Name: フローサイトメトリーによる胸腺正と負の選択の検討 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: 学ぶフローサイトメトリーによるマウス胸腺内T細胞発生の解析手法。抗体カクテル染色と細胞集団解析により、免疫寛容とT細胞レパートア形成に関わる遺伝子・シグナル経路を評価できます。

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作者は彼の技術支援のために張兵に感謝したいと思います。この作品は、健康の研究（MOP-86595）のためのカナダの協会によって資金を供給された。 TABはCIHR新治験責任医師とAHFMRの学者である。博士とAIHSフルタイム学生の身分 - QHはCIHRカナダ大学院奨学金によってサポートされています。 SANは、クイーン·エリザベスII大学院奨学金によってサポートされています。博士 - AYWSはNSERC大学院奨学金によってサポートされています。

実験プロトコルの全体的なスキームについては図1を参照してください。 1。解剖<ol><li> 60×15ミリメートルペトリ皿に置き、無菌スチールメッシュスクリーン。 1単位は、組織サンプルあたり必要とされている。 </li><li>各皿にハンクス平衡塩溶液（HBSS）5mlを加える。氷の上で料理をしてください。 </li><li> CO 2とマウスを安楽死させる。 </li><li>解剖表面へのセキュアなマウス、上向きに腹側。スプレーは殺菌のため70％エタノールでマウスや毛皮がダウンつや消しされていることを確認する。 </li><li>手術用のハサミを使用して、ちょうど性器上腹部皮膚に腹切開を行うことで、解剖を開始します。あごに切開を上向きに伸びる。 </li><li>正中線から、すべての手足に沿って切開を下に拡張します。たるんだ皮膚を引いて、切開面にそれを突き止める。 </li><li>胸腺の収穫： <ol><li>切開を作るために胸骨の下部先端を持ち上げます。</li><li>肝臓を避けて、胸郭をデタッチし、各側に胸郭をカットするダイアフラムを切った。肺と心臓を避けるように注意しながら、それぞれの側に胸郭を上方にカットします。 </li><li>胸郭バックピンセットで慎重に引き抜いてください。胸腺は心臓の上方に位置する白、両葉性臓器である。ローブの底を把握するために鉗子の平らなエッジを使用して、静かに胸腺を引き、メッシュスクリーンの上に置きます。 </li></ol></li><li>脾臓を回収します。 <ol><li>脾臓は肝臓下マウスの腹腔内の左側にある赤い、サーフボード形をした臓器です。 </li><li>腹腔内に切開を加えます。優しく結合組織を離れていじめるために第2のペアを使用して、鉗子の1ペアで脾臓を引き出します。別のメッシュスクリーンで脾臓を置きます。 </li></ol></li></ol> 2。細胞調製<ol><li> 3 mlのシリンジからプランジャーを使用して、挽く唯一の結合組織と脂肪が残るまでメッシュスクリーンに臓器。皿三回からHBSSでメッシュをすすぐ。各組織試料のための新しいプランジャーを使用しています。 <ol><li>組織を均質化するためのその他のオプションについては、このメソッドの代わりに使用することができます。 </li></ol></li><li>血球計数器を用いて細胞をカウントする。 </li><li> 4℃で5分間、335×gで℃で遠心分離により細胞をペレット化</li><li>室温で10分間、ACK溶解緩衝液（0.15M NH 4 Clを 、10mMのKHC0 3、0.1mMののNa 2 EDTA、pH7.2）を500μlの脾細胞を再懸濁します。 FACS緩衝液中で20×10 6細胞/ ml（PBS、1％FCS、0.02％アジ化ナトリウム）での胸腺細胞を再懸濁し、氷上に置いておきます。 </li><li> HBSS 5mlを加えて等張性に脾細胞を返します。 FACS緩衝液中で20×10 6細胞/ mlで再懸濁し、遠心分離によってペレットは脾。細胞は無菌を維持する必要がある場合は、滅菌したRPMI +10％FCSを使用することができます。 </li></ol> 3。フローサイトメトリー用の細胞の染色このプロトコルの目的は、野生型（WT）とHYのCD4マウスを用いた正と負の選択を分析するための戦略を概説することです。フローサイトメトリー実験のデザイン、収集、および分析に関する一般的な考慮事項については、我々は董らによる優れたレビューに読者を11 参照 <ol><li>アリコート4×10 96ウェルプレートの各ウェルに、フローサイトメトリー試料につき6胸腺細胞、ならびに補償制御当たり1×10 6 WT脾。トランスジェニックマウスを用いた場合は、実験のコントロールとして、WTマウスを含める必要があります。 </li><li>氷上で10分間anti-CD16/32（クローン2.4G2）で細胞をインキュベートすることにより、Fc受容体をブロックします。 </li><li> 5分間、4℃で335 xgで皿回しをする。蓋を外し、一度プレートをフリックして井戸から液体を払拭する、シンクに伏せ。 FACS緩衝液200μlの各ウェルを再懸濁します。洗浄を繰り返します。 </li><li>下記のようにウェル当たりのFACS緩衝液200μlに希釈に基づいて、各抗体の最適濃度を用いて、抗体カクテルを準備します。各抗体の最適濃度は、正と負の集団の最大の分離を与えるために必要な最低濃度として定義されています。所与の抗体には陰性集団が存在しない場合は、アイソタイプ抗体が含まれるべきである。