腫瘍細胞の浸潤を間質液流れに及ぼす影響を測定するための三次元細胞培養モデル

この手順の目的は、3Dで培養した細胞を間質液の流れにさらし、細胞浸潤に対する流れを介した影響を定量化することです。これは、最初に1型コラーゲンとマトリゲルからなるゲル溶液を調製することによって達成されます。2番目のステップは、ゲル溶液に指定された濃度の細胞を添加することです。

次に、細胞懸濁液を直径12ミリメートル、孔径8ミクロンのトランズウェルに添加し、マトリックスがゲル化するまで摂氏37度でインキュベートします。アッセイセットアップの最後のステップは、特定の量の培地をトランズウェルに追加して、静的および流動条件を作成することです。24時間後、トランスウェルメンブレンは固定され、染色され、浸潤した細胞の数を定量化するために視覚化されます。

この手法は、マイクロ流体、間質フローチャンバーなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、ポンプや特殊な機器を必要とせず、研究者が複数の条件や治療を簡単かつ迅速にテストできることです。この方法は、細胞の移動と浸潤に関する洞察を提供しますが、タンパク質発現、細胞増殖、細胞シグナル伝達の変化など、他の関連する細胞挙動に対する間質液の流れの影響を研究するために使用または適用することもできます。この手順を実証するのは、LIMA two chaaです。

私の研究室の大学院生 この手順は、摂氏4度の氷の上にマトリジェルの小さなアリコートを投げることから始めます。次に、PBS滅菌水、水酸化ナトリウム、マトリゲル、およびラットテール1型コラーゲンを使用してゲルレシピを準備します。次に、ゲルの成分を氷上で同じ順序で混合し、最終溶液を摂氏4度で1時間インキュベートします。

次に、滅菌した一対の鉗子を使用して、直径12 mmの8マイクロPO細胞培養インサートを12ウェルプレートに入れます。次に、細胞をカウントし、無血清培地に10倍で1ミリリットルあたり6細胞に再懸濁し、900マイクロリットルのゲル溶液に100マイクロリットルの細胞懸濁液を添加します。その後、ピペッティングで優しく上下させてよく混ぜます。

続いて、各インサートに150マイクロリットルの最終混合物を追加します。次に、ゲルが重合するまで、インサートを摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターに30分間移します。静的な状態では、ゲルの上に100マイクロリットルの無血清培地を追加し、インサートの下に1,200マイクロリットルを追加します。

ウェル内のインサートの内側と外側の液面はほぼ等しく、ゲル全体の圧力差が最小限に抑えられ、間流がなくなります。流動条件では、インサートの下に100マイクロリットルの無血清培地を追加し、ゲルの上に650マイクロリットルを追加します。同時に、インサートの下に気泡が生じないようにしてください。気泡は、これらの場所で細胞が膜を通過するのを防ぎます。

次に、プレートを摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターに24時間置きます。このステップでは、インサートを洗浄するための新しい24ウェルプレートに、ウェルあたりPBSの1倍の500マイクロリットルを追加します。次に、フロートレンドウェルの上部に残っている培地を取り出します。

次に、綿棒を使用してインサートからゲルを取り除きます。非VA細胞を除去するために、メンブレンの表面の上部を拭きます。次に、インサートをPBSの1倍を含む24ウェルプレートに15秒間入れて洗浄します。

その後、PBSを取り外し、各インサートの下に500マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドを追加します。室温で30分間インキュベートし、トランス移動細胞を固定します。次に、PFAを除去し、500マイクロリットルにPBSを1回回すすぎ、残留固定剤を除去します。

次に、インサートの下に500マイクロリットルの0.5%Triton X 100溶液を加え、室温で10分間インキュベートします。細胞を透過するには、カミソリの刃を使用してインサートから膜を切り取ります。次に、それらを1倍のPBS溶液に1ミリリットルあたり2マイクログラムのDPIの100マイクロリットルに入れます。

メンブレンの下側を下に向けて配置するように注意してください。DPI溶液は、使用の数分前に調製し、暗所に保管する必要があります。次に、プレートをアルミホイルで包みます。

150 RPMのシェーカーに常温で30分間置きます。次に、メンブレンを500マイクロリットルでPBSを1回洗い、シェーカーに10分間戻します。フリージェイを取り除くには、洗濯をさらに2回繰り返します。

次のステップは、トランス移動した細胞を上に向けてスライドガラス上にメンブレンを置くことです。メンブレンに埋込液を添加します。次に、カバースリップでそれらを覆います。

その後、核へのダッピー染色をカウントし、添付の原稿に従って侵入した細胞の数を計算します。この図は、メンブレン上にトランス移行したMDA MB 4 35 s細胞を示しています。浸潤した細胞は、間質液流浸潤アッセイ後に固定し、DPIおよびAlexa Fluor 4 88標識フォイドで染色して、浸潤細胞のカウントを容易にしました。

これが明視野の下の膜で、これがダサい汚れの核です。Fアクチンで染色したAlexa Fluor 4 88 foidをここに示します。このグラフは、MDA MB 4 35 s転移性黒色腫細胞の浸潤が間質流によって有意に増強されたことを示している。

24時間後、結果は静的浸潤条件の平均に正規化され、6つの細胞培養インサートからの平均が表示されます。条件間の差は、P 値が 0.003 で統計的に有意です。習得すると、間質液フローアッセイを2時間でセットアップでき、その後24時間のインキュベーション、その後2時間で形質転換膜の固定と染色を行うことができます。

この手順に従うと、細胞、タンパク質、または核酸を簡単に抽出して、間質液の流れに応答して遺伝子やタンパク質の発現がどのように変化するかなどの追加の質問に答えることができます。開発以来、これは間質流ががん細胞に及ぼす影響を研究する研究者にとって不可欠なアッセイとなっています。