Name: 脳の小、解剖学的に定義された領域からのDNAメチル化と遺伝子発現の最適化分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: 学ぶ DNAメチル化と遺伝子発現の同時分析法。新生マウスの母親分離による早期ストレス誘導後、脳組織パンチからDNAとRNAを単離し、ビスルファイトシーケンスでエピジェネティック変化を解析します。神経科学と発生生物学の研究に応用可能です。

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この作品は、精神医学のマックスプランク研究所と欧州連合（EU）のマリー·キュリー初期研修ネットワーク（NINA契約238665）によって資金を供給された。

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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

エピジェネティックなプログラミングがますます重要なメカニズムの基礎となる健康と病気として認識されています。ここでは、micropunchesと亜硫酸塩シークエンシングによってDNAメチル化プロファイルを取得するために後続の手順からDNAとRNAの同時分離のための洗練された手法を提案する。最適化されたワークフローは、環境刺激に応答して、脳内のエピジェネティックなプログラミングの便利な分析を行うことができます。また、このアプローチは、両方が同じサンプルから分析されるDNAメチル化と遺伝子発現との間の関数関係の調査を容易にします。最後に、実験に必要な動物数を大幅に削減できます。 提示したワークフローを実行中に特定の注意事項およびガイドラインに従う必要があります。メチル化と発現パターンは細胞および組織特異的に変わることがありますので、特別な複雑さと脳の異質性を考慮し、それが最高のものですmicropunchingが標準化された方法で行われることの重要性。ポイントのケースとして、AVPのエピジェネティックなプログラミングがparavaventriuclarではなく、視索上核（ 図4b-d）は、視床下部4の2 AVP発現している地域で検出されます。この点では、同じ組織のパンチからDNAとRNAの可用性は、RNAの特定の組織特異的なマーカー遺伝子の発現を正しい領域がパンチされたことを証明するいくつかのケースで使用することができるように有利である。 micropunchingは、細胞の不均質性を減らすことができますが、このアプローチは、単一の細胞型または集団の分離につながるものではないことを覚えなければなりません。追加の精製工程は、このトピックに対処するために考えられるかもしれません。 亜硫酸塩は亜硫酸水素塩処理後のPCR増幅のための最適なプライマー設計をシークエンシングのために不可欠です。長さは400 bpを超えるPCR産物はbでDNAの分解に起因する問題が発生することができisulfite処理。また、わずかそのままテンプレートには、増幅過程に寄与する場合は、入れ子になったPCRは、偏った結果を与えることができることに留意すべきである。変更されたアンプリコンに特異的なプライマーペアを設計する必要があります。その配列はメチル化バイアスの増幅を避けるために、CpGジヌクレオチドを​​含むべきではありません。さらに、プライマーは修飾されていない、または不完全に変換されたDNAの増幅を防ぐために、非CpGのシトシンを含める必要があります。いくつかのテンプレートの増幅にはホットスタートPCRを実施して恩恵を受ける可能性があります。貴重な実験試料の損傷を防止するためにどのような場合には、プライマーペアの適合性は、パイロット実験で検証する必要があります。 それが確実かつ正確にアレル特異的に8つのCpGの残基のメチル化を検出することができるように亜硫酸シークエンシングは、サイト固有のメチル化解析のための標準的な方法を表しています。 PCR産物のダイレクトシークエンシングは、混合メチル化Oとしてお勧めできませんFA化CpG残基は、当該サイトでのメチル化の定量化を防ぐことができる電気泳動におけるC / T、ダブルピークとして表示されます。この理由のために中間のクローニングステップが行われ、いくつかのクローンを配列決定されている（〜20から30）メチル化の程度を決定する。パイロシーケンシングではDNAメチル化を定量化するための代替メソッドを表します。また、亜硫酸水素塩変換と亜硫酸PCRではなく、クローニングおよびアンプリコンは、CpGの残基のメチル化状態を容易に定量化することができるC / Tの一塩基多型として読まれ、直接パイロシークエンシング反応に供されているシーケンスを利用しています。どちらの方法でも、メチル化9の類似のレベルを検出するがクローニングステップを省略することができるので、パイロシーケンシングでは、より多くの時間が効率的です。ただし、テンプレートに応じてのみ40から100ヌクレオチドが異なるシークエンスプライマーを用いてパイロシーケンシングのいくつかのラウンドが必要であるように一度配列を決定することができます。これは、股関節を考えると、重要な制限事項です。DNAのtより高い量（反応当たり約1μg）を小さな脳組織のパンチから利用可能額を超える予見され、必要とされています。したがって、パイロシーケンシングで数キロの範囲内の領域の最初のスキャンは、単一のクローンの読みとしてはあまり適して表示されます。それにもかかわらず、金利のパイロシーケンシングの小さな領域の識別に以下を考慮する必要があります。 総称して、上記のプロトコルは、エピジェネティックな変化の脳micropunchesの迅速かつ費用対効果分析のために、正確に効率的かつ合理的なアプローチを提供します。複数の標本は、単一の実行で処理し、中間サイズの実験からのサンプルを実行するときの方法が適していることができます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> DNeasy血液·組織キット</td><td>キアゲン</td><td> 69506 </td></tr><tr><td> Nucleospin RNA II </td><td>マシュレ·ナーゲル</td><td> 740955.50 </td></tr><tr><td>亜硫酸キットのプロトコールとトラブルシューティング</td><td>キアゲン</td><td> 59104 </td></tr><tr><td> Nucleospinエキス</td><td>マシュレ·ナーゲル</td><td> 740609.50 </td></tr><tr><td> pGEM-Tベクタークローニングキット</td><td>プロメガ</td><td> A3600 </td></tr><tr><td> Nucleofast 96 </td><td>マシュレ·ナーゲル</td><td> 743100.50 </td></tr><tr><td>モンタージュ96シーケンスのクリーンアップ</td><td>ミリポア</td><td> LSK09624 </td></tr><tr><td> Hotstar Taqポリメラーゼ</td><td>キアゲン</td><td> 203203 </td></tr><tr><td> Taqポリメラーゼ</td><td> Fermentas </td><td> EP0401 </td></tr></tbody></table>

