単一セルと単スパイク分解能で閾値上神経活動の光記録

FollowMe実験の全体的な目標は、多数のニューロンからの神経スパイク活動を記録することです。これは、最初のステップで蛍光顕微鏡を使用して、各活動電位に関連するニューロン体内の細胞内カルシウム濃度の増加を観察することによって達成されます。2光子励起とランダムアクセススキャン原理を使用して、40ニューロン体からのカルシウム蛍光シグナルを高い空間的および時間的分解能で記録します。

2番目のステップでは、デコンボリューションアルゴリズムを使用して、蛍光シグナルから正確なスパイクタイミングを抽出します。この手法は、数十のニューロンからのスパイク活動を記録するために使用できます。その後、スパイクデータを使用して、相互情報量、ニューロン集団間のシグナル伝播、または神経相関を測定できます。

この手法がマイクロ電極記録などの既存の方法よりも優れている点は、局所集団の多数のニューロンからのニューロンスパイク活動を記録できることです。この方法は、ニューロンのローカルネットワークレベルでの皮質機能に関する重要な質問に答えるのに役立ちます、例えば、情報の相関を求めることの重要性や、皮質の可塑性を伴うネットワークダイナミクスの変化 2光子励起の場合、フェムト秒パルスを備えた赤外線パルスレーザーシステムが使用されます。システムの光学部品によってもたらされる大きな損失を相殺するには、高いレーザー出力パワーが必要です。

2つのプリズムで構成されるシステムごとのプリーチャーは、AODによってもたらされる時間的分散を補償するために、custo光偏向器の前にレーザーパルスに負の群速度分散を付与します。これは、大きな開口部を持つ2つのAODがレーザービームを2次元で偏向します。1ミリメートルあたり100の溝を持つ反射回折グレーディングは、AODによってもたらされる空間分散を補正するために、AODの後ろ13cmに配置されています。短いレーザーパルスを使用する場合、レーザービームは2つのリレー望遠鏡で正立顕微鏡のカメラポートに向けられます。

アイリスは、光学部品のアライメントのために一定の間隔で配置されます。対物レンズの前にあるダイクロイックビームスプリッターは、赤外線励起光を試料に透過し、試料からの蛍光光を検出器に反射します。エピ蛍光検出器とトランス蛍光検出器は、対物レンズを通じて蛍光シグナルを収集し、励起光が検出器に到達するのを防ぐために、コンデンサー色ガラスフィルターを検出器の前に配置します。

A ODの偏向角度は、デジタルアナログコンバータボードを装備したコンピュータによって制御され、電圧制御発振器を駆動します。光増倍管からの信号は、カットオフ周波数が100キロヘルツのローパスバターワースフィルタを介して中継され、156.25キロヘルツのクロックレートでアナログデジタルコンバータによってデジタル化され、分析のためにコンピュータに保存され、アライメントと電気ノイズは、光マルチプライヤーの低ゲインと高ゲインでレーザー光の有無にかかわらず蛍光信号の分布を記録することによってテストされます。 インジケータディザリングランダムアクセススキャンの有無にかかわらず、カルシウムの細胞内増加の検出に依存しています。プロトコールの最初のステップは、ボーラス注射により多数のニューロンをカルシウムインジケーターのエスター型で染色することです。

次に、各ニューロンの4つの位置での体細胞の活動を、各位置で6.4マイクロ秒記録します。目的のニューロンを選択するには、256 x 256 ピクセルで構成されるフルフレームを取得します。次に、この画像内に記録するニューロンの中心を手動で選択します。

各中心から2ミクロンの距離にある3つのポイントは、各サイクルで制御ソフトウェアによって自動的に追加されます。蛍光シグナルは、40個のニューロンすべての4つの位置から記録されます。1サイクルですべてのニューロンから記録するには、1.536ミリ秒が必要です。

この40個のニューロンすべての連続記録を5秒間繰り返します。蛍光体細胞カルシウムシグナルからのスパイク検出は、高いシグナル対ノイズ比に依存しています。励起強度を上げることで、高いS/N比を達成することができます。

