アストロサイトの発現および転写活性を有する遺伝子特異的DNAメチル化の変化の相関

本手順の全体的な目的は、濃縮されたアストロサイト集団におけるKCNJ 10のDNAメチル化状態を評価し、プロモーターのDNAメチル化変化と転写活性との相関を明らかにすることです。まず、FACSソートによりげっ歯類の全脳から皮質アストロサイトの濃縮集団を単離し、次にその濃縮アストロサイト集団からDNAを抽出します。その後、メチル化感受性高解像度融解分析（MS-HRMA）を用いて、KCNJ 10のDNAメチル化状態を評価します。

最後に、KCNJ 10プロモーターの高メチル化を確認し、ルシフェラーゼアッセイを用いてプロモーターのDNAメチル化の変化と転写活性との相関性を解析します。最終的に、MS-HRMAおよびルシフェラーゼアッセイを用いてKCNJ 10のDNAメチル化状態を測定し、プロモーターのメチル化の変化と遺伝子の転写活性との相関性を測定します。本手順の実演を行います。私の研究室の博士研究員が担当しました。すべての動物は米国国立衛生研究所（NIH）のガイドラインに従って取り扱われ、アラバマ大学バーミンガム校の動物ケアおよび使用委員会によって動物の使用が承認されました。

すべての緩衝液および試薬は、テキストプロトコルに従って調製しました。安楽死させた動物の頭部からテキストプロトコルに従って皮質を摘出した後、50 milliliter コニカルチューブの上部に、チューブを挿入できるように穴を切り抜くかドレメルで開けます。その後、チューブにパパイン溶液を加えます。

摘出した皮質を、95%O2および5%CO2で平衡化した解離培地を含む10 millimeterの培養皿に移し、清潔なカミソリを用いて組織を1 by 1 square millimeterの大きさに細かく刻みます。10 milliliterピペットを使用して、組織をパパイン溶液を含む50 milliliterチューブに移します。排出する前に、組織が転送ピペットの底に沈殿するまで待ちます。

ペパイン溶液を気泡立てずに、キャリーオーバーする解離液の量を最小限に抑えるため、37 °Cのウォーターバスで20分間インキュベートしながら、表面ガス交換を介して95% O2および5% CO2を一定に供給します。インキュベーション後、10 mLのトランスファーピペットを用いて組織をゆっくりと10回トリチュレーションし、濁った細胞懸濁液を室温にて300 Gで5分間遠心分離します。DNA albumin inhibitor solutionを表面ガス交換で平衡化し、ペレット化した細胞を同溶液3 mLで再懸濁します。

次に、製造者の指示に従って市販の不連続密度勾配液を調製します。不連続密度勾配液を 70 G で 6 分間遠心分離します。その後、ピペットで培地を吸い出し、チューブの底から分離した細胞を回収します。

0.02% 牛血清アルブミンおよび 1 mg/mL の DNA を含む DPBS、または好みの培地を 2～3 mL 使用します。再懸濁には、解離した細胞を懸濁させます。 FACS ソーティングおよびテキストプロトコルに従った DNA または RNA 抽出を行う前に、細胞を 40 µm フィルターに通します。

重亜硫酸塩変換後のDNA配列に対してプライマーを設計し、テキストプロトコルに従ってDNAを増幅した後、好みのDNAポリメラーゼと5 µMのプライマーを用いて、各サンプルのDNA 500〜1000 ngおよび同一動物種由来の0〜100%の範囲のメチル化DNA標準物質を重亜硫酸塩変換します。Ms HRM増幅用に20 µLの反応系を調製します。この表に従い、DNAサンプル、およびメチル化標準物質を含むすべてのサンプルを3連（トリプリケート）で実行し、解析ソフトウェアに応じて、融解曲線の転移点付近にスタートおよびストップのパラメータを設定します。

prem melt startおよびprem melt stopのパラメータを設定します。この2つの差が0.2～0.5 °Cになるように調整してください。同様にpost melt startおよびstopを設定し、メチル化率標準試料とその対応するピーク温度差を用いて、各サンプルのピーク温度差データを抽出します。

線形回帰方程式を算出します。この線形回帰方程式を用いて、目的のCpGアイランドを特定し、テキストプロトコルに従ってCpGアイランドをプラスミドに増幅・クローニングした後、未知サンプルのメチル化状態を推定します。Preferred Cutterソフトウェアを使用して制限酵素消化部位を確認し、ダブルカットを避けます。適切な酵素でサンプルを消化した後、30 µgのプラスミドを線状化します。

