脳の小、解剖学的に定義された領域からのDNAメチル化と遺伝子発現の最適化分析

この手順の全体的な目標は、DNAを研究することです。メチル化と遺伝子発現は、幼少期のストレスによって変化します。これは、最初に新生児マウスの子犬を母親の分離にさらして、ここで関心のある脳の第二段階の領域として初期のストレスを誘発することによって達成され、PVNはロコマイクロ解剖によって得られ、DNAとRNAは単一の組織パンチから同時に分離されます。

次に、得られたDNAを亜硫酸塩処理し、目的領域を重亜硫酸塩PCRにより増幅する。次に、これをベクターにライゲーションし、バクテリアに変換します。形質転換の成功は、マーカーの発現とPCRフラグメントサイズによって識別されます。

そして最後に、ビスサルフィドシーケンシングを使用してメチル化状態を評価します。このワークフローの主な利点は、環境刺激に応答したエピジェネティックプログラミングを簡便に解析できることです。この方法は、幼少期の逆境によるエピジェネティックプログラミングへの洞察を提供することができます。

また、他のシステムにも適用できます。メチル化と遺伝子発現が高度に組織特異的な環境で分析される場所や、組織の利用可能性が限られている場所では、幼少期のストレスを誘発します。母体の分離は、母体の分離に影響を与えるために、時限妊娠したC 57ブラックシックスNダムの子犬に対して行われます。

生後1日目から10日目まで毎日3時間、各子砂を加熱された清潔なケージに移し、ストレスのないコントロールの子犬を邪魔しないようにします。3時間の分離を除いて、すべての同腹児は生後21日目に離乳するまで母親と一緒に残されます。その後、子犬は性別が一致したグループに収容され、標準的な飼育条件下でケージごとに3〜5匹のマウスが脳組織の収集を開始し、マウスの脳は頭蓋骨から取り除かれ、すぐにアイソップドライアイスで凍結され、摂氏マイナス80度で保存されます。

ティッシュパンチを収集する準備ができたら、マイナス80度の冷凍庫から脳を取り出し、ドライアイスの上に置きます。脳を吻側から抱きかかえまで10ミクロンの冠状切片に凍結切片することから始めます。セクションをスーパーフロストスライドガラスに取り付け、クレストバイオレット染色のために乾燥させます。

追加のスライドをマイナス20度で撮影して保存し、in situ 2ハイブリダイゼーションなどのさらなる分析を行うことができます。パンチを打つ準備ができたら、スライドをクレスタルバイオレットで染色して、目的の脳構造を特定します。次に、パンチングニードルを使用して、ロコマイクロダイセクションを使用して関心領域の0.8ミリメートルパンチを取ります。

パンチはマイナス80°Cで保管してください。遺伝子発現とメチル化は組織特異的なものであるため、マイクロパンチングを標準化された方法で行うことは非常に重要です。ピペットを使用して400マイクロリットルのチオシアン酸カジウム緩衝液でパンチを均質化し、室温でボルテックスします。

次に、得られたライセートを29ゲージのシリンジに通します。パンチが何度か見えなくなるはずです。ライセートを等分します。

1つはRNAを処理するために、これは最初に行われるべきであり、もう1つはDNAを処理するために、RNAがRNA精製のために処理されるまで室温で保存することができます10分の1容量の酢酸ナトリウム、1容量のアクアフェノール、および24の半分の容量から1つのクロロホルムからイソアミルAMLボルテックスまで。混合物は、各添加後に激しく行われ、最終的な調合物を氷上で10分間インキュベートします。次に、混合物を遠心分離します。

水相を収集し、等量の70%エタノールをそれに加えます。RNAスピンカラムキットを使用。オンカラムDNAの消化を行い、25マイクロリットルの水でRNAを洗浄溶出します。

次に、RN aの消化を添加するように修正したキットプロトコルを使用してDNAを精製し、elucianバッファーとelucianカラムを使用する前に摂氏70度まで温めます。カラムには摂氏70度で10分で十分です。最後に、分光光度計を使用してDNAとRNAの濃度を測定します。

典型的なPVNパンチは、約600ナノグラムのDNAと約400ナノグラムのRAを取っておき、亜硫酸塩による増幅前の定量的PCRによる遺伝子発現解析のために約100ナノグラムのRNAを採取する。単離されたDNAの200ナノグラムを市販のキットで処理し、メチル化領域からDNAを増幅します。バイサルファイト変換DNA用に特別に設計されたプライマーを注文する PCRアンプリコンの品質と特異性が次のステップの成功を決定するため、bi PCRにおける最適なプライマー設計は不可欠です。

