Name: 近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: 学ぶ近接ライゲーションアッセイを用いて懸濁細胞培養におけるDNA損傷応答タンパク質複合体を可視化・定量化する方法です。BV-173細胞を使用し、ATMとp53の相互作用を解析します。

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Guikema研究所の研究は、オランダ科学研究機関（VIDIグラント016126355）およびStichting Kinderen Kankervrij KiKA（プロジェクト252）のInnovational Research Incentives Schemeによる資金提供を受けています。

1.細胞の処理とDNA損傷誘導<ol><li> 20％FCS、50μMβ-メルカプトエタノール、2mM L-グルタミン、100U / mLペニシリンおよび100μg/ mLストレプトマイシンを補充したIMDM中のヒトBCR-ABL + B細胞急性リンパ芽球性細胞系BV173またはSUP-B15を、 37℃、5％CO 2の雰囲気下で培養した。細胞を計数し、5mL /ウェルで6ウェルプレート中で2×10 6細胞/ mLでプレートする。 注：任意に、様々な起源の懸濁細胞株を使用することができる。 </li><li> 細胞周期のG1期のBCR-ABL + B-ALL細胞を停止させるために、5μMのイマチニブメタンスルホネート（STI571）を添加し、一晩インキュベートする。 <ol><li>必要に応じて、細胞周期またはBCR-ABL陰性細胞タイプ全体でタンパク質 - タンパク質相互作用を研究する場合は、このステップを省略してください。 </li></ol></li><li> 50 ng / mLのネオカルジノスタチン（NCS）を培養液に添加してDNA損傷を誘導し、2時間インキュベートする。 <ol><li>あるいは、放射能源[ 137 Cs]を0.5Gy /分で5Gyの線量で照射することによりDNA損傷を誘発する。照射後、37℃、5％CO 2雰囲気下で細胞を2時間回復させる。 </li></ol></li><li>場合によっては、DNA損傷に応答するATMキナーゼ活性の関与を評価するために、ATMキナーゼ阻害剤KU55933をNCSの添加または照射処理の前に5μM添加する。 </li><li>ビーカーまたは三角フラスコ中の50mLの1×PBSの上に5gの画分V BSAを重層し、BSAが溶解するまで室温で放置することにより、1×PBS + 10％BSAを調製する。激しい発泡を引き起こすので、振り混ぜないでください。ゆっくりと0.22μmフィルターでろ過し、氷上に置く。 </li><li>細胞を採取し、氷冷1×PBSで2回洗浄する。細胞を数え、1×PBS + 10％BSA中で2×10 6 / mLで再懸濁する。細胞を氷上に置く。 </li></ol> 2.細胞遠心、固定および浸透<ol><li>準備する新たに1×PBS中4％パラホルムアルデヒド溶液。 2mLのPFAを50mLの1×PBSに添加し、溶液が透明になるまで55℃の振盪水浴中でインキュベートする。溶液を0.22μmフィルターで濾過し、使用するまで室温で保存する。 注：必要に応じて、4％PFA固定液を-20℃で凍結保存することができます。凍結後、使用のために一度だけ解凍する。そうでなければ、PBS中の4％PFA溶液を直接購入することができる。 </li><li>糸くずのない組織で76 mm x 26 mmの顕微鏡スライドを注意深く磨き、Coplinジャーで96％エタノールに5分間入れて脱脂する。顕微鏡を10分間空気乾燥させる。 </li><li>顕微鏡スライドを6mmの領域でサイトスピン/細胞学の漏斗に組み込む。 50μLの1×PBS + 10％BSAを各漏斗に分注し、500 rpmで1分間遠心分離することによりスライドをプレコートする。 </li><li> 100μLの細胞懸濁液（0.2×10 6細胞に等しい）を各漏斗に加え、500rpmで5分間遠心分離する。各抗体の組み合わせについて、ast 4の調製が必要である（二重抗体実験;二つの単一抗体対照;抗体対照なし）。 </li><li> 慎重に漏斗を分解し、その斑点に触れないようにしてください。すぐに固定のサンプルに進みます。 <ol><li>任意に、スライドを少なくとも30分間空気乾燥させる。風乾した後、スライドをアルミ箔で個別に包み、使用するまで-20℃で保存します。凍結した調製物を使用する場合は、スライド上に結露が発生しないように、ペーパータオルに包まれたスライドを解凍してください。 </li></ol></li><li> PAPペンの液体ブロッカー（先端5 mm）を使用して、スポットの周りに円（およその直径15-20 mm）を描きます。 </li><li>各スポットに50μLの4％PFA固定溶液を加え、RTで30分間インキュベートする。 </li><li>穏やかに攪拌しながら室温でCoplinジャーで1×PBSで5分間3回細胞を洗浄する。 </li><li>糸くずのない組織でスポット周辺のスライドを乾燥させ、できるだけ多くの液体をスポットから除去するペットにスポットに触れることなく、またはスライドを傾けて各スポットに50μLの0.25％Triton-Xを1×PBSに加え、攪拌せずに室温で10分間インキュベートする。 </li><li>穏やかに攪拌しながら室温でCoplinジャー中のTBS（TBS-T）中の〜50-60mLの0.05％Tween-20中で5分間スライドを3回洗浄する。 10枚のスライドをこのようにして同時に処理することができる。 </li></ol> 3.ブロッキングおよび一次抗体インキュベーション<ol><li> TBS-Tをタップし、糸くずのない組織でスポット周辺のスライドを乾燥させます。スポットに触れることなく、またはスライドを傾けることによって、できるだけ多くの液体をピペットを用いてスポットから除去する。ブロッキング溶液を短時間ボルテックスし、各スポットに1滴（約40μL）を加えます。あらかじめ加温した加湿チャンバー内で37℃で1時間インキュベートする。 </li><li>使用する前に、市販の抗体希釈液、ボルテックス抗体希釈液中で、1：1,000のヤギ抗ATMと1：100のウサギ抗ホスホSer15-p53を混合することにより抗体カクテルを調製する。対照実験のためにヤギ抗ATMおよびウサギ抗ホスホSer15-p53抗体（単一抗体対照）のみを含有する抗体希釈液を調製する。 </li><li>ブロッキング溶液を除去するが、抗体希釈液を添加する前に細胞を乾燥させないように注意する。各抗体カクテル希釈液30μLを加え、4℃で一晩加湿チャンバー内でインキュベートする。 </li><li> バッファーAとバッファーBミックスの1つの袋の内容物をそれぞれ最終容量1,000mLの水に溶解して、その場で洗浄バッファーAと洗浄バッファーBを調製する。 <ol><li>あるいは、8.8gのNaCl、1.2gのトリス塩基および0.5mLのTween-20を800mLの水に溶解することによって洗浄緩衝液Aを調製する。 HClを用いてpHを7.4に調整し、最終容量を1,000mLにする。 </li><li>あるいは、5.84gのNaCl、4.24gのトリス塩基および26.0gのトリス-HClを500mLの水に溶解することによって洗浄緩衝液Bを調製する。 HClを用いてpHを7.5に調整する。水を最終容量1000 mLになるまで加えます。 </li><li>フィルタ両方の溶液を0.22μmのフィルターに通した。 </li></ol></li><li>穏やかに攪拌しながら室温でCoplinジャーで1x in situ洗浄バッファーAで5分間スライドを2回洗浄する。 </li></ol> PLAプローブ、ライゲーションおよび増幅<ol><li>抗ヤギプラスおよび抗ウサギMINUSを市販の抗体希釈液で1：5の両方で希釈することによってPLAプローブを調製する。スライドから1x in situ洗浄バッファーAをタップし、各スポットに30μLのPLAプローブ混合物を添加する。あらかじめ加温した加湿チャンバー内で37℃で1時間インキュベートする。 注：適用された一次抗体が異なる種で育成され、PLAプローブの組み合わせが常に存在すべきである限り、二次抗体PLUSおよびMINUS PLAプローブの任意の組み合わせ（抗マウス、抗ウサギ、抗ヤギ）を使用することができるPLUSプローブとMINUSプローブが含まれています。 </li><li>穏やかに撹拌しながら室温でCoplinジャー中で〜50-60mLの1x in situ洗浄緩衝液Aで5分間スライドを2回洗浄する&lt;/ li&gt; <li> 1μLのリガーゼを39μLのライゲーション溶液に添加し、40μLのライゲーション - リガーゼ溶液を各スポットに加えることによって、氷上でライゲーション - リガーゼ溶液を調製する。あらかじめ加温した加湿チャンバー内で37℃で30分間インキュベートする。 </li><li>穏やかに攪拌しながら室温でCoplinジャー内の約50〜60mLの1x in situ洗浄緩衝液Aで5分間スライドを2回洗浄する。 </li><li>増幅ストック溶液を水で1：5に希釈することにより、氷上で増幅 - ポリメラーゼ混合物を調製する。次に、0.5μLのポリメラーゼを各スポットの1×増幅溶液39.5μLに加える。 