DNAメチル化のバイオインフォマティクス分析へのサンプル調製:肥満および関連形質研究の関連戦略
2022年5月6日
本研究では、マイクロアレイ技術によって得られたDNAメチル化データを管理するワークフローについて説明する。このプロトコルは、サンプル調製からデータ分析までの手順を示しています。すべての手順が詳細に説明されており、ビデオは重要な手順を示しています。
大規模なオミックス技術は、肥満に焦点を当てた研究でますます使用されています。エピジェネティクスは、曝露と健康転帰との間のリンクであり得る。このタイプのスタディでは、膨大な量のデータが生成されます。
このため、データを技術的に比較可能にするためにプロトコルを標準化することが重要です。本研究では、DNAメチル化データを取得・解析するためのパイプラインを提案します。同じプロトコルを400Kバージョンとエピックバージョンの両方に適用できます。
1日目:亜硫酸水素塩治療。ゲノムDNAを変性させることから始めて、次に変換試薬を加える。キットの推奨事項に従う必要があります。
変性DNAをビスリン酸で処理する。その後、サンプルをサーマルサイクラーでインキュベートします。洗浄バッファーを用いて洗浄工程を行う。
2日目:メチル化アッセイに続く増幅、手動プロトコール。ハイブリダイゼーションオーブンを摂氏37度で予熱し、温度を平衡化させる。20マイクロリットルのMA1をプレートのウェルに分散させる。
4マイクロリットルのDNAをプレート上の対応するウェルに移す。4マイクロリットルの水酸化ナトリウム溶液をプレートウェルに分散させる。プレートをプラスチックシールでシールします。
プレートを渦巻き、試薬とサンプルを混合します。室温で10分間インキュベートする。68マイクロリットルのRPMを各ウェルに分散させ、次いで、以前の溶液を除去することなく75マイクロリットルのMSMを分散させる。
プレートを覆うために新しいシールを使用してください。プレートを1分間渦巻きます。ハイブリダイゼーションオーブン中で、摂氏37度で20〜24時間インキュベートする。
3日目:メチル化アッセイに続くハイブリダイゼーション、手動プロトコール。プレートを摂氏 37 度に挿入してブロックを予熱します。プレートをハイブリダイゼーションオーブンから慎重に取り出します。
プレートをパルス遠心分離機で遠心分離します。プレートからシールを外します。各サンプル容器に50マイクロリットルのFMSを加える。
プレートを1分間渦巻きます。プレートに必要な遠心分離機。その後、密閉板を37°Cの加熱ブロック上に1時間置きます。
サンプルを含む各ウェルに100マイクロリットルのPM1を加える。プレートをもう一度封印します。プレートを1分間渦巻きます。
摂氏37度で5分間インキュベートする。次いで、遠心分離機中で1分間パルスし、次いで、300マイクロリットルの100%2−プロパノールをサンプルと共に各ウェルに加える。プレートをもう一度封印します。
プレートを少なくとも10回反転させてすべての内容物を混ぜる。摂氏4度で30分間インキュベートし、次に摂氏4度で20分間遠心分離します。プレートからシールを外します。
プレートを適切な場所に素早く反転させ、上清を捨てる。すべての井戸に液体がないことに気付くまで、数回しっかりとタップします。室温で、プレートを逆さまにして1時間覆い隠します。
すべての液体を乾燥させた後、井戸の底に青いパレットを見る必要があります。その後、各ウェルに46マイクロリットルのRA1を加える。ヒートシールをプレートに塗布します。
しっかりと保持して、シーリングを均等に実行します。プレートを摂氏48度のハイブリダイゼーションオーブンに1時間入れ、その後ボルテックスを1分間置いた。遠心分離機でパルスし、プレートを摂氏95度で1時間加熱する。
ビーズチップハイブチャンバーを一緒に準備します。この次のステップでは、400マイクロリットルのPB2をHybチャンバー内のリザーバに分散させます。HybチャンバーのリザーバをPB2で満たした後、すぐに蓋をします。
プレートからマイクロアレイのサンプルエントリに各サンプルを慎重にロードします。マイクロアレイを含むHybチャンバーインサートをHybチャンバーにロードします。ハイブチャンバーを横方向に閉じて、ハイブチャンバーがずれないようにします。
4日目:メチル化アッセイに続く染色、手動プロトコール。夜間インキュベーション後、インサートからすべてのマイクロアレイを除去する。マイクロアレイをゆっくりと軽く、合計10回、上下に洗浄する。
マイクロアレイをPB1容器番号2に移動し、上下に10回繰り返す。フローチャンバーのフレームを正しい位置に配置し、次に各マイクロアレイを配置します。それぞれの上部に透明なスペーサーを使用します。
位置合わせバーは、位置合わせアクセサリに配置する必要があります。ガラス製のバックプレートをスペーサーの上に配置する必要があります。次に、フローチャンバに金属クランプを取り付けます。
はさみを使用して、フローチャンバースペーサーの端をトリミングします。マイクロアレイ付きのフローチャンバーをチャンバーラックに入れます。RA1のピペット150マイクロリットル。
30分間インキュベートし、5回繰り返す。450マイクロリットルのXC1をピペットで、10分間インキュベートした。450マイクロリットルのXC2をピペットに入れ、10分間インキュベートした。
TEMのピペット200マイクロリットル。15分間インキュベートする。95%ホルムアミドのピペット450マイクロリットル。
1分間インキュベートし、2回繰り返す。5分間インキュベートする。XC3のピペット450マイクロリットル。
1分間インキュベートして繰り返します。このステップでは、以下の試薬、250マイクロリットルのSTM、450マイクロリットルのXC3、および250マイクロリットルのATMを分注する。次の繰り返しスキームを実行します。
すべての繰り返しとインキュベーションの後、マイクロアレイをスタンディングラックに置き、洗浄容器に浸します。上下の動きでゆっくりと軽く動く、10回。真空デシケーターを使用してマイクロアレイを50~55分間乾燥させます。
マイクロアレイが乾燥したら、スキャンでマイクロアレイのイメージングに進みます。この画像では、参加者の選択からメチル化実験の最終日に取得したIDATファイルの処理まで、使用されているすべてのプロトコルを見ることができます。ファイルは、バイオインフォマティクス分析が実行されたコンピュータに転送された。
