アストロサイトの発現および転写活性を有する遺伝子特異的DNAメチル化の変化の相関 KCNJ10（Kir4.1）

この手順の全体的な目標は、アストロサイトの濃縮集団におけるKCNJ 10のDNAメチル化状態を評価し、プロモーターのDNAメチル化変化を転写オプション活性と相関させることです。これは、最初に皮質アストロサイトの濃縮集団をげっ歯類の脳全体から分離することによって達成され、次にDNAを分類すると、濃縮されたアストロサイトの集団から分離されます。次に、KC J 10のDNAメチル化状態を、メチル化感度の高い高分解能融解分析またはMSを使用して評価します。HRMAです。

最後に、KC J 10プロモーターは高メチル化されており、ルシファーアッセイは、プロモーターのDNAメチル化の変化を転写活性と相関させるために利用されます。最終的に、MS.HRMAおよびルシフェラーゼアッセイは、KCNJ 10のDNAメチル化状態を測定するために使用され、プロモーターのメチル化および遺伝子の転写活性の変化を相関させる手順が見られる。私の研究室のポスドク研究員である「すべての動物は、アラバマ大学バーミンガム校の動物管理および使用委員会である国立衛生研究所のガイドラインに従って取り扱われました」動物の使用

すべてのバッファーおよび試薬は、テキストプロトコルに従って調製しました。安楽死させた動物の頭部から皮質を解剖した後、テキストプロトコルに従って、50ミリリットルの円錐形チューブの上部に穴を開けるかドレメルして、チューブをチューブに供給できるようにします。次に、チューブにパピン溶液を追加します。

解剖した皮質を、95%O2〜5%CO2に平衡化された解離培地を含む10mm培養皿に入れ、清潔なカミソリの刃を使用して組織を1つずつ平方ミリメートルの断片に刻みます。10ミリリットルのピペットを使用して、男性は組織をペパン溶液を含む50ミリリットルのチューブに移します。排出する前に、組織をトランスファーピペットの底に落ち着かせてください。

ペパン溶液をバブリングせずに持ち越される解離媒体の量を最小限に抑えるには、摂氏37度のウォーターバスで20分間インキュベートしながら、表面ガス交換を介して95%O2から5%CO2の一定の流れを適用します。インキュベーション後、10ミリリットルのトランスファーピペットを使用して組織をゆっくりとテートし、濁った細胞懸濁液を300Gで室温で5分間10回遠心分離します。DNAのアルブミン阻害剤溶液を表面ガス交換により平衡化し、ペレット化した細胞を溶液の3ミリリットルに再懸濁します。

次に、製造元の指示に従って、市販の不連続密度勾配を準備します。不連続な密度勾配を70 Gで6分間回転させます。次に、ピペットを使用して培地を吸引することにより、解離した細胞をチューブの底から分離します。

2〜3ミリリットルのDPBSと0.02%ウシ血清アルブミン、およびDNAまたは好ましい培地1ミリリットルあたり1ミリグラムを使用します。.reusするには、解離した細胞を懸濁します。細胞を40マイクログラムのフィルターに通してから、テキストプロトコルに従ってファクトソーティングとDNAまたはRNA抽出を行います。

重亜硫酸塩に対してプライマーを設計した後、変換されたDNA配列とテキストプロトコルに従ってDNAを増幅し、亜硫酸塩によって各サンプルの500〜1000ナノグラムのDNAと、同じ動物種から0〜100%の範囲のDNA標準を、好ましいDNAポリメラーゼと5マイクロモルプライマーを使用して変換します。Ms HRM増幅のために20マイクロリットルの反応を設定します。この表に従って、分析ソフトウェアセット、メルトカーブの遷移の前後の開始および停止パラメータに応じて、ファックス、DNA、メチル化標準を含むすべてのサンプルを三重に実行します。

プレムメルト、スタート、プレムメルトストップのパラメータを設定します。したがって、2つの差は摂氏0.2〜0.5度です。溶融後、開始、停止を同様に設定し、メチル化率標準とそれに対応するピーク温度差を使用して、各サンプルのピーク温度差データを抽出します。