注：増幅試薬は感光性であり、光に直接暴露されないように保護する必要があります。増幅試薬は、4つの異なる色（RED：励起594nm、発光624nm、励起644nm、発光669nm、ORANGE：励起554nm、発光576nm、緑色：励起501nm、発光523nm）利用可能な顕微鏡検査の設定がuitable励起特性とこれらの色をイメージングするフィルタ。 </li><li> 1x in situ洗浄バッファーAをタップし、スポットあたり40μLの増幅 - ポリメラーゼ混合物を添加する。あらかじめ加温した加湿チャンバー内で37℃で100分間インキュベートする。 </li></ol> 5.取り付けとイメージング<ol><li> 99mLの水に1mLの1mLのWash Buffer Bを加えて、0.01x in situ洗浄バッファーBを調製します。 </li><li> Amplification-Polymerase混合液をタップし、Coplinジャーで緩やかに攪拌しながら室温で1x in situ洗浄バッファーBで10分間2回スライドを洗浄する。 </li><li>スライドを0.01x洗浄バッファーBで1分間洗浄する。 </li><li>余分な0.01x洗浄バッファーBをタップし、糸くずのない組織でスポット周辺のスライドを乾燥させます。スポットに触れることなく、またはスライドを傾けることによって、できるだけ多くの液体をピペットを用いてスポットから除去する。 </li><li> DAPIを含まないマウンティング培地をDAPIを含まないマウンティング培地で1：5希釈して、核の過剰な染色を避ける。 </li><li> 25〜30μLの1：5DAPI含有マウント媒体を24mm×24mmのカバースリップに加え、スライドでカバースリップを拾い、気泡が閉じ込められていないことを確認します。ネイルポリッシュでカバースリップをシールし、イメージングの前に少なくとも15分間待つ。 </li><li> （共焦点）蛍光顕微鏡を用いてスライドを分析する。 <ol><li>少なくとも4つの獲得された画像フィールド（20×対物レンズ、条件または抗体の組み合わせにつき少なくとも20個の細胞を計数し、処置された細胞において7±5個のシグナルの予想平均を用いた出力計算に基づいて細胞あたりの点陰性PLAシグナルの数を数え、以前に報告されたように、タイプIエラーが0.05の確率、および80％の出力の確率で、未処理の細胞では2±2シグナルであった。 注：最高の解像度は、ソフトウェアパッケージ（ImageJ、Leica Acquisition Suite（LAS）など）を使用してZスタックとデコンボリューションを取得することによって実現されます。サインDAPI染色によって定義されるように、核周囲内で容易に識別可能であるべきである。 </li><li>核の外側にはっきりと現れるシグナルは数えないでください。典型的には、NCS処理またはγ照射は、1細胞あたり約5〜10のphosho-p53 / ATM PLAシグナルを生じる。 「単一抗体」コントロールはバックグラウンドシグナルを与えるかもしれないが、これは20個の細胞のうち1個あたり1〜2個のPLAシグナルを超えてはならない。 </li><li>出版およびプレゼンテーションの目的で、40倍または63倍の浸漬油の対物レンズを使用して画像を取り込みます。スライドは4℃で保存することができ、光の当たらないように保護する必要があります。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者は何も開示することはない。

この報告では、PLAを用いて、懸濁細胞培養におけるタンパク質間の特異的相互作用を決定し可視化することができることが示されている。注目すべきは、ここに記載されたプロトコールは、DNA修復複合体の研究に限定されず、懸濁細胞培養における他のタンパク質 - タンパク質相互作用を視覚化および定量化するためにも適用される。 ATMキナーゼは、DNA損傷誘発剤に暴露された場合、G1-停止BCR-ABL + B-ALL細胞におけるリン酸化されたp53と相互作用することが示される。以前は、PLA技術を用いて、ATMとFOXO1転写因子がBCR-ABL + B-ALL細胞と相互作用することを示したが、この相互作用はFOXO1のATM依存性リン酸化をもたらさない可能性が高い。 PLAデータを支持するために、確立されたATM基質p53およびNBS1とは対照的に、FOXO1は、Dを誘導するとATMによってリン酸化されない 、内因性ATM / ATR-リン酸化タンパク質の免疫沈降によって確認されたNAダメージ15さらに、PLAアプローチは、種々のヒトB細胞リンパ腫細胞株におけるミスマッチ修復複合体（...

