスDNAの同時検出のための複数の染色法を記載している。この方法はまた、多数のセクションに感染したニューロンを定量としてHSV-1潜伏ゲノムの検出を必要とする分析、広い範囲に適用することができる。重要なステップは、ハイブリダイゼーションのウイルスDNAにアクセスできるように、抗原回復処理を適用することです。このように、このプロトコルは、検出に効果的な場合があります現在、動物組織内で従来のDNA-FISHのアプローチでは検出できない、他の二本鎖DNAウイルスの。

<table><tbody><tr><td>Balb / cマウス</td><td>Janvier、フランス</td><td></td>6<td>週齢の女性</td></tr><tr><td>HSV-1株</td><td>SC16株(野生型)</td><td></td><td>Labetoule、M.らInvestを参照してください。眼科。Vis. Sci 44, 217&ndash;225 (2003) HSV-1株およびウイルスストック調製の詳細。</td></tr><tr><td>塩酸ケタミン</td><td>Σ</td><td>K2753</td><td>ケタミン (100mg/kg) とキシラジン (10mg/kg) を含む溶液の腹腔内注射塩</td></tr><tr><td>酸キシラジン</td><td>Σ</td><td>X1251</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td> <td>Σ</td><td>158127</td><td>90 ml の水に PFA 4 g を懸濁します。50 &micro;1N NaOHのl、および60°Cで加熱。攪拌しながら水浴中のC。PFAは約30分で溶解します。10x PBSを10ml加えます。この溶液は事前に調製し、-20°Cで保存することができます。5mlチューブのC。注意。ヒュームフードの下で操作します。</td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>シグマ</td><td>07982-100TAB-F</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS、pH 7.4 (無菌)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-015</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>シグマ</td><td>84100</td><td>1x PBSに20%スクロース溶液を調製します。</td></tr><tr><td>クライオセクショニング包埋培地 - Tissue-Tek OCT Compound</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>大型ベクターDNA精製キット</td><td>Qiagen</td><td>12462</td><td>HSV-1ゲノムを含むCosmidまたはBACベクターを精製し、-20°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>Nick 翻訳キット</td><td>Roche Applied Sciences</td><td>10 976 776 001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cy3-dCTP</td><td>GEヘルスケア</td><td>PA53021</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td> からの保護<td>&nbsp;</td></tr><tr><td>G50ミニスピンカラム</td><td>GEヘルスケア</td><td>27-5330-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>サケ精子DNA 10 mg/ml</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>15632-011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>エタノール分子生物学グレード</td><td>シグマ</td>87047777777000777000077000000770000000077000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000077000000000000000000000000000 <td></td><td></td></tr><tr><td>Formamid 分子生物学グレード</td><td>シグマ</td><td>F9037</td><td>注意。ヒュームフードの下で操作します。</td></tr><tr><td>HSV-1ビオチン化商用プローブ&nbsp;</td><td>エンツォライフサイエンス</td><td>ENZ-40838</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ImmEdge疎水性ペン</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>20x 生理食塩水 クエン酸ナトリウム (SSC)</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td>ddH20 で 2x SSC 溶液を調製します。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>10%原液を水に溶かし、+4°Cで保存します。使用直前に1x PBSに0.5%溶液を調製してください。</td></tr><tr><td>10 mM クエン酸ナトリウム pH 6.0</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td>100 mM ストック溶液 (10x) を調製します。10.5 gのクエン酸(MW 210.14)を秤量します。注意、刺激性および有毒、適切なマスクと手袋を着用してください)、400mlの水に溶解します。1 N NaOHでpHを6.0に調整します(注意、刺激性、手袋を着用してください)。蒸留水で500mlに調整します。使用前に蒸留水で10倍に希釈してください。</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>シグマ</td><td>320099</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>メタノール、分子生物学グレード</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>デキストラン硫酸塩 - MW 500,000</td><td>Euromedex</td><td>EU0606-A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>デンハルトの解法(100x)</td><td>Euromedex</td><td>1020-A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ゴムセメント「フィクソガム」</td><td>マラバット</td><td>290110000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA精製キット&nbsp; - Qiaquick PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>T7 in vitro転写キット</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>AM1314</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ビオチン-16-UTP</td><td>ロシュ・アプライド・サイエンス</td><td>11388908910</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RNA精製ミニカラム</td><td>Qiagen</td><td>73404</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>リボヌクレオシドバナジルコンプレックス</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>S1402S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>H3410</td><td>蒸留水に3%溶液を調製します。+4 &deg;Cと光から保護します。</td></tr><tr><td>酵母tRNA</td><td>Invitrogen</td><td>15401011</td><td>RNAseフリー水に10 mg/ml溶液を調製</td></tr>します <tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>一次抗体</td><td>任意のサプライヤー</td><td></td><td>結果セクションでは、以下の一次抗体を使用しました: 抗マウス CENP-A (ウサギ mAb C51A7、細胞シグナル伝達技術)、および抗 ATRX H-300 (Santa Cruz バイオテクノロジー)</td></tr> <tr><td>二次蛍光抗体</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td></td><td>私たちのプロトコルで日常的に使用されている蛍光二次抗体は、Alexa Fluor 標識ヤギ抗体 (IgG H+L) です。結果セクションで使用した抗体は、Alexa Fluor 488 (参照 A11001) でラボル処理した抗ウサギヤギ抗体です。</td></tr><tr><td>チラミドシグナル増幅 (TSA) キット - ストレプトアビジン + Alexa Fluor 350 (青色蛍光)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td> <td>#T20937</td><td>TSA キットは、Perkin Elmer</td></tr><tr><td>Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 488 (green fluorescence)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td> からも入手可能です <td>#T20932</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>H3570</td><td>0.5 & micro;使用直前に1x PBS中のg / ml溶液。残りの解決策を破棄します。</td></tr><tr><td>22 mm x 50 mm カバースリップ。1.5ガラス</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>72204-04</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>退色防止剤を含む封入剤 - VECASHIELD</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>もう一つの従来製品は、Electron Microscopy Science</td></tr><tr><td>Superfrost glass slides</td><td>FisherScientific</td><td>12-550-15</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>機器/材料</td><td>会社</td><td>リファレンス</td><td>ノート</td></tr><tr><td>感染</td><td></td><td></td>用針 <td>ガラスマイクロピペット ホットドロー。カスタムメイド。</td></tr><tr><td>解剖機器</td><td>モリア、フランス</td><td></td><td>顕微手術用ハサミと鉗子</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>コール・パーマー・インスツルメンツ</td><td></td><td>Easyload Masterflex</td></tr><tr><td>マイクロシリンジポンプ装置 (ナノポンプ)</td><td>kdScientific</td><td>KDS310</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカフランス</td><td>CM 1510-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>-80度;C冷凍庫</td><td>Sanyo</td><td></td><td>Ultra Low -80 &deg;C</td></tr><tr><td>国産電子レンジ</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ドライブロックヒーター</td><td>Eppendorf</td><td>022670204</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>インキュベータースライドモート</td><td>Boekel Scientific</td><td>240000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>コプリンジャー</td><td>ドミニクダッ</td><td>チャー68512</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ステンドグラス容器</td><td>Dominique Dutscher</td><td>68506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td>結果セクションで紹介されている画像は、対物レンズ 40X LD NeoFluor N.A 0.6 と 100X PlanApochromat N.A 1.3 を搭載した Zeiss AxioObserver で収集されました。フィルター セット #38、#43、および #43。HXP 120蛍光光源。フォトメトリクスCoolSNAP HQ2 CCDカメラ。信号は、Zeiss AxioImager/AxioObserverシリーズ、Nikon Ti-E/Ni-Eシリーズ、Leica DM/DMI6000シリーズなどの最近の高効率顕微鏡でより簡単に観察できます</td></tr></tbody></table>

