Name: 腫瘍細胞の浸潤を間質液流れに及ぼす影響を測定するための三次元細胞培養モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 学ぶ三次元細胞培養モデルを用いて間質液流れが腫瘍細胞の浸潤に及ぼす影響を定量化する方法。コラーゲンとマトリゲルを使用したゲル調製とトランスウェル技術により、がん研究における腫瘍微小環境の理解を深めることが可能です。

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1。アッセイセットアップ<ol><li> 4℃（約2時間）で氷の上でマトリゲルの小アリコート（&lt;500μl）を解凍します。 </li><li>ゲルのレシピ（下の表に例のボリュームを参照してください）​​準備：10倍PBS（総量で1×）、1N水酸化ナトリウム（追加されたコラーゲンの0.023ボリュームと同等、またはコラーゲンの製造業者の推奨に従って、必要に応じて）、マトリゲルとコラーゲンにIを入力します。に1 mg / mlとそれぞれ1.3 mg / mlの最終濃度（他のマトリックス製剤は細胞の種類や実験に応じて使用されるかもしれません）。 </li></ol> 例のゲルのレシピ <table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> ストック濃度 </td><td> 最終濃度 </td><td> ボリュームを加える </td></tr><tr><td> 10×PBS </td><td> 10X </td><td> 1X </td><td> 0.090ミリリットル</td></tr><tr><td>滅菌水</td><td></td><td></td><td> 0.346ミリリットル</td></tr><tr><td> 1NのNaOH </td><td></td><td></td><td> 0.008ミリリットル</td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td> 9.90 mg / mlの</td><td> 1 mg / mlの</td><td> 0.101ミリリットル</td></tr><tr><td>ラット尾I型コラーゲン</td><td> 3.66 mg / mlの</td><td> 1.3 mg / mlの</td><td> 0.355ミリリットル</td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> 4℃で1時間上記のようにインキュベートし、最終的なソリューションと同じ順序で氷の上でゲルのコンポーネントを混在させる我々の経験では、コラーゲンのより均一なゲル化における細胞播種の結果の前に1時間インキュベーション。すべての回で氷の上でマトリゲルやコラーゲンを維持するとゲル化を防ぐためにできるだけ速く動作することを確認してください。 </li><li>滅菌ピンセットを用いて12ウェルプレートに配置する12ミリメートルの直径8μmの孔の細胞培養挿入します。 </li><li> 5×10 6細胞/ ml（総ボリュームはゲル溶液の10％でなければなりません）で無血清培地で細胞を再懸濁しをカウントします。 </li><li>細胞のSUの100μlを加えゲル溶液900μL（最終細胞濃度5×10 5細胞/ ml）にspensionと上下に穏やかにピペッティングにより混和します。 </li><li>ゲルが重合されるまで30分間、37℃、5％CO 2インキュベーターにそれぞれ挿入し、転送に最終混合物を150μlのを追加します。 </li><li>無血清培地を使用して、 </li></ol><ul><li>ゲルの上に100μlと静止状態のインサート下の1200を添加する。井の中の挿入および外側内の流体のレベルは、ゲル間の最小限の圧力差としない間流れの中で、その結果、ほぼ等しくなければなりません。 </li><li> FLOW条件のゲル上での挿入、650μlの下に100μlを添加します。彼らはこれらの場所では膜を通って移行するから細胞を防ぐことができますように、インサートの下に気泡を避けるように注意してください。これらのボリュームによって生成された圧力差は約1.3 CM H 2 O（または1ミリメートルHg）である。 </li></ul><ol start="9"><li> 37にプレートを置きます°C、24時間、5％CO 2インキュベーター。 </li></ol> 2。細胞は、染色と計数<ol><li> 500の1X PBSを添加ウェルあたりに新しい24ウェルプレートを追加し、これはインサートを洗うために使用されます。 </li><li>フローのトランスウェルの上部に残っている培地を除去し、ボリュームを決定します。もともとは、650μlを（これは下記を参照してください、流量の計算に使用されます）追加された合計ボリュームから、残りのボリュームを差し引くことにより、総溶出体積を計算します。インサートからゲルを削除するには、非浸潤細胞を除去するために膜の最表面を拭くために綿棒を使用しています。