DNA損傷は、タンパク質 - タンパク質相互作用、およびDNAの効率的かつ迅速な修復を確実にする翻訳後修飾を含む高度に制御された一連の事象を誘発し、それによってゲノムの完全性1を保護する 。典型的には、DNA修復は、（共焦点）蛍光顕微鏡法によるいわゆる電離放射線誘導病巣（IRIF）の形成をモニターすることによって電離放射線に曝露された細胞において研究される。多くのDNA修復およびDNA損傷感知タンパク質はIRIFを形成し、これはDNA損傷を維持するクロマチン部位で核形成するタンパク質複合体を表す2,3 。時間の経過とともにIRIFの位置と解像度は、DNA修復の時空間的組織化に重要な洞察を与え、異なるDNA修復経路の関与を示している可能性がある。損傷が達成されたDNA損傷および細胞周期段階の性質は、どのDNA修復経路が活性化されるかを決定する。フォ<html> DNA複製（S期）に活発に関与する細胞では、相同組換え（HR）が優性のDNA修復経路であるのに対し、細胞周期のG1期またはG2 / M期の細胞では、相同末端結合（NHEJ）修復経路が優勢である。 DNA損傷後の最も初期の事象の1つは、細胞周期のG1-およびG2 / M-相において大部分が活性であり、NHEJを調節するDNA損傷感知キナーゼAtaxia毛細血管拡張突然変異タンパク質（ATM）の活性化であり、 HRを活性化することによってS期に作用するRad3関連タンパク質（ATR）を含むが、これらに限定されない。 ATMとATRの両方は、DNA修復、細胞死および生存に関与する多くのタンパク質をリン酸化する非常に多面的なキナーゼである4 。両方のキナーゼは、遺伝毒性ストレスに曝された後に腫瘍抑制タンパク質p53をリン酸化して活性化することが示されており、これらのキナーゼは、重要な腫瘍抑制シグナル伝達軸の上流メディエーターであることが示されている&quot;xref&quot;&gt; 5,6。 IRIFの形成および組成は、典型的には、2色免疫蛍光染色および顕微鏡法を用いて異なるタンパク質の共局在を決定することによって評価されるが、修復タンパク質複合体の一部であるタンパク質のすべてがIRIFを形成するわけではない。さらに、（共焦点）免疫蛍光顕微鏡法は、光の回折特性によって制限され、約200〜300nmの空間分解能がかなり低く、ほとんどの細胞内構造のサイズを超えており、本質的にタンパク質 - タンパク質相互作用分子レベル。このように、（共焦点）蛍光顕微鏡によって検出される免疫蛍光染色パターンの共局在化は、必ずしも直接的なタンパク質 - タンパク質相互作用を示すものではない。最近、3次元構造物のような新しい超解像技術が開発されている共焦点レーザー走査顕微鏡8で検出できなかったこれらのタンパク質の空間分布特性を明らかにする、ナノスケールの詳細における53BP1およびBRCA1 IRIF形成の研究に首尾よく使用された、テューティング照明顕微鏡（3D-SIM） 7 。 イン・ビボでのタンパク質 - タンパク質相互作用、例えば共免疫沈降法、プルダウン法および酵母ツーハイブリッドスクリーニング法を検出するために、いくつかの他の方法を使用することができる。しかしながら、これらの技術はかなり煩雑であり、多量の細胞またはタンパク質を必要とするか、またはタンパク質の過剰発現を伴い、実験的人工物を導入する。最近では、Proximity Ligation Assay（PLA） 9,10と呼ばれるin-situ （ すなわち 、細胞および組織における）タンパク質 - タンパク質相互作用の視覚化および定量化を可能にする新規な技術が開発されている。 Pr関心対象の2つのタンパク質を認識する二価抗体は、オリゴヌクレオチド（いわゆるPLAプローブ）にコンジュゲートされた二次抗体によって検出される。 2つの異なる二次抗体が、一次抗体によって認識されるタンパク質間の相互作用のために十分に接近している場合、結合オリゴヌクレオチドはハイブリダイズし、ライゲーションして閉環状DNA基質を形成することができる。この環状基質は続いてローリングサークル増幅により増幅され、蛍光色素と結合した相補的オリゴヌクレオチドで視覚化される。 PLAを使用すると、蛍光標識されたローリングサークル増幅産物がPLAプローブに付着したままであるので、タンパク質 - タンパク質相互作用の細胞内局在が保存される。このアッセイの分解能は、抗体の直径が約7〜10nmであるという知見に基づいて&lt;50nmである11 。