線形回帰方程式を生成します。この線形回帰式を使用して、目的のCPGアイランドを同定し、テキストプロトコルに従ってCPGアイランドLuke twoプラスミドを増幅およびクローニングした後、未知サンプルのメチル化状態を推定します。お好みのカッターソフトウェアを使用して制限酵素消化の部位を検証し、ダブルカットを回避し、サンプルが適切な酵素で消化されたら30 μgのプラスミドを直鎖化します。

50マイクロリットルの反応で適切な温度と持続時間で酵素を熱不活性化します。5ユニットのCPGメチル化物を使用してメチル化します。700マイクログラムの線状化プラスミドを摂氏30度で13〜19時間。

テキストプロトコールに概説されているようにDNAを洗浄した後、37°Cで1時間インキュベートすることにより、メチル化DNAの1マイクログラムサンプルに対してHPA 2制限消化を実施します。DNAランサンプルを1%agros上で洗浄した後、DNAゲルを100ボルトで45分間観察し、可視化します。次の対象は、メチル化プラスミドと非メチル化プラスミドを適切な制限酵素で一晩で二重に消化し、全長Luke 2ベクターとCPGアイランドフラグメントを放出する。

消化後、熱によって酵素が不活性化されます。1%DNAのagrosのゲルで100ボルトの二重消化されたサンプルを1時間1時間実行し、ベクトルを分離し、紫外線に対する保護を身に着けながら挿入し、黒い光の上にゲルを置き、きれいな外科用刃で、テキストプロトコルに従ってDNAをゲル抽出した後、メチル化および非メチル化インサートを切除します。 T 4 DNAリガーゼと挿入するベクターの1対4の比率を使用して、メチル化インサートと非メチル化インサートを非メチル化ベクターに降格させます。ライゲーション後、マイナス20°Cでインキュベートするか、氷上で一晩インキュベートします。

DNAを洗浄し、1%DNA arosゲル上でサンプルを泳動して再ライゲーションを検証し、12ウェルプレート上の再ライゲーションプラスミドCD 54細胞の濃度をウェルあたり140,000細胞で評価します。24時間後。市販のトランスフェクション試薬を使用して、非メチル化CPGループ2プラスミドとRANバニラまたは他のコントロールフェラスベクターまたはメチル化c pg Luke 2プラスミドとエラまたは他のコントロールルシファーベクターのいずれかを等濃度で細胞にトランスフェクションしますルシファーアッセイを行う前に、細胞を24時間トランスフェクションします。

製造元の指示に従って、ルミノメーターを使用して各ウェルを三重に読み取ります。ホタルルシファーの活動とバニラまたはその他の制御を実行した比率を計算します。ルシファーの活動。

メチル化活性をメチル化luc活性で割ることにより、メチル化ホタル制御ルシフェラーゼ活性を非メチル化ホタル制御ルシフェラーゼ活性に正常化します。ここで示したように、濃縮されたアストロサイトの集団は、E-G-F-P-S 100ベータトランスジェニック動物のファックス選別によって取得されました。ゲート集団を前方散乱光と側方散乱光に基づいて標的とし、生細胞集団を臭化物死細胞インジケーターを用いて決定し、ここに示すゲーティングは解離後のEGFP陽性アストロサイトの代表的な画像ですが、この図は、ソーティング前とソーティング後と同様に、単離されたEGFP陽性細胞集団を示しており、アストロサイト特異的マーカーのmRNAが40倍に増加

LDHの1つ、Lの1つ。さらに、S100βおよびNGの2つの陽性OPCおよびアストロサイトの共通の発現にもかかわらず、NGの2つのmRNAの4倍の減少が観察され、オリゴデンドロサイト前駆細胞のマーカーが、濃縮されたアストロサイト細胞集団の単離を示すことが観察された。この表は、さまざまな年齢と動物数から単離された全RNAとDNAをリストアップしており、事実に従った分子分子の期待収量の参考値としてリストされています。

最後に、デュアルルシファーアッセイを利用して、メチル化インサートを非メチル化ベクターに移動した後の目的の遺伝子の高メチル化領域の転写活性を評価しました。非メチル化DNAのみを消化するHPA 2を用いて、プラスミドのメチル化状態を確認しました。このビデオを見れば、事実を用いてアストロサイトの濃縮集団を単離する方法、遺伝子のDNAメチル化を測定する方法、およびメチル化感度高分解能融解解析とルシフェラーゼアッセイを使用してプロモーターのDNAメチル化の変化を転写活性と相関させる方法について十分に理解できるはずです。