50 µLの反応系において、適切な温度と時間で酵素を熱失活させます。メチル化には、5 unitsのCPG methylateを使用します。30 °Cで13〜19時間、700 µgの直線化プラスミドをメチル化します。

テキストプロトコルに記載されている手順でDNAを精製した後、1 µgのメチル化DNAサンプルを用いて、37 °Cで1時間インキュベートし、HPA II制限酵素消化を行います。DNAを精製した後、サンプルを1%アガロースDNAゲルにて100 Vで45分間電気泳動し、可視化します。次に、メチル化および非メチル化プラスミドを、適切な制限酵素を用いて一晩二重消化し、フルレングスのLuke 2ベクターおよびCpGアイランド断片を切り出します。

消化後、酵素を熱失活させます。二重消化したサンプルを1%DNAアガロースゲルで100Vにて1時間電気泳動し、ベクターとインサートを分離します。次に、UV保護具を着用した状態でゲルをブラックライトの上に置き、清潔な外科用メスを用いて、メチル化および非メチル化インサートを切り出します。記載のプロトコルに従ってDNAをゲル抽出した後、T4 DNA Ligaseを用い、ベクターとインサートの比率を1:4として、メチル化および非メチル化インサートを非メチル化ベクターに再ライゲーションします。ライゲーション後、-20°Cまたは氷上で一晩インキュベートします。

DNAを精製し、1%アガロースゲルでサンプルを電気泳動して再ライゲーションを確認した後、再ライゲーションされたプラスミドの濃度を評価する。CD54細胞を12ウェルプレートに1ウェルあたり140,000個で播種し、24時間後に、市販のトランスフェクション試薬を用いて、非メチル化CpG loop 2プラスミド＋RAN vanilla（またはその他のコントロールルシフェラーゼベクター）、あるいはメチル化CpG loop 2プラスミド＋ELLA（またはその他のコントロールルシフェラーゼベクター）を等量ずつ細胞にトランスフェクションする。ルシフェラーゼアッセイを行う前に、24時間トランスフェクションを行う。

製造元の指示に従い、ルミノメーターを用いて各ウェルを3連（triplicate）で測定します。ホタルルシフェラーゼ活性とRenillaまたはその他のコントロールの活性の比率を算出します。ルシフェラーゼ活性。

メチル化ルシフェラーゼ活性値を非メチル化ルシフェラーゼ活性値で除することで、メチル化ファイアフライコントロールルシフェラーゼ活性を非メチル化ファイアフライコントロールルシフェラーゼ活性に対して標準化します。ここで示したように、EGFP-S100βトランスジェニック動物のFACSソートにより、アストロサイトの濃縮集団が得られました。前方散乱光および側方散乱光に基づいてゲート集団を標的とし、臭化物死細胞インジケーターを用いて生細胞集団を決定しました。ここで示すゲート処理の画像は、解離後かつソート前、およびソート後のEGFP陽性アストロサイトの代表的な画像です。この図は、アストロサイト特異的マーカーのmRNAが40倍に増加したことが示された、単離されたEGFP陽性細胞集団を示しています。

LDH 1およびL1です。さらに、S100βとNG2が共に発現しているOPCsおよびアストロサイトが存在したにもかかわらず、オリゴデンドロサイト前駆細胞のマーカーであるNG2 mRNAが4分の1に減少しており、アストロサイト細胞集団が濃縮して単離されたことが示されました。この表には、異なる週齢および個体数から単離した全RNAおよびDNAが記載されており、抽出後の分子量の期待収量に関するリファレンスとして提示されています。

最後に、メチル化されたインサートを非メチル化ベクターに移行させた後、標的遺伝子の高メチル化領域の転写活性を評価するためにデュアルルシフェラーゼアッセイを用いました。プラスミドのメチル化状態を確認するためには、非メチル化DNAのみを消化するHPA IIを使用しました。このビデオを視聴することで、FACSを用いたアストロサイトの単離および濃縮方法に加え、遺伝子のDNAメチル化測定方法、およびメチル化感受性高解像度融解分析（HRM分析）とルシフェラーゼアッセイを用いて、プロモーターのDNAメチル化の変化と転写活性をそれぞれ相関させる方法について十分に理解できるはずです。