軸索、樹状突起および脳スライスにおける個々のニューロンの樹状突起棘から電位感受性色素記録

記載されている実験の全体的な目標は、ニューロン上の複数のサイトからのサブマイクロメートルおよびサブミリ秒の分解能で、個々の神経細胞による膜電位シグナル統合および情報処理を光学的に監視することです。これは、まず、膜電位過渡に対応する光強度のわずかなフラクショナル変化を記録できるように、適切な感度のイメージングセットアップを構築することによって達成されます。次に、スライスの表面に近い単一の焦点面に長い無傷の突起を持つニューロンを効果的にイメージングするための適切な解剖学的構造を持つニューロンを選択します。

次に、事前に選択したニューロンに電位感受性色素をロードして、膜電位変化の光学的追跡を可能にします。結果は、軸索、樹状突起、および樹状突起スパインからの膜電位シグナルをモニタリングすることにより、個々の神経細胞による電気信号統合に関する情報を取得するこのアプローチのユニークな能力を示しています。細胞神経生理学。

従来の電気生理学の長年にわたる2つの制限、電極測定の空間分解能の低さ、および軸索側副腎や樹状突起スパインなどの小さな構造からの記録ができないため、新しいツールが開発されています。これらの欠点を克服するために、パッチ電極アプローチは、ニューロンのすべての部分からの並列記録を可能にする光学技術と組み合わせることができます。ここでは、そのような技術、単一のスパイン分解能で膜電位過渡現象の多面光学記録について説明します。

この実験では、正立顕微鏡と3台のカメラを使用して、照明が均一になるように調整します。まず、レーザービーム経路に適切な減光フィルターを挿入します。次に、対物レンズを標準的な蛍光スライドの表面に合わせます。

モニター画面上の視野のCCD画像を観察しながら、落射蛍光コンデンサーの適切なアクチュエーターを使用して、視野の中心に均一に照らされるように、クォーツライトガイドの受信端の位置とライトガイドの出力端の位置を調整します。振動ノイズを特定するには、表面に非蛍光マークが付けられた標準の蛍光スライドを使用します。ニューロCCDを連続モードで光強度を記録します。

ブラックマークの暗い端に対物レンズを合わせ、2キロヘルツのフレームレートで約100ミリ秒の光強度を記録します。次に、均一に照らされた領域から光を受ける約 20 ピクセルと、ブラック マークの端に沿って約 20 ピクセルから、フラクショナル ライト強度トレースの空間平均を表示します。コントラストの高いエッジを持つピクセルからの空間平均の過剰なノイズは、システム内の振動ノイズを反映しています。

光学記録では、シャッターの開口部が振動ノイズをもたらさないように、メカニカルシャッターを防振テーブルから離して取り付けることが不可欠です。これは重要なステップです。シャッターはプラスチックネジと防振材を使用して取り付け、光記録システムが拾う可能性のある音響振動ノイズを低減します。

振動を分離するには、画像の鋭いエッジを覆うピクセルの振動ノイズがショットノイズよりも小さくなるまで、振動分離テーブルを調整します。テーブル上の機器のワイヤーは、機械的な振動が顕微鏡スコープに伝わらないように緩めておく必要があります。この手順では、標準的な手順に従って、スピニングディスク共焦点システムを使用して、目的の個々の神経細胞でEGFPを発現するマウスラインを使用して、300〜400ミクロンの厚さの脳スライスを準備します。

スライス内のEGFP標識ニューロンを可視化します。次に、無傷の樹状突起軸索木を持ち、膜電位イメージングのためにスライスの表面に平行に近く進行する突起を持つニューロンを選択します。次に、先端からガラスパッチピペットに、約15秒間陰圧を加えて、電極テーパーの最大3分の2まで色素を含まない細胞内溶液を充填します。

その後、細胞内溶液に溶解した膜IMP透過性電圧感受性色素を含む溶液を電極に埋め戻します。次に、色素を電極にロードしてから1分以内に、以前に選択したニューロンにパッチを適用します。ピペットを槽に降ろす前に約10mm水銀柱を低圧で印加し、電極をスライスに配置しながら、シールが確立される前に電極から染料が漏れないようにします。