インサートを洗うために15秒間の1X PBSを含む24ウェルプレートへの挿入を配置します。 </li><li> PBSを除去し、各インサートの下に4％パラホルムアルデヒド（PFA）500μlを追加して、転生細胞を固定し、室温で30分間インキュベートします。 </li><li> PFAを削除し、残留固定を削除するには、500μlの1X PBSで一回すすいでください。 </li><li> 500μlのoを追加するfを0.5％トリトンX-100に挿入下に解決し、細胞を透過処理するために室温で10分間インキュベートします。 </li><li> （転生細胞が下向き）膜面の下側を下に置くように注意して、1X PBS溶液中で2μg/ mlのDAPIの100μl中にカミソリの刃と場所を使用して、インサートの膜を切り取ります。 </li><li>室温で30分間150rpmでシェーカー上にアルミ箔と場所のプレートをラップします。 </li><li>無料のDAPIを削除するには、シェーカー（リピート10分ごとに3回）に500μlの1X PBSで膜を洗浄します。 </li><li>上向きに転生細胞を用いたスライドガラスの上に置き膜は、マウントソリューションとカバースリップを追加します。 </li></ol> 3。データ解析<ol><li>各膜の5ランダムに選択された場所（端から離れて滞在し、10倍または20倍の対物レンズを使用）にDAPIで染色した核をカウントします。 </li><li>平均細胞数を計算し、以下の式を使用して、パーセントの浸潤を取得します。 パーセント侵略= 100％×（平均細胞数xの膜面積）/（細胞播種の顕微鏡画像のx番号の表面積） パーセントの浸潤は独立した実験間の比較を可能にするためにいくつかの制御条件（通常は静的な状態）に正規化することができます。 </li><li>平均流速を計算します。インキュベーション時間（例えば24時間）することによって、フロー状態の総溶出ボリュームを分割します。 </li><li>平均流速を計算します。ゲル/メンブレン（このケースでは60ミリメートル2）の断面積で平均流量を分割します。 </li></ol> 4。代表的な結果間流の下で腫瘍細胞の浸潤を測定するために、我々は、MDA-MB-435S転移性悪性黒色腫細胞を用いた我々の3次元流れの浸潤アッセイを行った。これらの細胞は、以前に間質液の流れ13から14に対応して侵入することが示されている。細胞は、1.3 mg / mlのラット太極拳からなるマトリックスに埋め込まれていたlの腱のコラーゲンI型および5×10 5細胞/ mlの最終細胞濃度が1 mg / mlのマトリゲル基底膜マトリックス。二つの異なる条件を比較した：（1）平均的な間隙流量= 0.1μmのs -1の（2）静的状態= noを測定可能な流量（ 図1）。 24時間後、膜の孔を通って侵入した細胞は、細胞計数を容易にするためにDAPIで染色した。 図2は、浸潤細胞の代表的なイメージを示しています。視野の下で、膜の孔のみが表示されています。蛍光を使用して、DAPI染色した核が細胞計数のために使用されたとファロイジン染色されたF-アクチンの構造は、細胞体（オプション）を可視化するために使用された。等分散を仮定し、スチューデントのt検定を用いて、我々はその間隙流れが大幅に静的な条件で2.3倍でMDA-MB-435S細胞浸潤（P = 0.003）（ 図3）が増加した。このcorroboraこの細胞株13から14を使用して同様の所見を（ただし、別の行列の条件、したがって、流速を含む）tesの。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig1.jpg" /> 図1 3-D間質液の流れ浸潤アッセイの模式図。最初に適切な濃度とボリュームを使用してゲル溶液を準備します。その後ゲル溶液にセルを追加し、細胞培養インサートに転送されます。最後に、各条件にメディアの適切な量を追加し、インキュベートします。間質液の流れが流体圧力ヘッドによって駆動されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig2.jpg" /> 図2膜上のMDA-MB-435S細胞を転生。細胞が浸潤細胞のカウントを容易にするためにDAPIおよびAlexa Fluor 488標識ファロイジンで私たちの間質液の流れ浸潤アッセイで染色した後に修正された侵略、明視野下の膜の）写真は、B）DAPI STAINED核（青）、C）のAlexa Fluor®488ファロイジン（緑色）F-アクチン染色した。スケールバーは50μmを表す。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig3.jpg" /> 図3は、フローの下でMDA-MB-435S細胞の浸潤を増加しました。 24時間後の細胞の浸潤が有意に間流れた（p = 0.003）によって強化されています。結果は、平均的な静的な状態に正規化され、値は6セルカルチャーインサートの平均±SEMを表しています。