プライマーが到着したら、パイロット実験で最適なひざまずく温度を決定します。25マイクロリットルごとに2マイクロリットルの亜硫酸ビス処理DNAをテンプレートとして使用します。PCR混合物。

95°Cで6分間の変性から始めて混合物を増幅し、続いて45〜50回の増幅サイクルを経て、72°Cで最後の5分間の伸長を行います。7マイクロリットルのPCR産物をAgrosゲル電気泳動で分析し、アンプリコンのサイズを確認します。市販のPCRクリーンアップキットを使用して、その後のライゲーションのために残りのPCR産物を精製します。

望ましくないPCR産物が得られた場合は、ゲル精製を使用して、このプロトコルに関心のある製品を単離します。市販のクローニングキットが採用されています。クローニング効率はインサートに大きく依存します。

したがって、繰り返し得られる組換えクローンの数が少ない場合は、別のクローニングベクターを試してください。10 マイクロリットルのライゲーション反応を、1 マイクロリットルのベクターと 3 マイクロリットルのクリーンアップされた PCR 産物でセットアップします。ピペッティングで反応を混合し、翌日4°Cで一晩インキュベートします。

古典的なエタノール沈殿によってライゲーション反応をクリーンアップし、生成物で細菌を形質転換します。パルス送達の直後に1ミリリットルの予温SOB培地を加え、形質転換した細菌を反応チューブに移します。摂氏37度で1時間細菌を回収した後、IPTGでコーティングしたLBアンピシリンプレートに各懸濁液100マイクロリットルを広げます。

Xalは、コロニーを摘出できるようになったら、プレートを一晩インキュベートします。各反応で 3 マイクロリットルの 2.5 ミリモル塩化マグネシウムを使用して、96 ウェルプレートに 25 マイクロリットルのコロニー PCR 反応を設定します。ピペットチップで陽性の白色クローンを選別し、簡単なディップでPCRミックスに移します。

PCRは4分間の融解サイクルで開始します。これに続いて、摂氏56度のリング温度で10回の増幅サイクルを行います。これらのサイクルの各ステップは 30 秒です。

次に、イーリング温度を摂氏48度に下げて、さらに30回の増幅サイクルを行います。5分間の伸びサイクルで仕上げます。次に、各製品の5マイクロリットルをarosゲルにロードし、適切なサイズのインサートを含む反応を特定します。

市販のキットを使用して目的のPCR産物をクリーンアップし、ビッグ色素ターミネーターサイクリングシーケンシングを使用してシーケンシングできるようにします。96ウェルプレートに、3マイクロリットルの大きなDI反応マスターミックスと、2マイクロリットルのクリーンアップされたコロニーPCR産物が入ったウェルをロードします。サーモサイクラーで96°Cの1分間から反応を始め、96°Cで10秒、50°Cで5秒、60°Cで4分間の35サイクル

ビッグダイの反応が終わったら、ビッグダイの精製プレートで反応をクリーンアップします。配列を取得した後、オンラインのビッグアナライザーまたはB-I-S-M-Aツールを使用して分析し、調査したDNA領域のメチル化パターンを導き出し、VP発現とメチル化状態に対する幼少期のストレスまたはELSの影響についての洞察を得ます。C 57ブラックスティックおよびマウスを記載のプロトコルに従って処理し、傍心室核および視索上核をパンチしてDNAを単離し、R-N-A-D-N-Aを重亜硫酸塩処理し、a VPエンハンサーに特異的なプライマーで増幅し、PCR産物をクローニングし、各マウスから少なくとも20個の組換えクローンをクローニングおよびシーケンシングした。

PCRを分析して、P-V-N-E-L-Sの組織中のPCRアンプリコンに含まれるCPGのメチル化頻度を決定し、A VPエンハンサーの4つの場所で有意な低メチル化を誘発し、幼少期の経験を通じてこの調節領域にエピジェネティックなマーキングをしたことを示唆しています。対照動物におけるエピジェネティック効果の組織特異性を示すSONにおけるSONにおけるELSによる影響を受けなかったA VPエンハンサーのPVNメチル化とは対照的に、CPG 10におけるDNAメチル化状態はVP遺伝子発現と負の相関を示し、VP遺伝子発現の微調整におけるDNAメチル化の役割を示している。この手順に従うと、単離されたRNAに対してUPCRなどの他の方法を容易に実行して、分析された組織の遺伝子発現変化などの追加の質問に答えることができます。

このビデオを見れば、環境刺激や経験した依存性刺激に対するDNAメチル化の変化を研究する方法についてよく理解できるはずです。