Name: 軸索、樹状突起および脳スライスにおける個々のニューロンの樹状突起棘から電位感受性色素記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: 学ぶ 電位感受性色素を用いた脳スライス中の個々ニューロンの軸索・樹状突起・樹状突起棘からの膜電位変化の高解像度光学記録法。この手法により神経細胞の電気信号統合を詳細に解析できる。

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私たちは親切に染料を提供するためレスリー·M.·レーブにだけでなく、この技術の初期開発に参加した私たちの共同研究者クヌートHolthoff、アーサーKonnerthとマルコCanepariに感謝しています。 NSFの助成金、IOS-0817969、NIHの助成NS068407とM136043で、エール大学神経科学カヴリ研究所によってサポートされています。

1。機器セットアップステップ1.1。イメージングセットアップ膜電位感受性色素信号を記録するための鍵は、適切なセットアップデザインです。我々は、3つのカメラを搭載した正立顕微鏡（オリンパスBX51WIまたはツァイスAxioExaminer）を使用します。セットアップはニコン60X/1.0 NAまたはツァイス63X/1.0 NAの水浸漬目標のいずれかを使用して、落射蛍光、広い視野顕微鏡モードでの励起光によって脳スライスにおける照明個々のニューロンのために設計されています。当社の顕微鏡は防振台にボルトで固定し、電動可動ステージを完備しています。各顕微鏡は、3つのカメラポートが装備されています。一台のカメラポートがビデオ顕微鏡（IR-1000、DAGE MTI、米国）赤外線DICのための標準的な高空間分解能のCCDカメラを持っています。第2のカメラポートは、比較的低い空間分解能（80×80ピクセル）が、優れたダイナミックレンジ（14ビット）と読み、非常に低いと、高速データ·アクイジション·カメラ（最大20 kHzのフレームレート）を有しているノイズ（NeuroCCD-SM RedShirtImaging LLCは、ディケーター、ジョージア州）。用共焦点画像のzスタックを収集するために使用スピニングディスク共焦点スキャナ（CSU-10、横河電機、日本）に搭載され、第3のカメラポートは、高空間分解能を持つCCDカメラ（PCO AG、ドイツPixelFly、1392x1024ピクセル）を持つ染色された細胞の詳細な形態学的再建。倍周波数ダイオード励起Nd：波長532 nm（MLL-III/400 mWで、CNI、長春、中国）での連続波YVO4レーザ（400 mW）の発光は、励起光の源である。シャッター（LS6、ビンセント·アソシエイツ）によってゲート直径2mmのレーザービームがあふれへの背面開口部を設計したシングルポートの落射蛍光コンデンサー（フォトニクス社、グレーフェルフィングまで、ドイツ）を介して顕微鏡に結合された光ガイドに導かれる客観的かつ物体面の均一な照明の近くに提供する。レーザ光 ​​はによってV メートルイメージングの感度を最大にするために、従来のキセノンアークランプの代わりに使用されます：（1）単色EXを使用して染料9、10、（2）アークランプによって達成することができるレベルを超えて、励起光の強度を増加させるのV mの感度を最大にするために、吸収スペクトルの赤い翼で引用光。励起光は560nmの中心波長を持つダイクロイックミラーにより準備に反映されていたと記録された蛍光の光は610nmのバリアフィルタ（Schott社RG610）に通した。光強度の増加とほぼ最適な単色励起波長の使用の複合効果により、以前の測定6に比べて約50倍の電圧イメージングの感度が劇的に改善しました。 ステップ1.2。均一な照明を調整蛍光スライド標準（緑色励起/赤色発光）を使用します。 CCDが飽和しないように、レーザ光路の適切な減光フィルターを挿入します。の表面に目的を集中スライド。レーザーランチャー対物レンズの前の石英光導路の受信端の位置を調整し、中心と均一達成するために、落射蛍光コンデンサー上の適切なアクチュエータを用いた顕微鏡に取り付けられたライトガイドの出力端の位置を調整視野の照明。 ステップ1.3。振動ノイズを決定蛍光スライドの表面に小さな黒いインクマークを置きます。連続記録モードでNeuroCCD持つレコード光強度。黒インクマークの暗い端に目的を当てる。 2 kHzのフレームレートで約100ミリ秒の光強度を記録します。均一に照明エリアから、インクマークの縁に沿って約20ピクセルからの光を受けて〜20ピクセルから小数光強度トレース（ΔF/ F）の空間平均を表示します。高コントラストのエッジを持つピクセルから録音中の過剰なノイズがで振動ノイズを反映システム。 