蛍光による神経組織の持続的なdnaウイルスのゲノム転写物の検出その場でハイブリダイゼーションは、免疫染色と組み合わせる

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

遺伝子の単一細胞codetectionは、そのRNA産物と細胞調節タンパク質は、遺伝子発現の調節を研究することが重要です。これはウイルス学の分野での課題であり、特に彼らの研究のための動物モデルを伴う核複製永続DNAウイルスのために。単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）は、末梢神経細胞における生涯潜伏感染を確立します。潜伏ウイルスは再活性化し、新たなヘルペスエピソードを誘導するから貯水池として機能する。 HSV-1の潜伏細胞生物は、動物モデルにおけるin situでの HSV-1ゲノムを検出するための方法の欠如のために部分的には、あまり理解のままである。我々のアプローチは、効率的に感染した動物モデルからの神経組織の切片内の低コピーのウイルスゲノムを検出するin situハイブリダイゼーション （FISH） における DNA-蛍光を記載している。この方法は、熱ベースの抗原アンマスキングに依存しており、直接標識自家製DNAプローブ、または市販のプローブ。我々は、トリプルスタイを開発寧のアプローチは、各染色の要件に対応するために、ペルオキシダーゼベースの信号増幅を用いて、RNA-FISH及び免疫蛍光で、DNA-FISHを組み合わせる。主な改善は、共焦点顕微鏡及び広視野落射蛍光によって、従来の高解像度で画像化することができる10μmの組織切片を、低バックグラウンド信号内に、取得する機能である。さらに、三重染色は、細胞およびウイルスタンパク質に対する抗体の広い範囲で働いていた。完全なプロトコルは、組織の中に抗体およびプローブの侵入に対応するために2.5日かかります。

広範なテストの数ヶ月後、私たちは、熱系化学アンマスキングは蛍光in situハイブリダイゼーションのための潜伏HSV-1ゲノムが利用できるようにすることを発見した。プロセスの間に、我々は、様々なマスク解除手続きを試みたが、（ すなわち 、電子レンジでサブ沸騰温度までのセクションを加熱する）だけ熱ベースの治療法は、効率的に見えた。私たちは、その後、定期的に、0.01MのpH6.0のクエン酸緩衝液（我々はすべて我々の研究で使用されていること）、1×PBS、1mMのEDTA、0.1 Mを含むエピトープ31,32を取得するために、免疫組織化学（IHC）および電子顕微鏡で使用されているいくつかの塩緩衝液をテストしたトリス-HCl pH7.4および蒸留水。 EDTAバッファが組織を損傷する傾向がありますが、他のすべてのバッファは、一部に表示されたニューロンの核内の単一または複数のスポットとして表示されたHSV-1の検出、（ 図2A、これらの組織は非常に自動蛍光性であることに注意してください、に適したサイトップでの均質な信号として画像LASM...

我々は、動物モデルの組織切片内の永続的なDNAウイルスゲノムの検出のためのin situハイブリダイゼーションプロトコルにおいて蛍光を確立した。このプロトコルは、ウイルスゲノムのcodetection、そのRNA産物、および単一細胞内のウイルスまたは細胞タンパク質によって感染プロセスを研究できます。

