近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

ここでは、 in situ Proximity Ligation Assay（PLA）を使用して、遺伝毒性ストレスに曝された懸濁細胞培養におけるATMとp53との間の直接タンパク質 - タンパク質相互作用の検出および可視化を実証する。

この近接ライゲーションアッセイ実験の全体的な目標は、浮遊細胞培養におけるDNA損傷の誘導に続くDNA損傷応答および修復タンパク質複合体の形成を可視化し、定量化することです。この方法は、空間的な時間的組織化と制御、および多様な修復経路がさまざまなタイプのDNA損傷にどのように応答するかなど、DNA損傷修復における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、比較的単純で、必要な細胞数が少なく、タンパク質間相互作用を破壊または変更する可能性のある広範な処理を必要としないことです。

この方法は、DNA修復、培養懸濁細胞におけるタンパク質複合体形成に関する洞察を提供するだけでなく、培養接着細胞、凍結またはパラフィン包埋組織、さらには動物全体にも適用できます。この研究では、ヒトBCR陽性のb細胞急性リンパ芽球性細胞株BV-173を使用し、5%CO2の雰囲気下で37°Cのサプリメントと共にIMDMで培養します。細胞を1ミリリットルあたり10〜6回、ウェルあたり5ミリリットルの6ウェルプレートに

細胞周期のG1期で細胞を停止させるには、各ウェルに5マイクロモルのメタンスルホン酸アンモニウムを加え、5%CO2の雰囲気でプレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、2つのウェルのそれぞれに5マイクロモルのATM阻害剤を加え、プレートをインキュベーターに30分間戻します。次に、ATM阻害剤で前処理したウェルの1つと、前処理しなかった別のウェルにNCSを1ミリリットルあたり50ナノグラム添加することにより、DNA損傷を誘発します。

2時間インキュベートします。ビーカーの50ミリリットルの1XPBSの上に5グラムのフラクション-5 BSAを重ねて1XPBSと10%BSAを調製し、BSAが溶解するまで振ったり攪拌したりせずに室温で放置します。0.22マイクロメートルのフィルターを通してPBSと10%BSA溶液をゆっくりとろ過し、氷の上に保ちます。

各ウェルの内容物を15ミリリットルのチューブに移す細胞を回収します。細胞を氷冷した1XBPSで2回洗浄します。細胞をカウントした後、10ミリリットルあたり6番目の細胞に1XBPSと10%BSAを2回ずつ再懸濁します。

細胞を氷の上に保ちます。この手順のために顕微鏡スライドを準備します 糸くずの出ないティッシュで慎重に研磨し、96%エタノールをCoplinジャーに5分間置いて脱脂します。スライドを10分間自然乾燥させます。

顕微鏡スライドを6ミリリットルの面積のサイトスピン細胞診漏斗に組み立てます。50マイクロリットルの1XPBSと10%BSAを各漏斗にピペットで移漬し、500 RPMで1分間遠心分離してスライドをプレコートします。各漏斗に100マイクロリットルの細胞懸濁液を加え、500RPMで5分間遠心分離します。

漏斗を慎重に分解し、スライドのスポットに触れないように注意してください。先端が5mmのパップペンリキッドブロッカーを使用して、各スポットの周りに円を描きます。次に、各スポットに50マイクロリットルの4%PFA固定溶液を追加します。

そして室温で30分間インキュベートします。30分後、室温でCoplinジャー内の1XPBSで細胞を穏やかに攪拌しながら洗浄します。この方法で毎回5分間、3回洗います。

糸くずの出ないティッシュでスポットの周りのスライドを乾燥させ、スライドを傾けて糸くずの出ないティッシュで乾燥させることで、スポットからできるだけ多くの液体を取り除きます。各スポットに50マイクロリットルの0.25%Triton Xを1XPBSで加え、攪拌せずに室温で10分間インキュベートします。スライドをCoplinジャー内の50〜60ミリリットルのTBS-Tで室温で穏やかに攪拌しながら洗浄します。

毎回5分間、3回。ブロッキングする前に、TBS-Tを軽くたたいて、糸くずの出ないティッシュでスポットの周りのスライドを乾かします。その場からできるだけ多くの液体を取り除きます。

ブロッキング溶液を短時間ボルテックスし、次に各スポットに約40マイクロリットルの1滴を追加します。スライドを予熱した加湿チャンバーに入れ、摂氏37度で1時間インキュベートします。抗体カクテルを準備します。

市販の抗体希釈液をボルテックスで取り込み、その後、市販の抗体希釈液を各マイクロフュージチューブにピペットで移します。ヤギ抗ATM抗体を1:1000で添加します。そして、ウサギの抗ホスホセリン-15 p53抗体は1:100です。

