軸索、樹状突起および脳スライスにおける個々のニューロンの樹状突起棘から電位感受性色素記録

本実験の全体的な目的は、個々の神経細胞における膜電位信号の統合および情報処理を、ニューロン上の複数の部位から、サブマイクロメートルおよびサブミリ秒の解像度で光学的にモニタリングすることです。これは、まず、膜電位の過渡的な変化に対応する光強度の微小な分数的変化を記録できる適切な感度を備えたイメージングセットアップを構築することで達成されます。次に、単一の焦点面内でスライス表面に近い位置に、長くて完全な突起を持つ、効果的なイメージングに適した解剖学的構造を有するニューロンを選択します。

次に、膜電位の変化を光学的に追跡できるように、あらかじめ選択したニューロンに電位感受性色素を導入します。結果として、軸索、樹状突起、および樹状突起スパインからの膜電位信号をモニタリングすることにより、個々の神経細胞による電気信号の統合に関する情報を取得できる、本アプローチ独自の能力が示されます。細胞神経生理学において。

従来の電気生理学における2つの長年の制限、すなわち電極測定の空間分解能が低いことと、軸索側枝や樹状突起スパインのような微小構造から記録できないことから、新しい手法の開発が進められています。これらの欠点を克服するため、パッチ電極法を光学的手法と組み合わせることで、ニューロンのあらゆる部位から並行して記録することが可能になります。ここでは、単一スパインの分解能で膜電位過渡応答を多点光学的に記録するこのような手法について説明します。

この実験では、正立顕微鏡と3台のカメラを用いて均一な照明の調整を行います。まず、レーザー光路に適切なNDフィルターを挿入します。次に、対物レンズを用いて標準蛍光スライドの表面に焦点を合わせます。

モニター画面で視野のCCD画像を確認しながら、エピ蛍光コンデンサーの適切なアクチュエータを使用して、石英ライトガイドの受光端およびライトガイドの出力端の位置を調整し、視野の中央で均一な照明が得られるようにします。振動ノイズを測定するには、表面に非蛍光マークがある標準蛍光スライドを使用してください。neuro CCDを用いて、連続モードで光強度を記録します。

対物レンズを黒い印の暗いエッジに合わせ、フレームレート 2 kHz で約 100 ms 間、光強度を記録します。次に、均一に照明された領域からの光を受けている約 20 ピクセルと、黒い印のエッジに沿った約 20 ピクセルの、分光光強度トレースの空間平均を表示します。高コントラストのエッジを持つピクセルの空間平均における過剰ノイズは、システム内の振動ノイズを反映しています。

シャッターの開放による振動ノイズが光学記録に混入しないよう、メカニカルシャッターを除振台の外に設置することが不可欠です。これは極めて重要な工程です。光学記録システムで拾い上げられる可能性のある音響振動ノイズを低減するため、プラスチック製ネジと除振材を用いてシャッターを固定してください。

振動を遮断するため、画像の急峻なエッジ部分をカバーする画素の振動ノイズがショットノイズよりも小さくなるまで、防振台を調整します。機械的な振動が顕微鏡の鏡筒に伝わらないよう、台上の装置配線は余裕を持たせてください。この手順では、回転円盤共焦点システムを用いて、目的の個々の神経細胞にEGFPを発現するマウス系統から、標準的な手順に従って厚さ300〜400 µmの脳切片を準備します。

スライス内のEGFP標識ニューロンを可視化します。次に、膜電位イメージングのため、樹状突起および軸索の構造が完全で、突起がスライス表面に平行かつ近接して走行しているニューロンを選択します。その後、約15秒間負圧をかけることで、ガラスパッチピペットの先端から電極テーパーの3分の2まで、色素を含まない細胞内溶液を満たします。

その後、細胞内液に溶解させた膜IMP透過性電圧感受性色素を含む溶液で、電極内を充填します。色素を電極に充填してから1分以内に、あらかじめ選択しておいたニューロンにパッチクランプを行います。ピペットをバスに浸す前に、約10 mmHgの低い正圧をかけます。スライス内で電極を配置する際に、これによりシールが形成される前に電極から色素が漏出するのを防ぎます。

電極が細胞表面に接触する直前に、圧力を水銀柱100 mm程度の高圧まで上げます。ホールセル構成でシールを形成し、体細胞パッチピペットから細胞体へ色素が自由拡散するように20～45分間保持します。色素の拡散中、カレントクランプモードで誘発活動電位を記録し、ニューロンの生理状態をモニターします。