手順1.4。振動絶縁これは実験的な撮影状況に匹敵する光強度におけるショット雑音以下のレベルに振動アイソレーションテーブルを使用することにより、振動を低減するために必須です。画像のシャープなエッジをカバーするピクセルからの光強度の振動ノイズが無視できるまで防振台を調整します。可動部品（メカニカルシャッター、ファン）を備えた機器はいずれもテーブルの上にマウントすることはできません。振動から絶縁されていません他のコンポーネントに接続されているテーブルの上に機器​​のケーブルは、顕微鏡に機械的振動を伝達しないように緩んでなければなりません。 2。 V メートルイメージングのための適切なニューロンの選択ステップ2.1。ニューロンの選択標準的な手順に従って、脳スライスを作成します。 iの個々の神経細胞にEGFPを発現するマウスラインを使用nterest。回転するディスク共焦点システムでは、スライスのEGFP標識された神経細胞を可視化する。無傷の軸索/樹木でV メートルイメージングのための神経細胞を選択し、プロセスはスライスの表面に平行かつ近接し実行されています。軸索と樹状突起は薄いが、ほとんどの部分は、DIC顕微鏡モードでは表示されませんので、これは野生型マウスでは実現できません。 3。電位感受性色素を使用したロードニューロンステップ3.1。パッチピペットの充填電極テーパーの2月3日までの約15秒間陰圧を適用することにより、色素無細胞内液で先端からガラスパッチピペットを埋める。先端における染料の無料のソリューションは、バックグラウンド蛍光を増加させ、劇的に信号対雑音比を減少させるスライスに色素の流出を防止することが必要である。膜非透過性の膜電位感受性色素JPW3028が溶解含有する溶液と電極を埋戻し細胞内溶液（0.8 mM）のインチ JPW3028、細胞内のアプリケーションのために最も成功した電圧プローブは、まだ十分に水をマイクロインジェクションに使用するには可溶である親油性スチリル色素のANEPシリーズの二重に正に帯電アナログである。この色素のジ-エチル類縁体と実質的に同一の特性（電圧感度を含む）を有しており、JPW1114（ 表1参照）として市販されている。私たちは、蒸留H 2 O中の20mMストック溶液を調製ストック溶液の50μlアリコートを-20℃で凍結保存されます0.8 mMの最終色素濃度は、原液の2μlを実験当日の細胞内溶液50μlに溶解させる。在庫色素溶液は安定しており、数ヶ月のために室温に保つことができる。それが使い果たされるまで、したがって、私たちは、室温で150μlアリコートを保つ。 ステップ3.2。迅速ギガシールを確立<p claSS = &quot;jove_content&quot;&gt;パッチ以前に選択されたニューロンと20から45分間、全細胞構成でソーマに体パッチピペットからの染料の自由拡散を可能にします。それは先端の染料を含まない溶液の量を小さく保つことができるように、できるだけ早くシールを得ることが不可欠である。電極における色素なしで速いパッチを実践することによって開始します。周囲の組織を汚染することなく、チップ内の色素を含まない溶液の最小量を使用することを目的とした染料と次に、実際のパッチ適用およびローディングニューロン。練習すれば、それは1〜2分以内にシールを確立することが可能である。 ステップ3.3。染色のレベルを監視全細胞構成における染料拡散中、電流クランプモードで誘発活動電位を記録することによって、ニューロンの生理的状態を監視します。さらに、2 kのフレームレートで細胞体からの安静時の光強度（RLI）を記録することにより、染色の量を監視<html> HzとNDフィルター（我々は400 mWのレーザーからのレーザー光強度の0.04％を使用）で調整フル光強度のほんの一部で。活動電位は、電極の大きさと抵抗に応じて、通常20から40分後に、広げるために開始されるまで色素ローディング処理を続行します。 スパイクの広がりは、完全に可逆および体膜中の色素の飽和濃度の容量性負荷効果による可能性が最も高い。染料濃度はニューロン全体で平衡化した後にスパイクの波形が完全に復元されます。 ステップ3.4。染料電極を取り外し期間を染色するの終わりには、慎重に持ち上げ全細胞から外にアウトパッチ設定への移行のプロセスで達成されることを確実に電圧クランプ構成でソーマからパッチピペットを引き抜きます。 ステップ3.5。染料拡散待つENT &quot;&gt;神経プロセスに広めるために電位感受性色素を可能にするために、室温でさらに1.5から2時間のスライスをインキュベートする。染料拡散し、かなりの量の後に離れてからの樹状細胞体と軸索のプロセスに、波形をAPは完全に復元されます。 4。光学式記録手順4.1。