ローリングサークル増幅は、2対の抗体（プライマリ+セコンdary）は、そのサイズ（10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm）で定義される周囲内で物理的に相互作用します。シグナル増幅工程は、PLAアッセイの感度を高め、ほとんど発現しないタンパク質の相互作用の検出を可能にする。 PLAは、細胞間単位で定量することができる点状の病巣様シグナルパターンを生成し、それによってタンパク質 - タンパク質相互作用における細胞内および細胞間の変動を評価することができる。 DNA修復複合体およびIRIFの形成および組成は、ヒト骨肉腫上皮細胞株U2OS、ヒト胎児腎細胞株HEK293および網膜色素上皮細胞株RPE-1のような接着細胞株で研究されており、増殖し、トランスフェクションしやすい。これらのリンパ系細胞系および骨髄系細胞系のような懸濁細胞培養は、トランスフェクションの影響を受けにくく、一般的にカバーガラスに付着しないため、使用頻度が低いイメージングのためのeps。しかし、DNA損傷応答は、これらの腫瘍におけるゲノム（ドライバー）異常によって頻繁に影響され、正常なリンパ系および骨髄系の悪性形質転換において中心的な役割を果たすため、リンパ系および骨髄系の悪性疾患の状況において、前駆細胞）細胞12,13,14 。 このプロトコールは、浮遊細胞培養におけるDNA損傷の誘導後にPLAがどのようにしてタンパク質 - タンパク質相互作用を評価および定量するために使用され得るかを記載する。ここで、PLAは、G1期の細胞周期停止を受けるように誘導されたヒトB細胞白血病細胞におけるDNA損傷に対するATMとp53との間の相互作用を決定し可視化するために行われる。注目すべきは、ここに提示されたプロトコルは、G1拘束性白血病細胞におけるATMおよびp53相互作用の研究に限定されないが、他のタンパク質 - タンパク質相互作用を視覚化するために使用することもできる種々の細胞型および懸濁細胞培養における細胞の増殖を阻害する。

<table><tbody><tr><td>BV173細胞株</td><td>DSMZ</td><td>AC-20</td><td>BCR-ABL+ B-ALL細胞株</td></tr><tr><td>SUP-B15細胞株</td><td>DSMZ</td><td>ACC-389</td><td>BCR-ABL+ B-ALL細胞株</td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td>lot #: 064M3396</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco (LifeTechnologies)</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>imatinib methanesulfonate</td><td>LC Laboratories</td><td>I-5508</td><td>DMSOに溶解し、10 mMストック溶液</td></tr>ネオ<tr><td>カルジノスタチン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N9162</td><td>変異原性/催奇形性を調製し、取り扱いに注意して</td></tr><tr><td>KU55933</td><td>Selleckchem</td><td>S1092</td><td>DMSOに溶解し、5 mMストック溶液を調製</td></tr>します <tr><td>Starfrost Microscopy Slides</td><td>Waldemar Knittel</td><td>VA11200 003FKB</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen liquid blocker</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin funnel</td><td>Q Path Labonord SAS</td><td>003411324</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DUO92105</td><td>FarRED、オレンジ、グリーン</td></tr><tr><td>ヤギ-anti-ATM</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-136A</td> PLAグレードでも利用可能な、さまざまな種/組み合わせで利用可能です。