必要に応じて、ウェルあたり総量（ウェルあたり100μlまでなど ）に縮小することができます。 <ol><li> WT胸腺：抗TCRβ、抗CD4、抗CD8、抗CD69または抗CD5、抗CD24 </li><li>胸腺HYのCD4：抗HY TCR（T3.70）、抗CD4、抗CD8、抗CD69または抗CD5、抗CD24 CD69 loと胸腺細胞におけるCD69 ハイテク集団のより良い分離を得るためには、続いて、ビオチン化抗CD69一次抗体を使用することが推奨される二次的な蛍光標識ストレプトアビジンを含む染色。私達はuCD5染色のためのSEが同じ戦略。 </li></ol></li><li>暗闇の中で氷上で30分間、FACSバッファーで抗体カクテル200μlで細胞をインキュベートします。 </li><li>抗体カクテル染色と同時に、単一蛍光標識抗体を用いて、各補償制御を染色。理想的には、補償染色は、抗体カクテルで使用したものと同じ抗体を含んでいる。多くの抗原がアッセイされたときしかし、個々の抗原を染色すると、大きな実験用可能でないかもしれません。したがって、抗CD4または抗CD8のどちらかに染色が高いこれらの抗原の発現、または補償ビーズの使用に起因することをお勧めします。暗闇の中で氷上で30分間FACS緩衝液で染色。 1補償制御は、汚れのないままにしておきます。 </li><li> FACS緩衝液で細胞を2回洗浄します。 </li><li> FACS緩衝液およびFACSチューブへの転送中に細胞を再懸濁します。 </li><li>フローサイトメーターでサンプルを取得。 FSC認証の取得とするFSC-Wを含むダブレット識別のためLLOW。 </li></ol> 4。フローサイトメトリーデータの解析 - 非TCRトランスジェニックマウス我々は、フローサイトメトリーデータ分析のためFlowJoを使用しています。非TCRトランスジェニックマウスのゲーティング戦略のために図2Aを参照してください。 <ol><li> SSCは、 &quot;リンパ球&quot;人口で電子的にゲートによって、FSC使用。 </li><li> &quot;リンパ球&quot;集団の中では、FSC-W loの人口は、細胞のダブレットとaggregratesを除外するために電子的にゲートにFSC-Wで、FSC使用。これは、 &quot;一&quot;の門です。 </li><li> &quot;一重&quot;ゲートは、CD4、CD8、プロット内のイベントを使用します。 DN、DP 鈍い 、DP 明るい 、CD4 + CD8 LO、CD4SPとCD8SP集団、図2Bに示されるようにするためのゲートを描画します。 </li><li> CD4SPとCD8SPゲートの下では、CD24のプロットによってTCRβを作成します。 図2Cに示すように、ゲートを描画する象限·ゲーティング·ツールを使用します。 </li><li> NEを作成&quot;一重&quot;ゲートからwプロット：CD69によってTCRβ。ゲートA、B、C、Dは、 図2Dに示すように描画します。 </li><li> CD5によってTCRβ： &quot;シングレット&quot;ゲートから別のプロットを作成します。 図2Eに示すように、ゲートI、II、III、IVを描きますこれは正の選択を調べるためのもう一つの戦略です。 </li><li>ゲートI、II、III、IV、A、B、C、D（ 図2D、E）に&quot;一&quot;の下からDN、DP 鈍い 、DP 明るい 、CD4 int型、CD4SPとCD8SPゲートを適用します。 </li><li>あなたのターゲット人口に到達するまで、後続の各ゲートの周波数によって臓器の細胞数を乗じて特定のサブセット内のセルの数を計算します。たとえば、TCRβ ハイテク CD69-CD8SP胸腺細胞の数は、 胸腺細胞数×％、TCR BHIによって決定されるであろうCD69-（画分D）×％のCD8SP。 <ol><li>生細胞と死細胞は、いわゆる &quot;lymphocが含まれていませんすでにカウントすることを考慮に入れあなたの計算でyte &quot;ゲート。 </li></ol></li></ol> 5。フローサイトメトリーデータの解析 - TCRトランスジェニックマウス TCRトランスジェニックマウスのゲーティング戦略のために図3Aを参照してください。 <ol><li>前節と手順4.1と4.2に従ってください。 </li><li> &quot;一重&quot;ゲートの下で、T3.70のSSCプロットとゲートでT3.70を作成+細胞集団を抗原特異的T細胞（ 図3B）を分析する。いくつかの状況では、それは非抗原特異的（T3.70-）T細胞集団に、この集団を比較するために興味があるかもしれません。 </li><li> T3.70 +集団内では、ドローのDN、DP CD4SPとCD8SPゲート（ 図3C）。 <ol><li> WTコントロールサンプルは、 &quot;一重&quot;ゲートの下、これらのゲートを描くか、非常に少数のT3.70 +細胞が存在するとしてT3.70ゲートを作成します。 </li></ol></li><li> CD8SPゲートの下に、作成CD24のプロットによってT3.70。 4つの集団（ 図3F）にセルを分割する象限·ゲーティング·ツールを使用します。 </li><li> WTマウスとHYのCD4マウスの T3.70 + DPコンパートメント（ 図4A）のDPコンパートメント内のCD69発現を描いオーバーレイヒストグラムを作成します。 CD5発現（ 図4B）を調べることを繰り返します。 </li><li> 4.8のように、目的の各サブセット内の細胞の絶対数を計算します。 </li></ol>