蛍光による神経組織の持続的なDNAウイルスのゲノム転写物の検出その場でハイブリダイゼーションは、免疫染色と組み合わせる

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

この手順の全体的な目的は、潜在感染したマウスの三叉神経節切片において、蛍光in situハイブリダイゼーションにより単純ヘルペスウイルス1型のゲノムを検出することです。まず、動物の唇にウイルスを接種し、その後28日間の潜伏期間を設けてウイルスを三叉神経節に定着させます。次に、三叉神経節を採取して包埋し、凍結切片を作成します。切片に対して、クエン酸ナトリウム緩衝液中での加熱という重要なステップを含む、いくつかの前処理が行われます。最後に、ヘルペス特異的な蛍光プローブを用いて蛍光in situハイブリダイゼーションを実施します。最終的に、共焦点顕微鏡を用いることで、個々に感染したニューロンの核内におけるウイルスゲノムの位置を確認することができます。多くの場合、さまざまなライフサイクルの研究には動物モデルの使用が必要です。ここで提示する手法の主な利点は、in situ ハイブリダイゼーション法を用いて、単一細胞レベルでのデータを提供できる点にあります。HS感染のウサギモデルは、ヒトにおけるHSV-1感染の自然史の大部分を再現しています。それがウイルスの自然宿主です。一次感染は口腔組織で起こり、その後、ウイルスは口唇から三叉神経節へと移行します。そこがヒトにおけるHSV潜伏感染の主要な部位です。免疫染色と染色の2つを組み合わせて解析します。この手法は、ウイルスが核成分とどのように相互作用するか、また、これらの相互作用が潜伏感染の維持や最終的なウイルスの再活性化にどのように影響するかなど、ヘルペスウイルスの潜伏感染に関する重要な疑問を解明するのに役立ちます。まず、麻酔をかけたマウスと、フェノールレッド不含培地で再懸濁したHSV-1ウイルスストック溶液を用意してください。実体顕微鏡を用いて、左上唇の粘膜皮膚境界部の皮下上皮層に針を刺します。ウイルス溶液 0.5 µL を 5 秒かけて注入し、次に同じ部位に 2 回目のウイルス注入を行います。マウスを 37 °C のインキュベーターまたはヒーティングパッドに移し、覚醒するまで保持します。その後、テキストプロトコルに従って灌流固定を行うまで、必要な回復時間の間、ホームケージに戻します。下顎の両側を切開します。次に、切歯のすぐ後ろで鼻端を切断し、鼻腔を露出させます。ハサミで口蓋を半分に切り、脇に除けます。口蓋の下に三叉神経節があります。これらは長さ2〜3 mmの白い楕円形の塊で、三叉神経に接続しています。神経節の両側で三叉神経分枝を切断し、脳幹から切り離します。外科用鉗子を用いて神経節を取り出し、PBSで調製した20%Sucroseに転移させ、24時間インキュベートします。翌日、室温で両方の三叉神経節を単一の凍結切片作成用ブロックに包埋します。包埋剤に入れ、クライオスタットで切片を作成するまでマイナス 80 °C でブロックを凍結させます。三叉神経節を縦方向に 10 µm の厚さで切断し、30 °C に温めた Super Frost スライドガラス上に回収します。1 枚のスライドに 4 〜 5 枚の切片を配置できます。スライドに複数のシリーズラベルを付けることが有用な場合があります。後続のアプリケーションを複数予定している場合は、スライスを5〜10分間乾燥させた後、-80°Cで保存してください。本プロトコルでは、HSV-1ゲノムの30kb断片を含むcosmidを、NIC翻訳によりSI 3D CTPで標識してプローブを調製します。沈殿させ、脱イオンホルムアミドに懸濁させます。1日目のS SI threeの取り込みにより、ピンク色に見えるはずです。スライドを室温でスライドホルダーに置き、切片を10分間乾燥させます。その後、1 XPBSで切片を10分間再水和させます。次に、組織を0.5% Triton X 100含有 1×PBSで20分間透過処理します。その後、スライドを2×XSSで1回10分間、計3回洗浄し、アンマスキングバッファーが加熱されるまで2×XSSCに浸漬しておきます。アンマスキングのため、クエン酸バッファーを電子レンジで沸騰するまで予熱します。これは、ガラススライドトレイに200 millilitersの緩衝液を満たすことで行います。トレイを500 millilitersの蒸留水を入れた大きめの容器に入れ、緩衝液が沸騰するまで予熱します。その後、スライドをトレイに移します。