私たちは、ウサギ-抗リン酸化-Ser15-p53細胞シグナル伝達技術9284の研究で<td>ロット#A300-136A-1を成功</td></tr>裏に使用しました。私たちは、DAPIベクターラボでVectashield退色<tr><td></td><td></td><td></td>防止封入剤の研究<td>でロット#9284-4を成功裏に使用しました</td></tr><tr><td></td><td></td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 退色防止封入剤</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde in PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>他のさまざまなベンダーからも入手可能</td></tr></tbody></table>

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるdna損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

DNA損傷応答は、自発的に起こる、遺伝毒性ストレスに起因する、またはリンパ球におけるプログラムされたDNA切断の状況で現れるDNA損傷の修復を調整する。 Ataxia-Telangiectasia突然変異キナーゼ（ATM）、ATMおよびRad3関連キナーゼ（ATR）およびDNA依存性プロテインキナーゼ（DNA-PKcs）の触媒サブユニットは、DNA損傷の誘導時に活性化される最初のものであり、 DNA修復、アポトーシスおよび細胞生存を制御するネットワークの中央調節因子である。腫瘍抑制経路の一部として、ATMおよびATRはリン酸化を介してp53を活性化し、それによってp53の転写活性を調節する。 DNA損傷はまた、DNA損傷センサの複合体を表す、いわゆる電離放射線誘導病巣（IRIF）の形成をもたらし、蛍光顕微鏡検査によって視覚化されるDNA損傷部位に蓄積する。しかし、IRIFにおけるタンパク質の共局在は、必ずしもd蛍光顕微鏡法の分解能が限られているため、直接的なタンパク質 - タンパク質相互作用が必要である。 その場での近接性ライゲーションアッセイ（PLA）は、前例のない特異性および感度を有する細胞および組織におけるタンパク質 - タンパク質相互作用の直接的な可視化を可能にする新規技術である。この技術は、目的のタンパク質に結合する特異的抗体の空間的近接性に基づいている。調べられたタンパク質が約40nm以内にある場合、増幅反応は、抗体にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドによって誘発され、増幅産物は、蛍光標識によって視覚化され、相互作用タンパク質の細胞下の位置に対応するシグナルを生じる。 ATMとp53との間の確立された機能的相互作用を例として、ここでは、DNA損傷応答の不可欠な部分であるタンパク質間の直接的相互作用を研究するために、浮遊細胞培養においてPLAがどのように使用され得るかが実証される。

残基Ser15におけるp53のリン酸化は、ATMキナーゼ活性に依存することが示された16 。懸濁細胞培養のサイトスピン調製物に対するPLA技術の特異性を実証し確認するために、細胞周期のG1期に停止したBCR-ABL + B-ALL細胞の2時間のNCS処理によるDNA損傷の誘導が示されている予想通り、ATMとホスホ-Ser15-p53との間の特異的相互作用を生じた。 NCSで処理した細胞の大部分（ 図1B ）では、腺腫PLAシグナルが観察されたが、NCSで処理されなかった細胞では検出されなかった（ 図1A ） 。特定のATMキナーゼ阻害剤KU55933でDNA損傷の誘導に先立って細胞を前処理すると、PLAシグナルの数は平均して2 PLAシグナル/細胞（ 図1C ）。 ATM-ホスホ-Ser15-p53 PLAシグナルは、予想通り、核内で排他的に検出さ...