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<li>Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+type+IV+procollagen%2C+laminin%2C+and+heparan+sulfate+proteoglycan+from+the+EHS+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma.</a> Biochemistry. 21, 6188-6193 (1982).</li>
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<li>Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+flow+influences+direction+of+tumor+cell+migration+through+competing+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

ここでは、細胞培養インサート内の3-Dマトリックス中に埋め込まれた細胞を用いて、腫瘍細胞の浸潤の間の流れの影響を定量化する方法を説明してきました。これと同様の方法は、細胞の種類13-15、17のさまざまな格子フローの効果を調べるために使用されている。我々のアプローチは、部分的にI型コラーゲンおよび上皮組織と周囲の間質21から22の基底膜に見られる蛋白質を含むマトリゲルを使用することによって腫瘍の行列微小環境を模倣しています。このシステムは、in vitroで 23から24 の間質液の流れを研究するために使用されているほとんどのマイクロ流体デバイスをより効果的な、単純な、そしてより多くのコストアップを設定することは比較的簡単です。それは、ポンプや特殊な機器を必要とし、同時にテストする、複数の条件を可能にすることはありません。さらに、測定は一般的に侵入し、マイグレーをテストするために使用される既存のBoydenチャンバーアッセイのものと同等である癌細胞のる。 細胞型とマトリックスの組成...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>コラーゲン（ラットテール） </td><td> BD </td><td> 354236 </td><td>無菌に保つ</td></tr><tr><td> Millicellセルカルチャーインサート</td><td>ミリポア</td><td> PI8P01250 </td><td> 8μmの孔径、ポリカーボネート膜</td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td> BD </td><td> 354234 </td><td>無菌に保つ</td></tr><tr><td> PBS </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 100M-8202 </td><td>洗浄ステップのためにゲル溶液、1xを調製するための10倍</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム、1.0Nソリューション</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S2770 </td><td>無菌に保つ</td></tr><tr><td> DMEM 1X </td><td> CellGro </td><td> 10から013-CV </td><td>無菌に保つ</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>アトランタバイオ</td><td> 511150 </td><td>無菌に保つ</td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン</td><td> CellGro </td><td> 30002CI </td><td>無菌に保つ</td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> X100-500ミリリットル</td><td> PBS中の0.5％ </td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 04042-500 </td><td> PBS中4％ </td></tr><tr><td>脱イオン水</td><td></td><td></td><td>無菌に保つ</td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diaminido -2 - フェニルインドール（DAPI） </td><td> MPのバイオメディカル</td><td> 0215757401 </td><td> 1 mg / mlのストック溶液</td></tr><tr><td>マウントソリューション</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> TA-030-FM </td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA </td><td> CellGro </td><td> 25から052-CI </td><td>無菌に保つ</td></tr></tbody> &lt;/ TABLE&gt;