単一抗体コントロール実験では、ヤギ抗ATM抗体とウサギ抗ホスホセリン-15 p53抗体のみを含む抗体希釈液を調製します。1時間のインキュベーションが完了したら、ブロッキング溶液をタップオフしますが、細胞が乾燥しないように注意してください。各抗体カクテル希釈液を30マイクロリットル加え、摂氏4度の加湿チャンバーで一晩インキュベートします。

翌日、スライドをCoplinジャー内の1X NC2洗浄バッファーAで室温で、毎回5分間、2回穏やかに攪拌しながら洗浄します。スライドを洗浄バッファーAで2回洗浄した後、スライドから洗浄バッファーを剥がし、各スポットに30マイクロリットルの近接ライゲーションアッセイプローブ混合物を添加します。予熱した加湿チャンバー内で摂氏37度で1時間インキュベートします。

スライドを50〜60ミリリットルのCoplinジャーに入れた洗浄バッファーAで室温で穏やかに攪拌しながら洗浄します。次に、各スポットの39マイクロリットルのライゲーション溶液に1マイクロリットルのリガーゼを添加することにより、氷上でライゲーションリガーゼ溶液を調製します。各スポットに40マイクロリットルのライゲーションリガーゼ溶液を加えます。

予め温めた加湿チャンバー内で摂氏37度で30分間インキュベートします。スライドを洗浄バッファーAでCoplinジャーに入れ、室温で穏やかに攪拌しながら洗浄します。増幅ポリメラーゼ混合物を氷上で調製します。

まず、増幅原液を水で1〜5に希釈します。そして、各スポットについて、0.5マイクロリットルのポリメラーゼを39.5マイクロリットルの1X増幅溶液に加えます。洗浄バッファーを軽くたたいて、スポットあたり40マイクロリットルの増幅ポリメラーゼ混合物を追加します。

予熱した加湿チャンバー内で摂氏37度で100分間インキュベートします。100分間のインキュベーションが完了したら、増幅ポリメラーゼ混合物をタップオフし、Coplinジャー内の1X NC2洗浄バッファーBでスライドを洗浄します。室温で、穏やかに攪拌しながら、それぞれ10分間、2回

その後、スライドを0.01x洗浄バッファーBで1分間洗浄します。余分な洗浄バッファーBを軽くたたいて取り除き、糸くずの出ないティッシュでスポットの周りのスライドを乾かします。その場からできるだけ多くの液体を取り除きます。

DAPIを含まない封入剤で1:5に希釈することにより、核をオーバーステインしない封入剤を含むDAPIを調製します。24mm×24mmのカバースリップに、希釈したDAPI含有封入剤を25〜30μL加えます。スライドでカバースリップを拾い上げ、気泡が溜まらないように少し圧力をかけます。

カバースリップをマニキュアで密封し、少なくとも15分待ってからイメージングします。最後に、共焦点蛍光顕微鏡を使用してスライドを画像化し、分析します。近接ライゲーションアッセイを使用して、G1期で停止したBV 173ヒトBCR可能陽性細胞におけるATMとホスホセリン15 p53との間の相互作用を調査しました。

NCSでDNA損傷を誘発しなかった細胞とは対照的に、NCSで処理された細胞の大部分は、細胞あたり平均7つのシグナルを持つ、核内のみに点状のシグナルを持っていました。これは、DNA損傷の誘導がATMとホスホセリン15p53との間の相互作用をもたらすことを示しています。DNA損傷の誘導前に特定のATMキナーゼ阻害剤で細胞を前処理すると、シグナルの数が細胞あたり平均2つのシグナルに減少し、残基セリン15でのp53のリン酸化がATMキナーゼ活性に依存していたことが確認されます。

抗ATM抗体または抗ホスホセリン15 p53抗体を放出した単一抗体対照実験では、期待したようなシグナルは得られませんでした。この図は、浮遊細胞培養物のサイトスピン調製物に対する近接ライゲーションアッセイ技術の特異性を実証し、確認する結果の定量化と統計解析を示しています。この手法を習得すると、適切に実行されれば、一次抗体との一晩のインキュベーション後約5時間で行うことができます。

この手順を試行する際は、近接ライゲーションアッセイを行う前に、目的の細胞の免疫蛍光染色により抗体を慎重に滴定することを覚えておくことが重要です。この技術は、その開発後、細胞生物学の研究者が、免疫沈降やFRETベースのイメージングなどの標準的な方法では評価が困難な一過性タンパク質タンパク質相互作用を探求する道を開きました。このビデオを見れば、浮遊細胞培養物で近接ライゲーションアッセイを行い、タンパク質タンパク質の相互作用をin situで可視化および定量する方法を十分に理解できるはずです。