フローサイトメトリーによる胸腺正と負の選択の検討

次の実験の全体的な目標は、フローサイトメトリーによってマウスの発達を調べることです。これは、マウス、胸腺および脾臓から単細胞懸濁液を調製することによって達成される。第2のステップとして、胸腺細胞と細胞を抗体のカクテルで染色し、特定の杉の集団を同定します。

最終的には、さまざまなリンパ球集団の頻度と数は、フローサイトメトリー解析によって評価できます。この方法は、機能的でありながら細胞耐性のあるT細胞レパートリーを生成するためにどの遺伝子と経路が重要であるかなど、T細胞の発生における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は、胸腺のT細胞発生に関する洞察を得ることができますが、他の免疫細胞の発生の検査にも適用できます。

一般的に、この方法に不慣れな方は、フローサイトメトリー用の抗体カクテルの設計に苦労するでしょう。解剖を開始する前に、滅菌スチールメッシュスクリーンを60 x 15ミリメートルのペトリ皿に入れます。次に、5ミリリットルのHBSSを皿に加え、皿を氷の上に保存して胸腺を収穫します。

まず、一対の鉗子を使用して胸骨の底の先端を持ち上げ、横隔膜を露出させます。次に、肝臓を避けて横隔膜を切って胸郭を切り離し、次に胸郭を両側で上方向に切断します。肺や心臓を避けるように注意してください。

次に、鉗子を使用して胸郭をそっと引き戻します。胸腺は、心臓の上にある白い二葉の器官です。鉗子の平らな端を使用して、ローブの底をつかみます。

次に、胸腺をそっと引き出し、事前に準備したメッシュスクリーンの1つに置きます。脾臓を摘出するには、腹膜を切開して腹腔を露出させます。脾臓は、肝臓の下のマウスの腹腔の左側にある赤いサーフボード型の臓器です。

次に、1組の鉗子を使用して脾臓を引き出し、もう1組の鉗子を使用して結合組織を引き出します。次に、解剖した脾臓を別のメッシュスクリーンに置きます。次に、3ミリリットルのシリンジからプランジャーを使用して、結合組織と脂肪のみが残るまで各臓器をメッシュスクリーンに粉砕し、細胞とHBSSを15ミリリットルの円錐管にピペットで固定します。

次に、各メッシュを新しいHBS S3ですすいでください。次に、細胞をGの335倍、摂氏4度で5分間ペレット化します。上清を吸引した後、脾臓赤血球をResusに溶かしている間、細胞を500マイクロリットルのCK溶解バッファーに室温で10分間懸濁します。

胸腺細胞をファックスバッファー内の1ミリリットルあたり6細胞の20倍に10倍で懸濁し、氷の上に置いておきます。次に、細胞を再びスピンダウンした後、細胞を等張性に戻すためにHBSSを5ミリリットル加え、RBCフリーペレットをファックスバッファーの1ミリリットルあたり6番目の細胞に10倍の20倍で懸濁します。このステップは、アリ・ワッティングから始めましょう。

フローサイトメトリーサンプルあたりの予約胸腺細胞の10〜6分の1を96ウェルプレートの各ウェルに4回。次に、コンペンセーションコントロールのために96ウェルプレートのウェルにサイトを追加します。次に、氷上で抗CD1632と10分間インキュベートすることにより、各細胞サンプルのFC受容体をブロックします。

次に、プレートをスピンダウンし、プレートを下向きにしてシンクにフリックしてウェルから液体を排出し、各ウェルを200マイクロリットルのファックスバッファーに懸濁して洗浄を繰り返します。次に、コンペンセーションコントロールのために、実験サンプルを200マイクロリットルの抗体カクテルまたは単一の蛍光色素標識抗体とインキュベートします。すべては、暗闇の氷上のファックスバッファにあります。

30分後、細胞をファックスバッファーで2回洗浄し、その後、細胞をファックスバッファーに懸濁した後、生理学的TCRトランスジェニックモデルおよび野生型マウスでサンプルをファックスチューブに移します。正の選択は、二重正の明るい段階から始まり、二重の正の鈍い段階に移行します。抗原が二重陽性の鈍い胸腺細胞に遭遇した後、その後、CD4になる前に移行期のCD4陽性CD8低段階に入ります。

単一陽性またはCD8単一陽性胸腺細胞成熟した単一陽性胸腺細胞は、それらの高いTCR発現およびCDの喪失によって特徴付けられる24。CD 8 x CD 4プロファイルでは、正選択の欠陥を明らかにすることができますが、TCR β by CD 69またはCD 5を調べると、欠陥がどこにあるのかについてさらに洞察を得ることができます。CD 69とCD 5はどちらもTCR刺激後にアップレギュレーションされ、より強い相互作用によりこれらのマーカーの発現が高くなります。

この野生型マウスの TCR β by CD 69 プロットでは、TCR R β 低 CD 69 陰性歩行は、選択前の二重陽性胸腺細胞の集団を表しています。一方、このTCRベータ中間体CD69陽性歩行は、TCRエンゲージメント直後の移行集団を表し、いくつかのダブルポジティブダルとCD4ポジティブCD8低細胞を含むダブルポジティブブライトで構成されています。ここで、TCR Rベータ高CD69陽性歩行は、ダブルポジティブ鈍CD4陽性、CD8低およびCD4シングル陽性細胞からなる、直接陽性選択後の細胞の集団を示しています。