腫瘍細胞の浸潤を間質液流れに及ぼす影響を測定するための三次元細胞培養モデル

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

ほとんどの固形腫瘍の増殖と進行は、癌細胞と間質に関連した腫瘍微小環境1でシグナルへの応答の最初の変換に依存しています。以前に、腫瘍の微小環境の研究は主に腫瘍間質相互作用の1から2に焦点を当てている。しかし、腫瘍の微小環境にも影響をよくわかっていないまま生物物理学的勢力が多数含まれています。これらの力は、遺伝子発現の変化、細胞分裂、分化、浸潤3につながる腫瘍増殖の生体力学的な結果である。行列の密度4、剛性5-6、および構造6-7、間質液圧8、間質液の流れ8はすべての癌の進行中に変更されています。 特に間質液の流れが正常組織8-10に比べ腫瘍で高くなっています。推定間質液のFLフロー速度を測定し、腫瘍の大きさと分化9、11に応じて、0.1から3ミクロンs -1の範囲内であることがわかった。これは、腫瘍血管新生と血管透過性の増大12に起因する間質液圧の上昇によるものです。間質液の流れが癌細胞の浸潤13-14、血管の線維芽細胞と平滑筋細胞15を増加させることが示されている。この侵略は3-D 16でセルの周囲に作成またはマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）の発現15、ケモカインの分泌と細胞接着分子の発現17日増加した自己走勾配に起因することがあります。しかし、細胞は流体の流れを感知するメカニズムはよく理解されていません。腫瘍細胞の挙動を変更することに加え、間質液の流れが腫瘍微小環境内の他の細胞の活性を調節する。それは（）腫瘍促進myofibrに線維芽細胞の分化を駆動するに関連付けられていますoblasts 18、（b）の抗原とリンパ節19、及び（c）変調リンパ内皮細胞の形態20に他の可溶性因子の輸送。 ここで紹介する手法は、in vitroでの細胞の間質液の流れを課し、浸潤（ 図1）に及ぼす影響を定量化します。このメソッドは、間質と癌細胞の浸潤13-15、17日に流体の流れの効果を測定するために、複数の研究では公開されています。マトリックス組成物、細胞型、細胞濃度を変えることによって、このメソッドは、他の病気や浸潤、分化、増殖、遺伝子発現などの細胞プロセスの間の流れの影響を研究する生理学的システムに適用することができます。

間質液の流れが固形腫瘍で上昇し、腫瘍細胞の浸潤を調節することができる。ここでは、マトリックス中に埋め込まれた細胞に間質液の流れを適用し、細胞浸潤に及ぼす影響を測定する手法を説明します。このテクニックは簡単に他のシステムを研究するために適応させることができます。