さらに、ニュートラル密度フィルターで調整した全光強度の数分の一の強度で、細胞体からの静止光強度を2kHzのフレームレートで記録し、染色の程度をモニタリングします。活動電位の幅が広がリ始めるまで、ダウンロードプロセスを継続してください。染色の終了後、ホールセル構成からアウトサイドアウトパッチ構成への移行が確実に行われるよう、電圧クランプ構成のままパッチピペットを細胞体から慎重に引き離します。

その後、電位感受性色素がニューロンの突起まで拡散するように、スライスを室温でさらに1.5〜2時間インキュベートします。十分な量の色素が細胞体から樹状突起および軸索突起へと拡散すれば、活動電位の波形は完全に復元しているはずです。次のステップでは、低強度の蛍光下で染色されたニューロンの細胞体を特定します。

ニュートラル密度フィルターを用いて光強度を下げ、XYステージを使用して目的の物体を可視化するために必要な最小限の強度に調整します。蛍光ニューロンを含む切片の領域をスキャンし、蛍光細胞体を確認します。染色された細胞の細胞体を顕微鏡視野の中心に配置し、DIC観察下で色素を含まない標準的なパッチ電極を用いてニューロンにパッチクランプを行います。その後、電圧イメージングのため、CCDの連続記録モードにて、10から40 Hzのフレームレートで低強度の蛍光下でニューロン突起を可視化します。

XYステージの位置を調整し、目的の神経突起をイメージング領域の中央に配置します。さらに、光力学的ダメージを軽減するため、顕微鏡の部分的に閉じられたフィールドストップアイリスを用いて、SOMAを励起光から保護します。次に、個々の樹状突起枝における逆伝播活動電位に関連する光学信号を記録します。

次に、軸索における活動電位に関連する光信号を記録します。その後、樹状突起棘における逆伝播活動電位に関連する光信号を記録します。信号波形を正確に再構成するために、適切なフレームレートを使用してください。

同時に、色素の退色や光力学的損傷を最小限に抑えるため、記録期間および高強度励起光への曝露時間は可能な限り短くしてください。ここでは光学信号の記録を示します。上パネルは、記録位置にある軸索を持つ染色されたニューロンの高解像度共焦点画像を示しています。

中央のパネルは、膜電位イメージングに使用したCCDで得られた軸索の低空間分解能蛍光画像を示しており、下段のパネルは、細胞体からの電極記録、およびA ISとrvi結節からの光学記録を示しています。ここでは生データと処理後の信号が表示されています。この図は、電位感受性色素を導入したL5皮質ニューロンの軸索からの活動電位信号を示しています。

関連する可能性のある信号を10 kilohertzのフレームレートで記録しました。これらのトレースは、3つの部位からの活動電位の過渡応答を示しています。1つ目は、細胞体から記録した電極によるものです。

2つ目は軸索丘からの光学記録、3つ目は第一節（first node of Ranvier）からの光学記録であり、ここではこれら3つの同じ部位からの重畳信号を示しています。この図は、100 Hzの短い脱分極電流パルスによって誘発された、L5皮質ニューロンの樹状突起樹の複数の部位からの4回の逆伝播活動電位信号のバーストを示しています。ここでは、個々の樹状突起スパインからの活動電位信号を示しています。

ここでは、スピニングディスク共焦点画像のスタックから得られた解剖学的再構築像と、CCDカメラで撮影した同一領域の蛍光画像を示しています。膜電位イメージングについて、CCD画像上の1から3の箇所から得られた逆伝播活動電位に対応する蛍光強度トレースを右パネルに示します。最下部のトレースは、細胞体から記録した電極の記録を示しています。

記録前の準備には、ダイス（dice）が遠位突起まで拡散する待機時間を含めて約3時間かかります。記録時間は、標本の通常のランダウン（rundown）およびPO光力学的損傷によって制限されます。光力学的損傷の程度は、励起光の強度、ならびに個々の記録試行の期間および回数に比例します。

一部の実験では、1時間から2時間の間で50回以上の記録試行を行うことが可能です。一方で、高い励起光強度や長時間の記録を必要とする測定では、光力学的損傷によって記録試行回数が数回に制限される場合があります。このビデオを視聴することで、脳切片中の個々のニューロンにおける軸索および終末構造全体の電位イメージングを行う方法について、十分な理解を深めることができます。