脳の小、解剖学的に定義された領域からのdnaメチル化と遺伝子発現の最適化分析

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

食事療法への曝露は、人生の1,2の敏感な窓の間に薬剤および初期生活逆境は、生理学的および行動表現型のディスプレイに寄与する遺伝子発現の持続的な変化につながる可能性があります。そのような環境のプログラミングは、代謝、心血管疾患および精神疾患3,4に対する感受性を増加させる可能性があります。 DNAメチル化とヒストン修飾は、遺伝子と環境の対話の仲介に主要なプロセスを考慮し、環境のプログラミング5アンダーレイにも表示されています。哺乳類では、DNAメチル化は通常CpGジヌクレオチドのコンテキスト内でのシトシンの5位のメチル基の共有結合的付加を有する。 CpGメチル化は細胞の不均質性が高く、組織の量が制限され、脳の離散的な、小さな領域を研究するために挑戦すること非常に組織および細胞特異的に発生します。また、Because遺伝子発現とメチル化が密接にリンクされているイベントは、増加値は、同じサンプルで両方のパラメータを比較することによって得ることができる。 ここでは、脳内のエピジェネティックなプログラミングの調査のためのステップバイステップのプロトコル（ 図1）は 、例示目的のために初期生活逆境の&quot;母子分離&quot;パラダイムを使用して提示されます。プロトコルは、このように、同じサンプル中のDNAメチル化と遺伝子発現解析を可能にする、DNAおよびRNAを同時に分離することができ、そこから差動高齢マウスの脳からmicropunchesの準備について説明します。

初期生活ストレスにDNAメチル化と遺伝子発現の変化を研究するために合理化されたワークフローが表示されます。新生児マウスと離散の脳組織の分離の母子分離から始めて、我々は同時に、その後の重亜硫酸塩シークエンシングおよびRT-PCR解析のための脳組織のパンチからDNAとRNAを単離するためのプロトコルを表します。