ほとんどの固形腫瘍の増殖と進行は、がん細胞の初期の形質転換および、ストロマ（間質）に関連するシグナル伝達に対する応答に依存している。

本手順の目的は、3D培養された細胞を間質液流にさらし、細胞浸潤に対する流体介在性の影響を定量化することです。まず、1型コラーゲンとMatrigelからなるゲル溶液を調製します。次に、規定濃度の細胞をゲル溶液に添加します。次に、細胞懸濁液を直径12 mm、孔径8 µmのトランスウェルに加え、マトリックスがゲル化するまで37 °Cでインキュベートします。アッセイセットアップの最終ステップとして、静止条件およびフロー条件を作成するために、規定量の培地をトランスウェルに加えます。24時間後、トランスウェル膜を固定し、染色して可視化し、浸潤細胞数を定量します。マイクロ流体デバイスや間質流チャンバーなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、ポンプや特殊な装置を必要とせず、研究者が複数の条件や処理を容易かつ迅速に検証できる点にあります。本手法は細胞の遊走や浸潤に関する知見を提供できるだけでなく、タンパク質発現、細胞増殖、細胞シグナル伝達の変化など、他の関連する細胞挙動に対する間質液流の影響を研究するためにも利用または適用することが可能です。本手順の提示にはLIMA two chaaを用います。私の研究室の大学院生が、4 °Cの氷上でMatrigelの少量を分注することからこの手順を開始します。次に、PBS滅菌水、水酸化ナトリウム、Matrigel、およびラット尾由来 type I collagenを用いてゲルの処方を調製します。その後、氷上でこれらのゲル構成成分を同じ順序で混合し、最終溶液を4 °Cで1時間インキュベートします。次に、滅菌済みのピンセットを用いて、直径12 mmの8 µポセル培養インサートを12ウェルプレートに配置します。その後、細胞数を計測し、無血清培地で5×10⁶ cells/mLの濃度に再懸濁させ、細胞懸濁液100 µLをゲル溶液900 µLに加えます。その後、ピぺッティングで静かに上下に混ぜ合わせ、十分に混合させます。続いて、最終混合液を150 µLずつ各インサートに加えます。その後、ゲルが重合するまで、インサートを37 °C、5% CO2 インキュベーター内で30分間静置します。静止条件下では、ゲルの上に無血清培地を100 µL、インサートの下に1,200 µL加えます。ウェル内のインサートの内外の液量はほぼ等しくし、ゲル全体の圧力差を最小限に抑え、間質流が生じないようにします。流動条件にする場合は、インサートの下に100 µL、ゲルの上に650 µLの無血清培地を添加してください。その際、インサートの下に気泡が入らないように注意してください。気泡があると、その部分で細胞がメンブレンを通過して遊走できなくなります。その後、プレートを37 °C、5% CO2インキュベーターに24時間置きます。このステップでは、インサートを洗浄するため、新しい24ウェルプレートの各ウェルに1× PBSを500 µLずつ加えます。次に、フロートレンドウェルの上部に残っている培地を除去します。次に、綿棒を用いてインサートからゲルを除去します。膜の表面上部を拭き取り、非VA細胞を除去してください。その後、1×PBSが入った24ウェルプレートにインサートを15秒間浸し、洗浄します。その後、PBSを除去し、各インサートの下に4%パラホルムアルデヒドを500 µL加えます。透過移動した細胞を固定するため、室温で30分間インキュベートします。次に、PFAを除去し、500 µLのPBSで1回洗浄して、残留した固定液を取り除きます。次に、インサートの下に0.5% Triton X 100溶液を500 µL加え、室温で10分間インキュベートします。細胞を透過させるため、カミソリを使用してインサートからメンブレンを切り出します。その後、1× PBS溶液に溶解した2 mg/mL DPI 100 µLの中にメンブレンを入れます。メンブレンの下面を下に向け、慎重に配置します。DPI溶液は使用の数分前に調製し、遮光保存してください。次に、プレートをアルミホイルで包みます。これをシェーカーに載せ、室温で 150 RPM で 30 分間振盪します。次に、メンブレンを 500 µL の PBS で 1 回洗浄し、再びシェーカーで 10 分間振盪します。遊離した jy を除去するため、この洗浄操作をさらに 2 回繰り返します。次のステップでは、膜をガラススライドの上に、透過した細胞が上を向くように配置します。膜に封入剤を滴下します。その後、カバーガラスで覆います。その後、核に対するDAPI染色の数を数え、付属の原稿に従って浸潤細胞数を算出します。この図は、メンブレン上の経細胞移動したMDA-MB-435S細胞を示しています。浸潤細胞は、間質液流浸潤アッセイ後に固定され、浸潤細胞のカウントを容易にするためにDPIおよびAlexa Fluor 488結合フィブロネクチンで染色されました。こちらは明視野下の膜であり、ここにDAPI染色された核が示されています。Alexa Fluor 488 phalloidinで染色されたF actinをここに示します。このグラフは、MDA-MB-435転移性メラノーマ細胞の浸潤が、間質流によって有意に促進されたことを示しています。24時間後、結果を静止浸潤条件の平均値で正規化し、6つの細胞培養インサートの平均値を提示します。条件間の差は、P値0.003で統計的に有意です。習熟すれば、間質液流アッセイは2時間でセットアップでき、その後24時間のインキュベーションを行い、さらに2時間でトランスウェル膜の固定および染色を行うことができます。この手順に従うことで、細胞、タンパク質、または核酸を容易に抽出でき、間質液流に反応して遺伝子およびタンパク質の発現がどのように変化するかといった追加の疑問を検証することが可能です。開発以来、本法は間質流ががん細胞に及ぼす影響を研究する研究者にとって不可欠なアッセイとなっています。

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