イメージングのための細胞区画を選択低光レベル蛍光とDICの下で標準（無色素）パッチ電極で再度パッチニューロンの下で染色されたニューロンの細胞体の位置を確認します。電圧撮像するCCDの連続記録モードで10から40 Hzのフレームレートで低照度下で神経プロセスを可視化します。目的のオブジェクトを視覚化するために必要な最小限度の減光フィルターで光レベルを下げてください。我々は、染色されたニューロンの位置決め時に400mWのレーザー強度の0.01％を使用しています。 XYステージを使用して、トンへの関心の神経突起を配置彼撮像領域の真ん中。顕微鏡の部分的に閉じ視野絞り虹彩を用いた励起光からソーマを保護します。高強度の励起光からソーマをシールドすることが大幅に記録中に光線力学的ダメージを減らすことができます。 膜電位の過渡に関連4.2記録された光信号をステップ個々の樹枝状でbackpropagated APに関連した光信号を記録します。軸索内のAPに関連する光信号を記録します。樹状突起棘のAPをbackpropagatingに関連した光信号を記録します。信号波形の正確な再構成のための適切なフレームレートを使用し、漂白、染料と光線力学損害を最小限にするために記録期間と高強度の励起光への曝露はできるだけ短くしてください。例えば、軸索内の単一活動電位の発生と進展のシーケンスを調べると、5から10ミリ秒の期間を記録する必要があります。励起光激化録音中にtyは一方では信号対雑音比、他方で漂白染料および光線力学損傷の程度との間の妥協である。我々は、直径300μmの領域が点灯している軸索の長い部分から記録で400 mWのレーザの強度を100％使用。励起光が樹状突起スパインのイメージングのための30μmの直径の領域にフォーカスされている場合、我々は、レーザ光強度の10〜25％を使用しています。記録の必要な期間は、最適な励起光強度を決定する重要な要因であり、短い記録期間は、より高い光強度を可能にします。最適な照度は、それぞれ最高の準備と​​測定の設定について経験的に決定されます。 5。データ解析ステップ5.1。既知のエラーの生データを訂正データの分析と表示はIDL（ITT視覚情報solutをで書かNeuroPlexプログラム（RedShirtImaging）を用いて行ったイオンは、コロラド州ボルダー）とカスタムのVisual Basicルーチン。低光レベルの条件の下では、バックグラウンド蛍光はΔF/ F信号の大きさの重要な決定要因となります。生データは、最初のスライス上に染色されていない領域から求めた平均バックグラウンド蛍光強度を差し引くことによってこの効果を補正した。その後、信号アライメントソフトウェアはAP開始の時間ジッタのためだけでなく、平均化時の準備の可能小さな動きを補正するために使用されていました。時間領域では、AP信号が平均化の開始（ 図1B）で取得された基準信号に各試験で電気的に記録されたAPの相互相関によって整列させた。空間領域では、画像は準備の可能性のある小さな横方向の動きを補正するために画像の相互相関によってオフラインに二次元的に配列していた。 z次元の画像のピントは、個々の試験の前に確認された。Smalの<html>リットルの調整が頻繁に必要であった。 図1Bに示すように、空間的にも時間的に整列された信号を平均化した。染料の脱色による光強度の緩やかな変化は無刺激（ 図1B）で記録試験から得適切なデュアル指数関数でデータを分割して補正した。 APの信号の波形はキュービックスプライン補間は、各データ点を通る区分的に連続した曲線を使用して一連のデータポイントから再構築されました。電位感受性色素信号がミリ秒の時間スケールでかなりの歪みが無く、膜電位を追跡していることを確認するには、相馬からの電気AP信号は 、 図3Bに示すように、隣接する軸索小丘からの光AP信号と比較した。二つの信号は、光記録におけるショットノイズを考慮して、非常に密接に重ねる。 les/ftp_upload/4261/4261fig1.jpg &quot;/&gt; 図1。データ解析（アニメーション）。 （A）はアッパーパネル：記録位置で軸索で染色したニューロンの高分解能共焦点画像。記録電極は、模式的に示さ基底樹状突起の横のソーマ、細胞外刺激電極に接続されている。活動電位は細胞外、シナプス刺激により誘発される。ソーマ（黒のトレース）は、AISからの光学録音（赤いトレース）からV メートルイメージングのために使用されるCCDによって得られた軸索の低空間分解能蛍光像（B）電極レコーディング、およびランヴィエ絞輪（緑のトレース）から：下のパネル。 。トップトレース：AP通信開始の時間ジッタを示す9の試験からの生データ。トレースの2行目：時間的に整列信号。トレースの3行目：平均化された信号。トレースの4行目：漂白剤補正。ボトムトレース：テンポラル平滑化の1つのパスを持つ3次スプライン補間。