しかし、光の損傷により、励起強度は一定の限界までしか上げられません。光の損傷が低く、信号対雑音比が単一のスパイクを検出するのに十分である励起強度のウィンドウは、記録された信号が高スパイク検出のウィンドウ内にあることを確認するために、非常に小さなウィンドウしかありません。実験時には、当研究室が開発したオンライン解析ソフトウェアを多数使用しています。

次に、約100〜200ミリ秒のベースラインノイズの短い時間枠から、ニューロンあたりのおおよその光子レートを計算します。光子の数と光子速度は、相対的な蛍光変化の分布をこの式で当てはめることにより、蛍光値から計算され、同じ時間枠からベースライン蛍光を計算し、時間または試行の関数としてプロットされます。レーザー出力を調整することにより、ベースラインの平均低下を毎秒0.0002未満に保ちます。

この制限を超えると、スパイク検出が急速に低下するためです。その後、フルフレーム画像を取得して、10〜20分ごとにニューロンの体細胞位置を確認します。必要に応じて、録音場所を調整します。

神経活動から生じる蛍光シグナルは、カルシウムの一時的なものの長い減衰のために、しばしば時間内に食いつぶされました。この手順では、デコンボリューション法を使用して、蛍光シグナルからのスパイクおよびスパイクタイミングを行います。ここでは、遺伝的アルゴリズムを使用して、記録された蛍光シグナルに最も適合する可能性の高いスパイクトレインモデルを決定します。

アルゴリズムを反復するたびに、最尤法は、蛍光記録のノイズによって与えられる最大値に漸近的に近づきます。ニューロンの均質な集団では、誘発されるスパイクカルシウムシグナルはニューロン間で異なる可能性があります。大規模なデータセットの教師なし分析のために、ニューロンからニューロンへのスパイク誘発カルシウム信号の変動を考慮に入れたアルゴリズムを設計し、多数の誤検出を回避しました。

1つのスパイク誘発カルシウム過渡現象の振幅と減衰時定数の同時分布は、同じ実験条件下で同じタイプのニューロンからの別々の実験セットに記録されています。遅いベースラインの変更を考慮し、デコンの計算コストを削減するために、より長い記録は、各記録の各ニューロンについて1〜5秒のいくつかの短いトレースに分割され、デコンボリューションアルゴリズムは、デコンボリューションを高速化するために、最大100万の異なるモデルまたはそれ以上の多数のモデルをテストすることができます。並行して。

デコンボリューション後、スパイクデータを分析および検査します。周囲の刺激時間ヒストグラムのスパイク確率とニューロンの発火率は、自動化された方法で計算されます。以下は、検出ウィンドウ内で非常に低い励起速度で記録された蛍光シグナルと、非常に高い励起速度で記録された蛍光シグナルの例です。

各例は、1 つのスパイクに対する応答を示していることに注意してください。ここに示されているのは、急性脳スライスと、同じ皮質カラムに配置された2つの刺激ピペットの写真顕微鏡写真です。第4層では、これらは反復刺激に対する神経応答を示しており、このグラフは、記録されたニューロン集団によってシグナル伝達されるシャノンの相互情報を示しています。

これは、皮質ニューロンの異なる集団間でのスーパースレッショルドスパイキング活動の伝播の測定です。これらは、皮質ニューロンで検出されたスパイクであり、眼瞼皮質線維の電気刺激に対する応答です。ランダムアクセススキャンを使用してニューロンの活動を記録する場合、検出ウィンドウ内に記録することが非常に重要です。

そうしないと、非常に簡単に使用できなくなるデータセットになってしまいます。光学式スパイク検出は、まだ初期段階にあります。改善の余地はたくさんあります。

いくつかの改良により、さらに多くのニューロンから記録できるようになりました。その他の改善により、目覚めている動物や行動している動物を記録することさえできるようになります。