電子レンジ内で、スライドがバッファーに完全に浸っていることを確認します。バッファーが沸騰するまで、約20秒間加熱します。バッファーが沸騰して溢れ出さないように注意してください。その後、スライドを室温で2分間冷却し、加熱サイクルをさらに6回繰り返します。アンマスキング工程の再現性を確保するためには、加熱サイクルの回数と時間を経験的に決定することが極めて重要です。これは、電子レンジ、トレイ、容器、およびトレイ内のバッファー量によって異なります。加熱終了後、容器内の水の量を一定に保ってください。スライドを2回XSSCで5分間処理し（ドラフト内で行う）、その後、メタノール、酢酸、PBSを3:1:4の比率で混合した溶液中で15分間インキュベートします。次に、調製したばかりのメタノールと酢酸の3:1混合液中で15分間インキュベートします。次に、70% ethanolで10分間のインキュベーションを繰り返し、続いて純エタノールで10分間のインキュベーションを2回行い、切片を脱水します。プローブの準備のため、スライドを室温で10分間乾燥させます。乾燥した切片にプローブ溶液を80 µLずつ滴下し、カバーガラスで覆います。プローブ溶液がカバーガラスの全表面に広がり、気泡がないことを確認します。次に、ゴムセメントでカバーガラスを密封し、乾燥させます。スライドを80°Cで5分間インキュベートし、変性させます。次に、スライドを速やかに氷上の金属製トレイに移し、5分間静置します。その後、翌日に37 °Cで一晩ハイブリダイゼーションを行います。37 °Cのヒートブロック上で、ピンセットを用いてゴムセメントを除去します。メス刃の先端を用いて、カバースリップをそっと取り除きます。次に、切片をSSCで繰り返し洗浄します。その後、1 XPBSに溶解した0.5 µg/mLのDAPIやHoechst 33342などの適切な染料を用いて、サンプルを10分間染色します。次に、スライドを1×PBSで10分間ずつ3回洗浄します。3回目の洗浄後、スライドから可能な限り液体を除去します。その後、各スライドの末端に、退色防止剤を含む封入剤を80 µL滴下します。気泡が入らないように注意しながら、高光学品質のカバーグラスでゆっくりと培地を覆います。その後、スライドをマニキュアで封印し、4°Cの暗所で保存します。このプロトコルの開発において、アンマスキングのためにいくつかの塩緩衝液が検討されました。EDTA緩衝液は組織を損傷させる傾向があった。ナトリウムクエン酸トリス、HCl、および蒸留水はHSV 1検出に適しており、市販のプローブを用いて本プロトコルが機能することが確認された。HSV 1潜伏ゲノムの検出は、Enzo Biochemから入手したPAN HSV 1ビオチン化プローブを用いて行い、HSV 1ゲノムのシングルスポットおよびマルチスポットパターンの両方が検出可能であった。さらに、DNA FISHプロトコルを、一般的によく用いられる3種類のHSV-1株に感染させたマウスおよびウサギで検証しました。いずれの場合においても、HSV-1ゲノムは輝度と強度が不均一な斑状のシグナルを示しました。加えて、全身性ヘルペス感染を起こしたマウスの組織に対してDNA FISHを行うことで、HSV-1の複製サイクルにおける本プロトコルの適用性を検証しました。これらの動物において、DRG（後根神経節）、目、脳を含むさまざまな組織に、HSV-1ゲノムの大きく明瞭な凝集体が検出されました。このDNA-FISHプロトコルは非常に汎用性が高く、HSV-1ゲノムと、ウイルスまたは細胞のRNAおよびタンパク質の共検出が可能です。例えば、HSV-1ゲノムとHSV-1 LAT RNAの共検出が可能です。また、Centro MERICタンパク質であるCENP-Aなどの細胞タンパク質を用いたHSV-1ゲノムの共検出や、クロマチンおよびPML核体との共検出も利用されました。関連タンパク質であるATRXは、HSV-1 DNAを赤色、そのRNA産物であるLATを青色、そしてATRXを緑色で示すトリプル染色によって可視化されました。アンマスキングが完了すれば、DNA fishの手順は非常に堅牢です。20枚以上のスライドを1バッチとして、24時間以内に完了させることができます。本技術の開発により、ヘルペスウイルスやその他の持続性ウイルスを研究する研究者は、細胞成分や核構造がこれらのウイルスの生物学にどのように影響するかを、単一細胞レベルで探索することが可能になります。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