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デヤンZecevic彼はLLCをRedShirtImagingの共同経営者。、電位感受性色素記録に使用される高速、低ノイズCCDカメラに特化した会社であることを宣言します。他のすべての著者らは金銭的な利益または現在の研究に関連した潜在的な利益相反が報告されていない。

この記事では、サブミクロンおよびサブミリ時空間分解能で個々の神経細胞の電気的活動を監視するための電位感受性色素記録方法を説明します。最適に近い波長のレーザー励起が（信号の大きさに関して）従来のアプローチ以上〜50倍記録の感度を向上させました。感度電流は樹状突起、軸索、軸索側枝と軸索末端だけでなく、個々の樹状突起棘を含む個々のニューロンのすべての部分からの電気信号を、監視できます。現在の感度で、膜電位の過渡の録音は最大20 kHzまでのフレームレートで行うことができる。ささやかな信号平均（4月25日の試験では）容易に2から5倍の信号対ノイズ比として表さ録音の感度を向上させることができます。電圧イメージングの主な制限は、絶対電圧スケール上の複数の場所からの光信号の簡単なキャリブレーションの欠如である。いくつかの準備中sは、これはすべての場所で​​の既知の振幅を有する膜電位信号を見つけることによって解決することができます。 6軸索で、いくつかの完全に興奮樹状突起のAP信号は、優れた校正標準を提供します。 この方法論の適用における重要なステップは次のとおりです。 <...