最後に、このTCRベータ高CD69陰性歩行は、主にCD4およびCD8シングルポジティブ細胞からなる細胞のより成熟した集団を示しています。TCR Rベータ中間体CD69陽性およびTCRRベータ高CD69陽性集団の不在は、CD4単陽性とCD8陽性の比率における陽性選択変化の障害を示している可能性がある。TCRベータ高CD69陰性集団内の単一陽性細胞は、系統コミットメントの変化を示唆している可能性があります。

TCRベータ高CD69陽性集団およびTCRベータ高CD69陰性の集団の喪失は、陽性選択後の生存問題を反映している可能性がある。CD 5によるTCRベータの調査は、陽性選択前および正選択後の集団を特定するための別の戦略です。これらの最初の2つの集団は、主に二重陽性の明るい胸腺細胞で構成されています。

TCRベータ低CDファイブ低集団は、選択前の二重陽性胸腺細胞を表し、TCRベータ中間CDファイブ中間集団は、正選択を開始する細胞で構成されています。この集団または以前の集団の世代障害は、欠陥のある正の選択を示唆しています。TCR Rベータ中間CD5高集団は、しかし、正の選択を受ける過程で胸腺細胞を表し、主にダブルポジティブダルとCDフォーポジティブで構成されています。

CDの8つの低胸腺細胞。TCRベータ高CD5高人口は、主にポストポジティブ選択で構成されています。単一陽性胸腺細胞は、CD4、単一陽性からCD8の比率で変化します。

この集団内の単一の陽性細胞は、正常な先行集団にもかかわらず、系統コミットメントの変化を示唆している可能性があります。さらに、この集団が存在しないことは、陰性選択が小さな抗原特異的集団の欠失を伴うため、正選択後の胸腺細胞の生存率の低下を示している可能性があります。このプロセスの欠陥は、TCRトランスジェニックマウスを使用してHY CDで最もよく観察されます。トランスジェニックH-Y-T-C-Rを発現する4匹のマウスの胸腺細胞は、モノクローナル抗体T 3.7で検出できます。

H-Y-T-C-Rは、MHCクラス1db内に提示される男性特異的HY抗原を認識します。したがって、HY CDの4匹の雄マウスは、H-Y-T-C-R陽性胸腺細胞の負の選択を受け、T-3.7陽性CDの8つの陽性の二重陽性胸腺細胞数の減少、およびT 3.7陽性CDの8つの単一陽性のthy細胞数のより劇的な減少によって示されます。対照的に、HY CDの4匹の雌マウスは、正の選択を受けてT 3.7陽性CDの8個の単一陽性T細胞を産生する。

二重陽性のthy数の減少は陰性選択を示していますが、抗原特異的な単一陽性胸腺細胞の不在が最も正確な尺度です。さらに、HY CDの雄マウス4匹の少数のT、3点70陽性CD、8個の単一陽性胸腺細胞を調べると、ほとんどがCD24の高未熟細胞であることが明らかになりました。HY CD 4匹の雌のほとんどのT3点70陽性CD8個の単一陽性胸腺細胞は成熟に達し、CD24が低く、さらなる支持を提供する一方で、HY CD 4匹の雄マウスでは陰性選択が起こる。

TCRトランスジェニックモデルの1つの注意点は、TCRおよびCD 69またはCD 5の発現に基づく集団を同定することにより、正の選択をさらに特徴付けることが困難であることです。これは、THY CYTEの発達全体を通じて高いTCR発現のために、HY CD 4匹の雌マウスは、正の選択を受けるT 3ポイント70の陽性二重陽性胸腺細胞の大きな集団を持っています。野生型と比較してCD 69陽性集団の増加が示すように、陰性選択は、正選択よりも高い親和性TCR刺激を伴います。これは、HY CDの4匹の雄マウスにおいて、T上のCD69の発現が3点70陽性の二重陽性胸腺細胞で高い発現を示し、ヒストグラムのピークが右にシフトする

同様の傾向は、遺伝子操作マウスの胸腺選択を解析する際にも、CD 5の発現に見られます。CD 69またはCD 5の発現を調べることで、欠陥がTCRシグナル伝達にあるのか、TCR刺激の下流の結果にあるのかを判断できます。この手法を習得すると、細胞の調製と染色に2時間半で完了し、さらにフローサイトメーターでのデータ収集にさらに1時間で実行できます。

正しく実行すると、マウスを追加するごとに約30分が追加されます。この手順を試みるときは、胸腺細胞を優しく扱い、事前に染色戦略を計画していることを確認することを忘れないでください。この手順に従います。

キリングアッセイやサイトカイン産生アッセイなどの他のアッセイは、エクスポートされた胸腺細胞が適切に機能するかどうかなどの追加の質問に答えるために実行できます。このビデオを見れば、フローサイトメトリーを使用して胸腺の部位発生を解析する方法を十分に理解できるはずです。