電極が細胞表面に接触する直前に、水銀柱の約100ミリメートルを高圧に増やします。全細胞構成でシールを確立し、体細胞パッチピペットから体細胞への色素の自由拡散を20〜45分間可能にする。染色拡散中は、電流クランプモードで誘発された活動電位を記録することにより、ニューロンの生理学的状態を監視します。

さらに、細胞体からの静止光強度を2キロヘルツのフレームレートで記録し、NDフィルターで調整した全光強度の一部で染色量をモニターします。活動電位が広がり始めるまで、ダウンロードプロセスを続けます。染色の最後に、パッチピペットを電圧クランプ構成の体細胞から慎重に引き離し、プロセス全体からアウトサイドアウトパッチ構成への移行がプロセスで達成

次に、Sはスライスを室温でさらに1.5〜2時間インキュベートして、電位感受性色素がニューロンプロセスに広がるようにします。かなりの量の色素が体細胞から樹状突起および軸索突起に拡散した後、活動電位の波形は完全に回復するはずです。次のステップでは、低強度蛍光下で染色ニューロンの体細胞を見つけます。

XYステージを使用して目的のオブジェクトを視覚化するために必要な最小限に減らし、蛍光体細胞が特定されるまで蛍光ニューロンを含むスライスの領域をスキャンします。染色した細胞の体細胞を顕微鏡フィールドの中央に配置し、DICの下に色素を含まない標準的なパッチ電極でニューロンを切断します。次に、電圧イメージング用のCCDの連続記録モードで、10〜40ヘルツのフレームレートで低強度蛍光下でのニューロンプロセスを視覚化します。

XYステージ位置を使用して、イメージング領域の中央に関心のあるニューロンプロセス。さらに、顕微鏡の部分的に閉じたフィールドストップアイリスを使用してSOMAを励起光から保護し、光力学的損傷を軽減します。次に、個々の樹状突起枝の逆伝播活動電位に関連する光信号を記録します。

次に、軸索の活動電位に関連する光信号を記録します。その後、樹状突起スパインの逆伝播活動電位に関連する光信号を記録します。信号波形を正確に再構成するには、適切なフレームレートを使用してください。

同時に、色素の漂白や光線力学によるダメージを最小限に抑えるために、記録時間や高強度の励起光への曝露をできるだけ短くしてください。光信号の記録を示します。ここは。上のパネルは、軸索が記録位置にあった染色されたニューロンの高解像度共焦点画像を示しています。

中央のパネルは、膜電位イメージングに用いたCCDによって得られた軸索の低空間分解能蛍光画像を示し、下のパネルは体細胞からの電極記録とA ISおよびrviノードからの光学記録を示しています。生データと処理された信号が表示されます。この図は、電位感受性色素作用が負荷されたL 5皮質ニューロンの軸索からの活動電位信号を示しています。

電位関連の信号は、10キロヘルツのフレームレートで記録されました。これらのトレースは、3つの位置からの活動電位過渡を示しています。1つは、体細胞からの電極記録。

2つは軸索ヒロックからの光学記録、3つはvieの最初の音からの光学記録であり、ここには同じ3つの場所からの重ね合わせ信号があります。この図は、100ヘルツの短い脱分極電流パルスによって開始されたL5皮質ニューロンの樹状突起上の複数の位置からの4つの逆伝播活動電位信号のバーストを示しています。ここに示されているのは、個々の樹状突起スパインからの活動電位信号です。

これは、回転する円盤の共焦点画像のスタックから得られた解剖学的再構成であり、これはCCDカメラで得られた同じ領域の蛍光画像です。膜電位イメージングでは、CCD画像で概説されている位置1から3までの逆伝播作用電位に対応する蛍光強度トレースを右パネルに示します。下のトレースは、体細胞からの電極記録を示しています。

事前収録の準備には、サイコロが遠位の突起に広がるまでの待ち時間を含めて約3時間かかります。記録時間は、調製物の通常のランダウンとPOフォトダイナミック損傷によって制限されます。光力学的な損傷の量は、励起光の強度、および個々の記録試行の期間と回数に比例します。

一部の実験では、1時間または2時間で50回以上の記録試行を行うことが可能です。他の測定では、高い励起、光強度、およびより長い記録が必要であり、光力学的損傷によって数回の記録試行のみに制限されます。このビデオを見れば、脳スライスの個々のニューロンの軸索構造全体と終末構造から電圧イメージングを行う方法についてよく理解できるはずです。