<table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネントの名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> セットアップコンポーネント </td></tr><tr><td>正立顕微鏡</td><td>オリンパス株式会社</td><td> BX51WI </td><td> 3つのカメラのポートを持つ</td></tr><tr><td>電動可動ステージ</td><td> Siskiyou </td><td> MXOPi.2 </td><td></td></tr><tr><td>オリンパスBX51用落射蛍光コンデンサー</td><td>フォトニクスTILL </td><td> 0000-560-11659 </td><td></td></tr><tr><td>正立顕微鏡</td><td>カールツァイス、LLC </td><td> AxioExaminer D1は</td><td> 3つのカメラのポートを持つ</td></tr><tr><td>電動トッププレート</td><td> Scientificaリミテッド</td><td> MMBP </td><td></td> &lt;/ TR&gt; <tr><td>ツァイスAxioExaminer用落射蛍光コンデンサー</td><td>フォトニクスTILL </td><td></td><td></td></tr><tr><td>データ·アクイジション·カメラ</td><td> RedShirtImaging LLC </td><td> NeuroCCD-SM </td><td>高速、低読み出しノイズ</td></tr><tr><td> IR-DIC用CCD </td><td> DAGE-MTI </td><td> IR-1000 </td><td></td></tr><tr><td>スピニングディスク共焦点スキャナ</td><td>横河電機</td><td> CSU-10 </td><td></td></tr><tr><td>共焦点スキャナの高空間解像度CCD </td><td> PCO AG </td><td> PixelFly </td><td> 1392x1024ピクセル</td></tr><tr><td> DPSS CWレーザ（波長532nm） </td><td> CNIのオプトエレクトロニクス技術。株式会社</td><td> MLL-III-532 400mWの</td><td>励起光源</td></tr><tr><td>マルチモードファイバランチャー</td><td> Siskiyou </td><td> SM-CFT </td><td></td></tr><tr><td>ライトガイド</td><td>写真TILLのNIC </td><td> 0000-515-11524 </td><td></td></tr><tr><td>シャッター</td><td>ヴィンセント·アソシエイツ</td><td> LS6 </td><td></td></tr><tr><td>防振台</td><td>マイナスKテクノロジー</td><td> MK26 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 特定の試薬 </td></tr><tr><td>ジ-2 - ANEPEQ（JPW 1114） </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> D-6923 </td><td>電位感受性色素</td></tr><tr><td> Crym-EGFPマウスライン</td><td> GENSAT（MMRRC） </td><td>ストックTG（Crym-EGFP）GF82Gsat/Mmcd </td><td>まばらにレイヤ5皮質ニューロンにEGFPを発現する</td></tr></tbody></table>

軸索、樹状突起および脳スライスにおける個々のニューロンの樹状突起棘から電位感受性色素記録

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

生物物理学的特性および単一ニューロンの機能的な組織を理解し、それらがどのように情報を処理する脳がどのように機能するかを理解するための基本です。任意の神経細胞の主な機能は、通常、複数の情報源から、電気信号​​を処理することです。神経突起の電気的特性は、詳細な測定の不存在下で予測することは非常に、複雑でダイナミック、そして、一般的な場合では、不可能である。彼らは活動電位の開始に影響を与えるために特定の場所で神経プロセスと合計する上の原点のサイトから移動する際に、複数のサイトで、サブスレッショルドイベントを一つは、理想的には、監視できるようにしたいと思い、このような測定を得るために。この目標は、電極を用いる測定の技術的制限により、任意のニューロンで達成されていません。この欠点を克服するために、それは大規模な並列recordinを許可するイメージング技術でパッチ電極のアプローチを補完することが非常に望ましいニューロンのすべての部分からのGS。サブミリセカンド、サブマイクロメートルの分解能によって特徴付け-有機電位感受性色素（V メートルイメージング）と膜電位の過渡光記録-ここでは、このような手法を説明します。我々の方法は、電位感受性分子プローブ2の先駆的な研究に基づいています。初期の技術の多くの側面を連続数十3、5、11より改善されてきた。また、前作はV メートルイメージングの二つの本質的な特性を文書化した。まず、蛍光シグナルは、全体の生理的な範囲で膜電位（、10、14、16、100 mVから-100 MV）に直線的に比例します。第二に、ここで使用される電圧感受性色素（JPW 3028）と、ロード·ニューロンは、検出可能な薬理作用を持っていません。色素ローディング中にスパイクの広がり記録、7 4完全に可逆的である。さらに、実験的証拠は、それが得ることが可能であることを示しています前の任意の検出可能な光毒性効果4、6、12、13への録音のかなりの数（最大数百人まで）。現在のところ、我々は、V メートルイメージング技術の感度を最大にするために、最適に近い波長でのレーザ光 ​​源の明るさと優れた安定性を活用しています。現在の感度は軸索と軸索側枝は、端末樹の枝、及び個々の樹状突起棘含むニューロンのすべての部分からV メートル過渡の複数のサイト光学録音を可能にする。信号の相互作用に関する情報が取得された定量的な解析だけでなく、ムービーの形で直接可視化することができます。