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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ここで紹介するプロトコルは、非トランスジェニックTCRおよびTCRトランスジェニックマウスにおける正と負の選択を調べるために使用することができます。このプロトコルは、表面抗原の染色を説明します。分子メカニズムの更なる分析のために、それはしばしば細胞内染色を行う必要がある。我々は、ほとんどの細胞内タンパク質と転写因子のBDバイオサイエンスのFoxp3の染色キット用BD Biosciences社Cytofix / Cytopermキットを使用しています。私たちは通常、直ちに染色後に我々のサンプルを取得する。しかし、サンプルは4℃で1％ホルムアルデヒド℃の暗所でCとFACS緩衝液中で一晩保存することができます。いくつかの蛍光色素と抗体が固定と互換性がない可能性があることに注意してください。 正の選択の分析のために、私たちは、負の中間、高発現個体群の良好な分離（ 図2）を提供するために、ビオチン化抗CD69または抗CD5の使用をお勧めします。代表的な結果で述べたように、このゲーティング戦略は、2つの異なったフォローアップを必要とする可能性がありますので、系...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> Hyclone社ハンクス平衡塩溶液</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SH30030.02 </td><td></td></tr><tr><td>メタルメッシュスクリーン</td><td> Cedarlane </td><td> CX-0080-J-01 </td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿（60×15ミリメートル） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 877221 </td><td></td></tr><tr><td>シリンジ（3ミリリットル） </td><td> BD Biosciences社</td><td> 309657 </td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ（15ml）を</td><td>ザルスタット</td><td> 62.554.205 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ツァイス - プリモスター</td><td> 415500-00XX-000 </td><td></td></tr><tr><td>血球計</td><td> Hausser科学的</td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> 96ウェルプレート</td><td>ザルスタット</td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット</td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-829 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> PAA </td><td> A15-701 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> SH3025802 </td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td> ITベイカーケミカル株式会社</td><td> V015-05 </td><td></td></tr><tr><td> FcRブロッキング試薬</td><td></td><td></td><td>クローン2.4G2 </td></tr><tr><td>抗マウスHY TCR </td><td> eBioscience社</td><td> XX-9930-YY * </td><td>クローンT3.70 </td></tr><tr><td>抗マウスCD4 </td><td> eBioscience社</td><td> XX-0042-YY * </td><td>クローンRM4-5 </td></tr><tr><td> ANTI-マウスCD8α </td><td> eBioscience社</td><td> XX-0081-YY * </td><td>クローン53から6.7 </td></tr><tr><td>抗マウスCD24 </td><td> eBioscience社</td><td> XX-0242-YY * </td><td>クローンM1/69 </td></tr><tr><td>抗マウスTCRβ </td><td> eBioscience社</td><td> XX-5961-YY * </td><td>クローンH57-597 </td></tr><tr><td>抗マウスCD69ビオチン化</td><td> eBioscience社</td><td> 13から0691-YY * </td><td>クローンH1.2F3 </td></tr><tr><td>抗マウスCD5ビオチン化</td><td> eBioscience社</td><td> 13から0051-YY * </td><td>クローン53から7.3 </td></tr><tr><td>ストレプトアビジン</td><td> eBioscience社</td><td> XX-4217-YY * </td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td> BD Biosciences社 - FACS Cantoの</td><td> 338962 </td><td></td></tr><tr><td> FACSチューブ</td><td> BD Biosciences社</td><td> 352052 </td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメトリー解析ソフトウェア</td><td> TreeStar - Flowjo </td><td> FlowJo V7 / 9 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone社RPMI - 1640培地</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SH30027.01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * XXは、蛍光色素とYYバイアルサイズによって異なりによって異なります。 </td></tr></tbody></table>