その場テトラマー染色やin situハイブリダイゼーション（ISTH）で組み合わせる手法は可視化、マッピングおよび分析、そのウイルスに感染したターゲットへのウイルス特異的CD8 +...

同時にウイルス特異的CD8 + T細胞やウイルス感染細胞を可視化するテクニックその場で</em

蛍光によるウイルスRNAの検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

このビデオでは、MCPyVビリオンに感染した細胞をin situハイブリダイゼーション連鎖反応にかけ、MCPyV特異的なゲノムを検出しました。さらに、DNA-HCR技術をFISHと組み合わせて、感染したヒト皮膚細胞のMCPyV...

HCR-DNA FISH:感染細胞中のウイルスDNAを検出するための蛍光In Situハイブリダイゼーション技術

このビデオは、単純ヘルペスウイルス-1感染における感染細胞タンパク質0、ICP0の輸送を監視する方法を示しています。de...

感染細胞におけるウイルスタンパク質の局在化のための免疫蛍光法

出典:Baleriola, J., et.al.、高解像度In Situハイブリダイゼーションを使用した脳切片における軸索局在mRNAの検出。 J. Vis. Exp. (2015)このビデオは、蛍光in...

蛍光In Situハイブリダイゼーション後のマウス脳切片におけるニューロンの免疫染色

特定の細胞タイプへの遺伝子発現の局在化は、特異的な抗体がないために困難な場合があります。ここでは、ダブル蛍光 RNA in situ ハイブリダイゼーションと免疫染色を組み合わせることにより、遺伝子発現を 3...

ダブル蛍光を組み合わせます<em&gt;その場で</em&gt;マウス脳切片の3遺伝子の発現を検出するための免疫標識とのハイブリダイゼーション

ウイルスの転写工場は、濃縮されている細胞の RNA ポリメラーゼ II は再活性化の中にウイルスの遺伝子の転写を増加する離散構造です。ここでは、積極的に蛍光染色し、その場でRNA の交配の組み合わせによってウイルス クロマチン核の 3 D...

3 D 蛍光顕微鏡を用いたウイルス転写工場の機能イメージング

我々は、その場ハイブリダイゼーション(FISH)における蛍光を利用して、凍結感染したヒト細胞内の複数のヘルペスウイルスRNAを懸濁または付着性のいずれかで可視化するプロトコルについて説明する。このプロトコルは、核細胞質比を産生する蛍光の定量を含み、免疫蛍光(IF)を有する宿主およびウイルスタンパク質の同時可視化のために拡張することができる。...

KSHV感染細胞における特定遺伝子産物の高量蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)と免疫蛍光(IF)における定量蛍光

このプロトコルはmultilabel FISHおよび蛍光性のIHC信号を達成することを目標に、新しい凍結および固定マウス頭脳セクションの蛍光性in situ の交配(魚)および蛍光性のimmunohistochemistry...

マルチプレックス蛍光 In Situ ハイブリダイゼーションと蛍光免疫組織化学の融合による新鮮、凍結、または固定マウスの脳切片の結合(英語)

ここで紹介するのは、蛍光イメージングアプローチのためのプロトコルであり、DNA、RNA、およびpロテイン(MICDDRP)の究極の蛍光immuno蛍光c...

ウイルスの核酸とタンパク質を視覚化し、HIV、HTLV、HBV、HCV、ジカウイルス、インフルエンザ感染を監視するためのシングルセルマルチプレックス蛍光イメージング

学ぶヘルペス単純ウイルス1型ゲノムの蛍光in situハイブリダイゼーション法。三叉神経節切片で潜伏感染を可視化し、個々のニューロン核内のウイルス動態を単細胞レベルで解析する技術です。

蛍光による神経組織の持続的なDNAウイルスのゲノム転写物の検出その場でハイブリダイゼーションは、免疫染色と組み合わせる

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