成功した共焦点顕微鏡は、スライスの表面に近いとフォーカスの一方の面に配置されている無傷の神経プロセスの明確な識別を可能にするべきである。前電位感受性色素負荷への電圧イメージングに適した神経細胞の選択は非常に重要です。皮質スライス（Crymトランスジェニックマウス系統）にEGFPを発現L5錐体細胞の共焦点画像の例を図2に示します。個々のニューロンの軸索は、はっきりと見える。スライスの表面に近い焦点の一つの面で長い無傷の軸索（白矢印）をもつ細胞を選択した。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4261/4261fig2.jpg" /> 図2：軸索からAP信号のV メートルイメージングのためのL5の皮質ニューロンの選択。同じスライス領域の低い（左）および高い（右）拡大画像;横河電機を使用して488 nmの励起ディスクスキャナをスピニング。 <p class="jove...

サブミクロンの空間とサブミリ秒の時間分解能で膜電位の変化を監視するためのイメージング技術が記載されている。電位感受性色素のレーザー励起に基づく手法では、軸索と軸索側枝、樹枝状の端子、および個々の樹状突起棘における信号の測定が可能です。

単一ニューロンの生物物理学的特性と機能的組織、およびそれらがどのように情報を処理するかを理解することは、…を理解する上で不可欠です。

本実験の全体的な目的は、単一の神経細胞における膜電位信号の統合および情報処理を、ニューロン上の複数の部位からサブマイクロメートルおよびサブミリ秒の解像度で光学的にモニタリングすることです。これは、まず、膜電位の過渡的な変化に対応する光強度のわずかな分率変化を記録できる適切な感度を備えたイメージングセットアップを構築することで達成されます。次に、単一の焦点面内でスライス表面近くに長く無傷な突起を持つ、効果的なイメージングに適した形態のニューロンを選択します。次に、膜電位の変化を光学的に追跡できるよう、あらかじめ選択したニューロンに電位感受性色素を導入します。結果として、軸索、樹状突起、および樹状突起スパインからの膜電位信号をモニタリングすることにより、個々の神経細胞による電気信号統合に関する情報を取得できるという、本アプローチ独自の能力が示されます。細胞神経生理学において。従来の電気生理学には、電極測定の空間分解能が低いこと、および軸索側枝や樹状突起スパインのような微小構造からの記録が不可能であるという2つの長年の限界があるため、新しいツールの開発が進められています。これらの欠点を克服するために、パッチ電極法を光学的手法と組み合わせることで、ニューロンのあらゆる部位から並行して記録することが可能になります。本稿では、単一スパインの分解能で膜電位の一過性変化を多点光学的に記録するこのような手法について説明します。本実験では、正立顕微鏡と3台のカメラを使用して、均一な照明になるよう調整します。まず、レーザー光路に適切なニュートラル密度フィルターを挿入します。次に、標準蛍光スライドの表面に目的レンズの焦点を合わせます。モニター画面上で視野のCCD画像を確認しながら、エピ蛍光コンデンサーの適切なアクチュエータを使用して、石英ライトガイドの受光端およびライトガイドの出力端の位置を調整し、視野の中心に均一な照明が得られるようにします。振動ノイズを測定するには、表面に非蛍光標識がある標準蛍光スライドを使用します。neuro CCDを用いて、連続モードで光強度を記録します。対物レンズを黒いマークの暗いエッジに合わせ、フレームレート2 kHzで約100ミリ秒間、光強度を記録します。次に、均一に照明された領域から光を受けている約20ピクセルと、黒いマークのエッジに沿った約20ピクセルからの、分率光強度トレースの空間平均を表示します。