DNA損傷応答タンパク質の2次元および3次元生細胞イメージング

このデモンストレーションでは、2Dおよび3Dのライブセルイメージングを使用して、DNA損傷応答に関与するタンパク質の空間的な時間的関係を理解します。まず、選択した細胞株に適切な蛍光マーカーを含む発現コンストラクトをトランスフェクションまたは形質導入します。ここで、M CherryとGFPは次に、通常の条件下で蛍光標識された細胞を示す一連のコントロールビデオを取得します。

次に、適切な処理を適用し、蛍光細胞に対する処理効果のデータを取得し、タンパク質の空間的時間的関係についてビデオデータを分析します。最終的に、生細胞蛍光顕微鏡は、DNA損傷物質に応答した53 BPの病巣の形成や、有糸分裂中の53 BPの行動など、細胞のダイナミクスを詳細に説明することができます。私たちが最初に2Dおよび3Dライフスタイルイメージングに興味を持ったのは、さまざまな治療が特定の細胞株の有糸分裂にどのように影響するかを研究したいと思ったときでした。

この実験的アプローチにより、DNA損傷応答とゲノム安定性の維持を従来の方法よりも簡単に研究することができます。さらに、この方法を使用して、特定のタンパク質がさまざまなシグナル伝達経路やさまざまな細胞株でどのように相互作用するかを研究することができます。細胞化学などの従来の技術に対するライフスタイルイメージングの主な利点は、DNA損傷応答タンパク質をリアルタイムで研究できることです。

適切な録音条件を最適化することは困難な場合があります。このデモは、成功を確実にするために必要な多くの小さな手順を確認するために使用できます。写真の漂白を最小限に抑え、適切な記録間隔と適切な記録時間の長さを見つけるには、粘り強さが報われることを忘れないでください。

適切な細胞株にプラスミドをトランスフェクションまたは形質導入し、mCherryおよびGFP融合タンパク質を発現します。薬剤選択下で培養物を維持し、画像取得の前日に蛍光タンパク質の発現を定期的にチェックします。トリプシンを使用して細胞を採取します。

次に、低密度培養物を3.5cmのフルオロ皿ガラスの底板に播種します。このプロトコルは、アクシオオブザーバーZ one standを装備したZeissセルオブザーバーSDスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して開発されましたまず、CO2ガスがインキュベーションシステムのCO2モジュールに流れていることを確認します。顕微鏡が防振Airtableでサポートされている場合は、Airtableの空気供給をオンにします。

次に、顕微鏡スタンドの回転ディスクユニットカメラ、インキュベーションモジュール、HXPイルミネーター、電動ステージ、アルゴンレーザー、およびコンピューターの電源をオンにします。使用するレーザーラインのスイッチをONにします。Axio ビジョンソフトウェアを起動します。

Avisionソフトウェアは、ウィンドウとプルダウンメニューでカスタマイズでき、制御する顕微鏡とコンポーネントに固有のメニューです。そのため、各ユーザーインターフェースは、イメージングの約1時間前に、潜在的にユニークな外観を持つことになります。インキュベーターのコントロールの位置を確認し、上部チャンバーとステージプレートの加熱をオンにします。

温度を摂氏37度に設定します。CO2制御をオンにし、レベルを5%に設定します この研究では、イメージング用の対物レンズを選択します。対物レンズには、水と同様の屈折率を持つ液浸媒体を使用する必要があります。

長期間にわたって複数の位置をイメージングする必要がある場合は、スコープが乾燥しないように、十分な液浸媒体を適用してください。培養皿をステージに置き、顕微鏡制御またはソフトウェアを使用して、対物レンズを上にして底に接触させます。放出された光をアイピースに向け、目的の蛍光シグナルに適した広視野フィルターセットを選択します。

次に、接眼レンズを通して見ます。画像の焦点を合わせ、ソフトウェアまたは顕微鏡のコントロールを使用して、適切な細胞フィールドを見つけます。アイピースから放出された光を、ソフトウェアの共焦点回転ディスクユニットを備えたポートに向けます。