分析は、R StudioおよびバイオコンダクターChAMPパッケージを使用して処理した。コンピュータに少なくとも8ギガバイトのRAMがあることを確認してください。遺伝子濃縮などの他のバイオインフォマティクス解析は、データを読者により良く提示するために実施された。
この表では、この研究で使用された2つのグループ、肥満と非肥満を観察することができます。変数、ボディマス指数、腹囲、キログラム単位の脂肪量、およびパーセント単位の脂肪量のグループ間に差があった。この図に示されているスキームを観察して、提案されたプロトコルがデータに適切であることを理解することができました。
そしてバイオインフォマティクス分析の後、フィルターが実行された後、合計409、887個のプローブが提示された。密度プロットは、すべてのサンプルがベータ分布の密度が類似していることを明らかにしました。これらの分析に基づいて除外されたサンプルはなかった。
正規化されたデータの特異値分解解析により、BMI、ダブルC、およびFMがDNAメチル化データの変動性に有意に影響することが明らかになった。細胞型推定により、ナチュラルキラー細胞、NK細胞、B細胞の両方が肥満女性で高いことが明らかになった。肥満女性と非肥満女性との間のDNAメチル化レベルは、細胞型補正の前後で異なっていた。
補正前に、43、463の異なるメチル化位置が観察された。その後も、3,329のCPGが有意に残った。合計162個のCPGが低メチル化され、576個が非肥満と比較して肥満において高メチル化されていた。
データは、登録コードGSE166611の下でGEOデータベースで利用可能です。我々は、SVDで観察された参加者の特定の特性と関連していたCPGサイトを提示する。脂肪量については、13、222のCPGサイトが見つかった。
プロモーター領域には6,159個の脂肪量関連CPGがあった。470は低メチル化され、94は高メチル化される。関連部位のそれぞれの遺伝子が富化され、現在示されている。
私たちは、提案されたプロトコルがあなたのメチル化パターン内を識別することができ、あなたのメチル化内に関連することは正しいことを観察しました。我々の結果は、肥満のライフスタイルがヒトDNAのエピジェネティックな変化を促進することができることを確認しています。
概要
この研究は、マイクロアレイ技術を通じて得られたDNAメチル化データの管理のための詳細なワークフローを提示します。サンプル準備からデータ分析までの全プロセスを概説し、技術的な比較可能性のためにプロトコルが標準化されていることを確認します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- エピジェネティクス
- DNAメチル化
- マイクロアレイ技術
背景
- 大規模なオミクス技術は肥満研究でますます使用されています。
- エピジェネティクスは暴露と健康結果を結びつける可能性があります。
- データの比較可能性には標準化されたプロトコルが不可欠です。
- この研究はDNAメチル化データ分析のためのパイプラインを提案します。
研究目的
- DNAメチル化分析のための標準化されたプロトコルを開発すること。
- サンプル準備からデータ分析までのワークフローを示すこと。
- 大規模データセットの技術的な比較可能性を確保すること。
使用された方法
- ゲノムDNAのビスルフィート処理。
- メチル化アッセイの増幅およびハイブリダイゼーションプロトコル。
- マイクロアレイの染色とイメージング。
- R StudioとBioconductor ChAMPパッケージを使用したバイオインフォマティクス分析。
主な結果
- DNAメチル化分析のための4日間のプロトコルの成功的な実装。
- 標準化された手順により再現可能な結果が可能。
- データ分析により肥満と非肥満グループ間の違いが明らかに。
- バイオインフォマティクスツールにより遺伝子濃縮に関する洞察が提供。
結論
- 提案されたワークフローはDNAメチル化研究の信頼性を高めます。
- 標準化はエピジェネティック研究における大規模データセットの比較に不可欠です。
- 将来の研究はこのプロトコルを基に肥満と健康結果に関するさらなる洞察を得ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Standardized DNA methylation protocols enable reliable detection of epigenetic changes linked to obesity, supporting target validation in metabolic disease research. The workflow provides quantitative, reproducible data for de-risking hypotheses about adipogenesis and lipid storage mechanisms. This positions the method as a scalable tool for early discovery and biomarker alignment in preclinical obesity programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Identifies differentially methylated CpG sites in promoter regions associated with fat mass, enabling interrogation of therapeutic hypotheses in obesity pathways.
- Operational Value: Provides a validated pipeline from bisulfite treatment to bioinformatic analysis, ensuring technical comparability across sample groups.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates genome-wide methylation data (409,887 probes post-filter) suitable for assay development targeting epigenetic regulators of adipogenesis.