脳の小、解剖学的に定義された領域からのDNAメチル化と遺伝子発現の最適化分析

人生の感受性期における食事、薬剤、および早期生命ストレスへの曝露は、～に寄与する遺伝子発現の永続的な変化をもたらす可能性がある。

本手順の全体的な目的は、乳幼児期ストレスによるDNAメチル化および遺伝子発現の変化を研究することです。これは、まず新生仔マウスを母子分離にさらし、乳幼児期ストレスを誘発させ、次に、関心領域である脳のPVNをin locoマイクロダイセクションにより採取し、単一の組織パンチからDNAとRNAを同時に単離することによって達成されます。次に、得られたDNAを亜硫酸塩処理し、目的領域をビスルファイトPCRで増幅させます。これをその後、ベクターにライゲーションし、細菌に形質転換させます。形質転換の成否は、マーカーの発現およびPCRフラグメントのサイズによって確認します。最後に、メチル化状態を評価するためにバイサルファイトシーケンシングを用います。このワークフローの主な利点は、環境刺激に応答したエピジェネティックなプログラミングを簡便に解析できることです。この手法により、幼少期の逆境によるエピジェネティックなプログラミングに関する知見を得ることができます。本手法は他のシステムにも適用可能です。メチル化と遺伝子発現が高度に組織特異的な環境で分析される場合や、組織の利用可能性が限られている場合に有効です。早期生命ストレスを誘発するため、妊娠日数を管理したC 57 black six Nの母マウスの子マウスに対して、母子分離を実施します。生後1日から10日まで、各リターを1日3時間、加熱された清潔なケージに移します。ストレスを与えないコントロール群の幼マウスはそのままにしておきます。この3時間の分離を除き、すべてのリターは生後21日の離乳まで母親と一緒に飼育します。その後、幼マウスを標準的な飼育条件下で、1ケージあたり3〜5匹の性別を合わせたグループで飼育します。脳組織の回収を開始するため、マウスの脳を頭蓋骨から取り出し、直ちにドライアイスで急冷し、-80°Cで保存します。組織パンチを採取する準備ができたら、-80°Cのフリーザーから脳を取り出し、ドライアイスの上に置きます。まず、脳を吻側から尾側に向かって10 µmの厚さで冠状断に凍結切片作成します。切片をSuperFrostガラススライドにマウントし、クリスタルバイオレット染色のために乾燥させます。追加の切片を作成し、in situ ハイブリダイゼーションなどのさらなる解析のために-20°Cで保存することができます。パンチ準備が整ったら、目的の脳構造を特定するためにスライドをクリスタルバイオレットで染色します。次に、パンチ針を用い、in loco マイクロダイセクションにより目的領域から0.8 mmのパンチを採取します。パンチ試料は−80°Cで保存してください。遺伝子発現およびメチル化は組織特異性が非常に高いため、マイクロパンチを標準化された方法で実施することが極めて重要です。ピペットを用いて、400 µLのチオシアネート緩液中でパンチ試料を均質化し、室温でボルテックスしてください。次に、得られた溶出液を29ゲージの注射器に通します。これを数回繰り返し、組織片が見えなくなるまで行います。その後、溶出液を等分に分割します。一つはRNAの処理用で、こちらを先に行う必要があります。もう一つはDNAの処理用で、RNAの処理が終わるまで室温で保存可能です。RNA精製のために、1/10量の酢酸ナトリウム、1量のAqua Phenol、および1/2量のクロロホルム:イソアミルアルコール（24:1）を加え、ボルテックスします。各試薬の添加後に混合液を激しく攪拌し、最終的な混合液を氷上で10分間インキュベートします。その後、混合液を遠心分離します。水相を回収し、同量の70% ethanolを加えます。RNAスピンカラムキットを用い、カラム上でDNA消化を行い、洗浄後、25 µLの水でRNAを溶出させます。次に、RNase消化の工程を追加し、溶出バッファーと溶出カラムを使用前に70 °Cに温めるよう変更したキットプロトコルを用いて、DNAを精製します。カラムについては、70 °Cで10分間温めれば十分です。最後に、分光光度計を用いてDNAおよびRNAの濃度を測定します。典型的なPVNパンチからは、約600 nanogramsのDNAと約400 nanogramsのRNAが得られます。そのうち、約100 nanogramsのRNAは、バイサルファイト処理による増幅前の定量PCRによる遺伝子発現解析用に別途確保します。単離したDNA 200 nanogramsを市販のキットで処理し、メチル化領域からDNAを増幅させます。バイサルファイト変換後のDNA用に特異的に設計されたプライマーを注文してください。バイサルファイトPCRにおける最適なプライマー設計は不可欠です。