高コントラストのエッジを持つピクセルの空間平均における過剰ノイズは、システム内の振動ノイズを反映しています。シャッターの開放による振動ノイズが光学記録に混入しないよう、メカニカルシャッターは必ず除振台の外側に設置してください。これは極めて重要な手順です。光学記録システムに捉えられる可能性のある音響振動ノイズを低減するため、プラスチック製のネジと除振材を使用してシャッターを固定してください。振動を隔離するために、画像の鋭いエッジ部分を覆うピクセルの振動ノイズがショットノイズよりも小さくなるまで、除振台を調整します。機械的な振動が顕微鏡本体に伝わるのを避けるため、台上の機器の配線には余裕を持たせてください。この手順では、回転円盤共焦点システムを用い、目的の個々の神経細胞にEGFPを発現させたマウス系統を用いて、標準的な手順に従って厚さ 300 to 400 micron の脳切片を準備します。スライス内のEGFP標識ニューロンを可視化します。次に、膜電位イメージングを行うため、樹状突起および軸索の樹状構造が保持されており、突起がスライス表面に平行かつ近接して走行しているニューロンを選択します。その後、約15秒間陰圧をかけることで、ガラスパッチピペットの先端から電極テーパーの3分の2まで、色素を含まない細胞内液を満たします。その後、細胞内液に溶解した膜 IMP 透過性電位感受性色素を含む溶液を電極に充填します。色素を電極に充填してから1分以内に、あらかじめ選択しておいたニューロンにパッチクランプを行います。ピペットをバスに浸す前に、約 10 mmHg の低い正圧をかけます。スライス内で電極を配置する際にこの圧力を維持することで、シールが形成される前に色素が電極から漏れ出すのを防ぐことができます。電極が細胞表面に接触する直前に、圧力を水銀柱100 millimeters of mercury程度の高圧まで上げます。ホールセル構成でシールを形成し、体細胞パッチピペットから細胞体に染料が自由拡散するように20 to 45 minutes間保持します。染料の拡散中、カレントクランプモードで誘発活動電位を記録し、ニューロンの生理学的状態をモニタリングします。さらに、2 kHzのフレームレートで、ニュートラル密度フィルタで調整した最大光強度の数分の一の強度を用いて細胞体からの静止光強度を記録し、染色の程度をモニターします。活動電位の幅が広がり始めるまでダウンロード処理を継続してください。染色終了後、ホールセル構成からアウトサイドアウトパッチ構成へ確実に移行させるため、ボルテージクランプ構成のままパッチピペットを細胞体から慎重に引き離します。次に、電位感受性色素が神経突起まで広がるように、切片を室温でさらに1.5～2時間インキュベートします。十分な量の色素が細胞体から樹状突起および軸索突起へと拡散すると、活動電位の波形が完全に回復します。次のステップでは、低強度の蛍光下で染色されたニューロンの細胞体を特定します。NDフィルターを用いて光強度を下げ、XYステージを使用して目的の物体を可視化するために必要な最小限の強度に調整します。蛍光ニューロンを含むスライス領域をスキャンし、蛍光細胞体を確認します。染色された細胞の細胞体を顕微鏡視野の中心に配置し、DIC下で色素を含まない標準的なパッチ電極を用いてニューロンにパッチクランプを行います。その後、電圧イメージングのため、CCDの連続記録モードを用い、10から40Hzのフレームレートで低強度の蛍光下でニューロン突起を可視化します。XYステージを用いて、イメージング領域の中央に目的の神経突起を配置します。さらに、光力学的損傷を軽減するため、顕微鏡のフィールドストップ・アイリスを部分的に閉じて、SOMAを励起光から保護します。