ここでは、 in situ Proximity Ligation Assay（PLA）を使用して、遺伝毒性ストレスに曝された懸濁細胞培養におけるATMとp53との間の直接タンパク質 - タンパク質相互作用の検出および可視化を実証する。

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

この近接結紮アッセイ（proximity ligation assay）実験の全体的な目的は、浮遊細胞培養においてDNA損傷を誘導した後の、DNA損傷応答および修復タンパク質複合体の形成を可視化し、定量することです。この手法は、空間的・時間的な組織化と制御、および多様な修復経路が異なる種類のDNA損傷にどのように反応するかといった、DNA損傷修復における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、比較的簡便であり、必要細胞数が少なく、タンパク質間相互作用を乱したり変化させたりする可能性のある広範な処理を必要としないことです。この手法は、浮遊培養細胞におけるDNA修復やタンパク質複合体形成に関する知見を得るために有用ですが、接着培養細胞、凍結組織またはパラフィン包埋組織、さらには個体レベルの動物にも適用可能です。本研究では、ヒトBCR-ABL陽性B細胞急性リンパ性白血病細胞株であるBV-173を用い、添加物を加えたIMDM中で37 °C、5% CO2雰囲気下で培養しています。6ウェルプレートに、1ウェルあたり5 mL、細胞密度2 × 10⁶/mLで播種します。細胞を細胞周期のG1期で停止させるため、各ウェルに5 µMのメタンスルホン酸アンモニウムを添加し、5% CO2雰囲気下の37 °Cでプレートを一晩インキュベートします。翌日、2つのウェルのそれぞれに5 µMのATM阻害剤を添加し、プレートをインキュベーターに戻して30分間静置します。次に、ATM阻害剤で前処理したウェルのうちの1つと、前処理していない別のウェルに、50 ng/mLのNCSを添加してDNA損傷を誘導します。2時間インキュベートします。ビーカーに50 mLの1XPBSを入れ、その上に5 gのfraction-5 BSAを重ねて1XPBS plus 10%BSAを調製し、BSAが溶解するまで室温で静置してください（振とうや攪拌は行わないでください）。PBS plus 10%BSA溶液を0.22 µmフィルターでゆっくりとろ過し、氷上で保存します。各ウェルの内容物を15 milliliterチューブに移して細胞を回収します。氷冷した1XBPSで細胞を2回洗浄します。細胞数をカウントした後、1XBPSに10%BSAを加えた溶液を用いて、2×10⁶ cells/milliliterの濃度で再懸濁します。細胞を氷上に保持します。この手順に使用する顕微鏡スライドを準備するため、糸くずの出ないティッシュで丁寧に研磨し、コプリンジャーに入れた96% ethanolに5分間浸して脱脂します。スライドを10分間自然乾燥させます。容量6 mLのサイトスピン細胞診用漏斗に顕微鏡スライドをセットします。各漏斗に1XPBSと10%BSAを混合した液を50 µLずつピペッティングしてスライドをプリコートし、500 RPMで1分間遠心分離します。各漏斗に細胞懸濁液を100 µL加え、500 RPMで5分間遠心分離します。漏斗を慎重に分解し、スライド上のスポットに触れないように注意してください。5 mmチップのPapペン液体ブロッキング剤を使用して、各スポットの周囲に円を描きます。次に、各スポットに4% PFA固定液を 50 µL 加えます。室温で30分間インキュベートします。30分後、室温のコプリンジャー内で1XPBSを用いて、緩やかに撹拌しながら細胞を洗浄します。この手順で、1回5分間の洗浄を3回繰り返します。糸くずの出ないティッシュを使用して、スポット周辺のスライドを拭き取ります。スライドを傾け、糸くずの出ないティッシュで拭き取ることで、スポットから可能な限り液体を取り除きます。各スポットに0.25% Triton X含有1X PBSを50 µL加え、室温で攪拌せずに10分間インキュベートします。コプリンジャーに入れ、室温で緩やかに攪拌しながら、50から60 mLのTBS-Tでスライドを洗浄します。5分間を3回繰り返します。ブロッキングを行う前に、TBS-Tを吸い取り、スポット周囲のスライドを糸くずの出ないティッシュで拭き取ります。スポット上の液体をできるだけ多く取り除いてください。ブロッキング溶液を軽くボルテックスし、各スポットに約40 µLを1滴ずつ加えます。スライドをあらかじめ加温した加湿チャンバーに入れ、37 °Cで1時間インキュベートします。抗体カクテルを調製します。ボルテックスした後、市販の抗体希釈液を各マイクロチューブにピペットで分注します。次に、goat anti ATM抗体を1:1000で、rabbit anti-phosphoserine-15 p53抗体を1:100で加えます。単一抗体コントロール実験のために、ヤギ抗ATM抗体のみを含む抗体希釈液と、ウサギ抗リン酸化セリン15 p53抗体のみを含む抗体希釈液をそれぞれ調製します。