なぜなら、PCRアンプリコンの品質と特異性が、以降のステップの成否を決定するためです。プライマーが届いたら、予備実験を行って最適温度とアニーリング温度を決定します。25 µLのPCR混合液1反応あたり、テンプレートとして2 µLの重亜硫酸塩処理済みDNAを使用してください。混合液を、95 °Cでの6分間の変性から始め、45〜50回の増幅サイクルを行い、最後に72 °Cで5分間の伸長反応させて増幅します。PCR産物7 µLをアガロースゲル電気泳動で解析し、アンプリコンのサイズを確認します。残りのPCR産物は、市販のPCR精製キットを用いて、次工程のライゲーションのために精製します。目的外のPCR産物が得られた場合は、ゲル精製を用いて本プロトコルの目的産物を単離してください。ここでは市販のクローニングキットを使用します。クローニング効率は、インサートに大きく依存します。したがって、組換えクローンの得られる数が繰り返し少なくなった場合は、別のクローニングベクターを試してください。ベクター 1 µL と精製済み PCR 産物 3 µL を用いて、10 µL のライゲーション反応液を調製します。ピペッティングにより反応液を混合し、4 °C で一晩インキュベートした後、翌日に処理を行います。古典的なエタノール沈殿によりライゲーション反応液を精製し、得られた産物を細菌に形質転換させます。パルス電撃法の直後に、あらかじめ温めておいたSOB培地を1 mL直接加え、形質転換した細菌を反応チューブに移します。37 °Cで1時間細菌を回復させた後、各懸濁液 100 µLをIPTGを含むLBアンピシリンプレートに塗布します。プレートを一晩インキュベートし、コロニーをピックアップ可能な状態にします。96ウェルプレートを用いて25 µLのコロニーPCR反応系を構築し、各反応に3 µLの2.5 mM塩化マグネシウムを加えます。白色のポジティブクローンをピペットチップでピックアップし、軽く浸すことでPCRミックスに転移させます。まず、4分間の融解サイクルでPCRを開始します。続いて、アニーリング温度を56 °Cとして10回の増幅サイクルを行います。これらのサイクルの各ステップは30秒間です。次に、アニーリング温度を48 °Cに下げ、さらに30サイクルの増幅を行います。最後に、5分間の伸長サイクルで終了します。各産物を5 µLずつアガロースゲルに電気泳動し、適切なサイズのインサートが含まれている反応を特定します。市販のキットを使用して目的のPCR産物を精製し、BigDye Terminatorサイクルシーケンシングによる解析が可能な状態にします。96ウェルプレートの各ウェルに、3 µLのBigDye反応マスターミックスを分注し、続いて2 µLの精製済みコロニーPCR産物を加えます。サーモサイクラーを用いて、96 °Cで1分間の初期変性を行い、その後、96 °Cで10秒、50 °Cで5秒、60 °Cで4分間の工程を35サイクル繰り返して反応させます。bisulfite反応の終了後、bisulfite精製プレートを用いて反応液を精製します。配列を得た後、オンラインのbisulfiteアナライザーまたはBISM-Aツールを用いて解析し、調査対象となるDNA領域のメチル化パターンを導き出すことで、人生早期ストレス（ELS）がavpの発現およびメチル化状態に与える影響についての知見を得ます。C57BL/6マウスを記載のプロトコルに従って処理し、室傍核および視上核をパンチで採取してDNAを単離しました。DNAを重亜硫酸塩処理し、avpエンハンサー特異的なプライマーを用いて増幅させ、PCR産物をクローニングし、マウス1匹あたり少なくとも20個の組換えクローンをシーケンシングしました。PCR産物を解析し、組織に含まれるPCRアンプリコン内のCPGのメチル化頻度を決定した。P-V-N-E-L-Sは、AVPエンハンサー上の4箇所で有意な低メチル化を誘導しており、これは生命早期の経験を通じてこの調節領域にエピジェネティックな標識が付与されることを示唆している。PVNとは対照的に、SONにおけるAVPエンハンサーのメチル化はELSの影響を受けておらず、エピジェネティックな影響の組織特異性が示された。対照動物において、CPG 10のDNAメチル化状態はAVP遺伝子発現と負の相関を示しており、AVP遺伝子発現の微調整におけるDNAメチル化の役割が示唆された。この手順の後、解析した組織における遺伝子発現の変化などの追加的な疑問を解決するために、単離したRNAを用いてUPCRなどの他の手法を容易に実施することができる。このビデオを視聴することで、環境や経験依存的な刺激に対するDNAメチル化の変化を研究する方法について、十分に理解することができます。

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