- Operational Value: Standardized staining and imaging steps produce consistent microarray outputs, supporting scalable screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links methylation changes in RUNX, WNT, and hypoxia pathways to obesity-related traits, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Enables cross-functional comparison of obese vs. non-obese profiles, informing risk-adjusted advancement decisions in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology through hypothesis-driven epigenetic profiling, connects to screening via standardized microarray preparation, and supports translational research through pathway enrichment analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by identifying methylation variability influenced by BMI, fat mass, and cell type composition.
- Screening: Ensures assay readiness through reproducible hybridization and staining protocols applicable to 400K and EPIC arrays.
- Analytics: Enables quantitative comparison via beta-value distribution and SVD-adjusted CpG filtering, highlighting 3,329 significant sites post-correction.
- Translational Research: Connects methylation patterns to insulin secretion and glucagon signaling pathways, aligning with metabolic disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: The four-day workflow is designed as a reusable capability for epigenetic studies across metabolic and obesity-related indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking obesogenic lifestyle to specific epigenetic changes in human DNA.
- Operational Value: Standardized protocol minimizes technical variability, enhancing reproducibility across sites and batches.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing epigenetically stratified patient data for target prioritization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement through methylation-based biomarker signatures in obesity-related pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in epigenetics, microarray handling, and R-based bioinformatic analysis using ChAMP.
- Dependent on thermal cyclers, hybridization ovens, microarray scanners, and vacuum desiccators for processing.
- Necessitates cross-team standardization between wet lab and bioinformatics teams for consistent data generation.
- Adaptation to other model systems may require validation of cell type correction steps.
- Practical limitation: Large data output (400K+ probes) demands sufficient computational resources (≥8GB RAM) and storage.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:03
Introduction
0:43
Day 1: Bisulfite Treatment
1:21
Day 2: Amplification - Methylation Assay, Manual Protocol
2:52
Day 3: Hybridization - Methylation Assay, Manual Protocol
6:39
Day 4: Staining - Methylation Assay, Manual Protocol
10:48
Representative Results
14:34
Conclusion