1時間のインキュベーション終了後、ブロッキング溶液を吸い出しますが、細胞が乾燥しないように注意してください。各抗体カクテルの希釈液を30 µLずつ加え、湿潤させたチャンバー内で4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、コプリンジャーに入れ、室温で1X NC2 wash buffer Aを用いて、緩やかに振盪しながら5分間ずつ2回スライドを洗浄します。wash buffer Aで2回洗浄した後、スライド上の洗浄バッファーを吸い取り、各スポットに近接結紮アッセイ（proximity ligation assay）プローブ混合液を30 µL添加します。あらかじめ加温した加湿チャンバー内で、37 °Cで1時間インキュベートします。コプリンジャーに入れ、室温で緩やかに攪拌しながら、50～60 mLの洗浄バッファーAでスライドを洗浄します。次に、スポット1か所につき、ライゲーション溶液39 µLにリガーゼ1 µLを加えて、ライゲーションリガーゼ溶液を氷上で調製します。各スポットにライゲーションリガーゼ溶液を40 µLずつ加えます。あらかじめ加温した加湿チャンバー内で、37 °Cで30分間インキュベートします。室温にて、Coplin jarに入れた洗浄バッファーAを用いて、緩やかに攪拌しながらスライドを洗浄します。増幅用ポリメラーゼ混合液を氷上で調製します。まず、増幅ストック溶液を水で5倍に希釈します。次に、各スポットにつき、1X増幅溶液39.5 µLにポリメラーゼ0.5 µLを加えます。洗浄バッファーを吸い取り、1スポットあたり40 µLの増幅ポリメラーゼ混合液を加えます。あらかじめ温めておいた加湿チャンバー内で、37 °Cで100分間インキュベートします。100分間のインキュベーション終了後、増幅ポリメラーゼ混合液を捨て、コップリンジャーを用いてスライドを1X NC2 wash buffer Bで洗浄します。室温で、緩やかに攪拌しながら10分間を2回繰り返します。その後、スライドを0.01x wash buffer Bで1分間洗浄します。余分なwash buffer Bを叩いて落とし、スポットの周囲を糸くずの出ないティッシュで拭いて乾燥させます。スポットから可能な限り液体を取り除いてください。DAPI含有封入剤を、DAPIを含まない封入剤で1:5に希釈し、核の過染色を防ぐDAPI含有封入剤を調製します。希釈したDAPI含有封入剤を25から30 microliters、24 millimeter by 24 millimeterのカバーガラスに加えます。スライドと共にカバーガラスを持ち上げ、軽く圧力をかけて気泡が混入していないことを確認します。カバーガラスをマニキュアで封印し、イメージングまで少なくとも15分間待機します。最後に、共焦点蛍光顕微鏡を用いてスライドのイメージングおよび解析を行います。G1期で停止させたBV 173ヒトBCR-abl陽性細胞における、ATMとリン酸化セリン15 p53の相互作用を調べるために、近接結紮アッセイを用いました。DNA損傷を誘導するためにNCSで処理しなかった細胞とは対照的に、NCSで処理した細胞の大部分では、核内にのみ点状のシグナルが認められ、1細胞あたり平均7個のシグナルが観察されました。これは、DNA損傷の誘導がATMとリン酸化セリン15 p53の相互作用をもたらすことを示しています。DNA損傷を誘導する前に、特異的なATMキナーゼ阻害剤で細胞を前処理すると、シグナルの数が1細胞あたり平均2個まで減少しました。これにより、p53のセリン15残基におけるリン酸化がATMキナーゼ活性に依存していることが確認されました。抗ATM抗体または抗p53リン酸化セリン15抗体のいずれか一方のみを標識したシングル抗体コントロール実験では、予想通りシグナルは得られませんでした。この図は、浮遊細胞培養物のサイトスピン標本における近接結紮アッセイ（proximity ligation assay）技術の特異性を実証および確認する結果の定量化と統計分析を示すものです。習熟すれば、一次抗体による一晩のインキュベーション後、適切に実施することで約5時間でこの手法を完了させることができます。この手順を実施する際は、近接結紮アッセイ（proximity ligation assay）を行う前に、目的の細胞を用いて免疫蛍光染色を行い、抗体を慎重にタイトレーションすることを忘れないでください。この手法の開発により、細胞生物学の研究者は、免疫共沈降やFRETベースのイメージングといった標準的な手法では困難であり、しばしば技術的なアーティファクトが生じる一過性のタンパク質間相互作用を探索することが可能になりました。このビデオを視聴することで、浮遊細胞培養において近接結紮アッセイを行い、in situでタンパク質間相互作用を可視化および定量化する方法について十分に理解できるはずです。

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近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

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