次に、個々の樹状突起分枝における逆伝播活動電位に関連する光学信号を記録します。次に、軸索における活動電位に関連する光学信号を記録します。その後、樹状突起スパインにおける逆伝播活動電位に関連する光学信号を記録します。信号波形を正確に再構成するために、適切なフレームレートを使用してください。同時に、色素の退色と光力学的損傷を最小限に抑えるため、記録期間および高強度励起光への曝露時間は可能な限り短くしてください。ここでは光学信号の記録を示します。上パネルは、記録位置にある軸索を備えた染色済みニューロンの高解像度共焦点画像を示しています。中央のパネルは、膜電位イメージングに使用したCCDで得られた軸索の低空間分解能蛍光画像を示しており、下のパネルは、細胞体からの電極記録、およびA ISおよびrvi結節からの光学記録を示しています。ここでは、生データと処理後の信号が表示されています。この図は、電位感受性色素をロードしたL5皮質ニューロンの軸索からの活動電位信号を示しています。潜在的な関連信号を10 kilohertzのフレームレートで記録しました。これらのトレースは、3つの部位における活動電位のトランジェントを示しています。1つ目は、細胞体から記録した電極によるものです。2つ目は軸索丘からの光学記録、3つ目はfirst node of Ranvierからの光学記録であり、ここにあるのはこれら同じ3箇所からの重ね合わせ信号です。この図は、100 Hzの短時間の脱分極電流パルスによって誘発された、L5皮質ニューロンの樹状突起樹上の複数の部位からの4回の逆伝播活動電位信号のバーストを示しています。ここに示されているのは、個々の樹状突起スパインからの活動電位信号です。こちらが、スピニングディスク共焦点顕微鏡画像のスタックから得られた解剖学的再構築図であり、こちらがCCDカメラで撮影した同一領域の蛍光画像です。膜電位イメージングについて、CCD画像に示された位置1から3における逆伝播活動電位に対応する蛍光強度トレースを右パネルに示します。最下段のトレースは、細胞体から記録した電極のデータを示しています。記録前の準備には、ダイスの遠位突起への拡散待ち時間を含め、約3時間かかります。記録時間は、標本の通常の劣化およびPO光力学的損傷によって制限されます。光力学的損傷の程度は、励起光の強度、ならびに個々の記録試行の持続時間と回数に比例します。実験によっては、1〜2時間で50回以上の記録試行を行うことが可能です。一方で、高い励起や光強度を必要とする測定や、より長い記録時間を要する測定では、光力学的損傷によって記録試行回数が数回に制限される場合があります。このビデオを視聴することで、脳切片中の個々のニューロンにおいて、軸索および終末構造全体から電圧イメージングを行う方法を十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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電圧感受性染料を用いた脳スライスの再現性と安定した光学記録法をご紹介します。この記事では、従来の海馬スライス製剤を用いた光信号の電圧感受性染料染色と記録について説明する。...

電圧感受性染料を用いた脳スライスにおける広視野単一光子光学記録

脳スライスにおける求心性経路の光遺伝学的活性化と揮発性麻酔薬による応答の調節

学ぶ 電位感受性色素を用いた脳スライス中の個々ニューロンの軸索・樹状突起・樹状突起棘からの膜電位変化の高解像度光学記録法。この手法により神経細胞の電気信号統合を詳細に解析できる。

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