この調査に適したレーザーをオンにします。チャネルごとに、kuo光学チューナブルフィルター制御を適切なレベルに調整して、レーザーの強度を調整します。次に、適切なダイクロイックミラーと発光フィルターを選択します。

回転ディスクユニットのシャッターを開けます。次に、ライブウィンドウを選択して、現在の視野を表示します。次に、カメラ制御ウィンドウを開きます。

使用するカメラを選択し、露出時間を約100ミリ秒に設定します。必要に応じて、パーセントとEMゲインを調整します。また、共焦点スピニングディスクユニットのコントロールを開き、適切な画像をキャプチャするために設定されたカメラの露出時間を入力して、スピニングディスクの速度を調整します。

[設定] をクリックして、変更をロックします。次に、多次元取得ウィンドウを開きます。チャンネルタブを選択し、フローラフォーズに定義された適切なチャンネルをロードまたは選択します。

イメージのレジストレーションを確保するには、両方のチャネルに共通のダイクロイック ミラーを使用します。ソフトウェアをオートフォーカスに設定します。MDAウィンドウに進み、[ZSスタック]タブをクリックします。

現在のフォーカス位置にあるZSスタックを選択します。10ミクロンのザックの範囲を設定し、Z.Nowを通じてナイキストサンプリングを確保するためにステップ数に最適を選択します。時間タブを選択します。

イメージングの時点とセッションの全体的な期間の間隔を設定します。ディッシュ内の複数の細胞をマルチポイントイメージングするには、MDAウィンドウを開きます。ポジションタブを選択し、ポジションごとの時点の前または後に適用設定がオンになっていることを確認します。

次に、マークを選択します。ライブビューを使用して検索し、皿を動かして適切な視野を選択します。多次元取得メニューの[開始]をクリックして実験を開始し、コントロールビデオを録画します。

適切な処理を追加し、決められた時間間隔で定義された時間内に実験ビデオを録画します。この細胞株と有糸分裂の全過程を監視するために、7分半の間隔を使用し、それを4〜5時間使用しました。あなたはあなたの細胞株とあなたが研究したいもののための特定の設定を決定する必要があります。

Velocityソフトウェアを開き、新しいライブラリを作成して名前を付け、ファイルを表示するための実験的なビデオファイルをインポートします。拡張フォーカス設定を使用してみて、必要に応じてビデオを調整してください。Velocityには、取得した画像の品質を向上させるのに役立つさまざまなツールが装備されています。

顕微鏡の設定が適切であれば、後で編集する時間を大幅に節約できます。多くの場合、画像をデボルブし、明るさとコントラストを調整すると便利です。特定のニーズは実験に基づいて異なります 細胞を3Dで表示するには。3Dの不透明度設定に切り替えます。

これにより、3Dレンダリングされたセルを空間内で回転させることができ、セル内の関心のある構造の複数の視点を提供します。映画。静止画像は、コントロールと比較して、ユーザーの好みに基づいてさまざまなファイルタイプにエクスポートできます。CPTに曝露された線維芽細胞は、5〜10分以内に病巣を形成し、記録期間中、これらの病巣を維持した。

興味深いことに、ヒト胚性腎臓細胞では、53 BP細胞は有糸分裂の開始時にクロマチンから解離し、凝縮する染色体の周りに薄い霞を形成します。テレフが発生し、有糸分裂が53 BPの1で終了すると、再び異なる病巣に凝集します。このビデオを通じて、DNA損傷応答に関与するタンパク質の時空間的な関係や他の経路を研究できるようになることを願っています。

例えば、クロマチンダイナミクスの分野では、この手法を用いて、53 BPの1つの結合がDNAのテロメア末端の動きにどのように影響するかを研究しました。遺伝子改変細胞の作製後、2Dおよび3Dの生細胞イメージングを約4時間から8時間で行うことができます。最適なイメージングを実現するために、顕微鏡の設定が適切に調整されていることを確認してください。