フローサイトメトリーによる胸腺正と負の選択の検討

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

健康な免疫システムは、自己抗原に対する寛容を維持しながら、T細胞は外来抗原に反応している必要があります。 T細胞受容体（TCR）αおよびβ遺伝子座のランダム再配置は、自己と外国の両方に、抗原特異性の広大な多様性を有するT細胞レパートリーを生成します。胸腺での開発時にレパートリーの選択は、安全で有用なT細胞を生成するために重要です。胸腺選択の欠陥は、自己免疫疾患および免疫不全疾患1-4の発展に貢献しています。 T細胞の前駆細胞は、CD4またはCD8コレセプターを発現していないダブルネガティブ（DN）の胸腺細胞として胸腺を入力します。 αβTCRと両方共受容体の発現は、ダブルポジティブ（DP）の段階で発生します。胸腺細胞によって提示された自己ペプチド - MHCとαβTCR（pMHC複合）との相互作用は、DP胸腺細胞の運命を決定する。高親和性相互作用負の選択と消去又はにつながる自己反応性胸腺細胞のる。 CD4または自己MHCによって提示された5外来抗原を認識することができるCD8シングルポジティブ（SP）はT細胞の正の選択と開発における低親和性の相互作用の結果。 ポジティブセレクションは、成熟T細胞の生成を観察することによって、ポリクローナル（野生型）TCRレパートリーを持つマウスで検討することができます。しかし、彼らは小さな抗原特異的集団の削除を伴う負の選択の研究のために理想的ではありません。多くのモデル系は、負の選択を検討するが、生理学的事象6を再現する能力に変化させるために使用されてきた。外来抗原の投与が胸腺細胞7-9の非特異的欠失につながることができますたとえば、胸腺細胞のin vitroで刺激すると 、親密に選定に関与している胸腺環境を欠いている。現在、 生体ネガティブセレクションで勉強するための最良のツールはtransgを表現するマウスである自己抗原内因用enic TCRの特定。しかし、多くの古典的なTCRトランスジェニックモデルは時期尚早の負の選択で、その結果、DNの段階でトランスジェニックTCRα鎖の早期の発現によって特徴付けられる。私たちの研究室では、10野生型マウスで発生する負の選択がSP遷移にDPの中に発生することができ、トランスジェニックHYTCRαが条件付きでDPステージで表現されたHYのCD4モデルを開発しました。 ここでは、HYのCD4マウスモデルにおける胸腺の正と負の選択を検討するために、フローサイトメトリーベースのプロトコルを記述します。 HYのCD4マウスにおける負の選択は非常に生理的であるが、これらの方法は、他のTCRトランスジェニックモデルに適用することができます。我々はまた、遺伝子操作されたマウスに適用ポリクローナルレパートリーに正の選択を分析するための一般的な戦略を提示します。

生理的TCRトランスジェニックモデルとWTマウスでは、正の選択は、抗原遭遇の後、DP 鈍い段階に移る前に、DP 明るい段階から始まります。 DP胸腺細胞鈍いその後CD4SPまたはCD8SP胸腺細胞（ 図2B）になる前に、過渡的CD4 + CD8 loの段階に入る。成熟したSPの胸腺細胞は、高いTCR発現およびCD24（ 図2C）の損失によって特徴付けられる。更新CD69またはCD5によってTCRβを調べ、正の選択の欠陥を明らかにすることができ、CD4によるCD8は、欠陥がどこにあるさらなる洞察を提供することができます。 CD69とCD5の両方がこれらのマーカーのより高い発現を駆動する強い相互作用で、TCR刺激後にアップレギュレートされる。 CD69プロットによってTCRβで、ゲート（TCRβLO CD69-）を事前選択DP胸腺細胞の人口を表し、ゲートB...

我々は、T細胞の発達を調べるためにフローサイトメトリーベースの方法を提示する<em生体内で&gt;</em&gt;野生型またはT細胞受容体トランスジェニック背景に遺伝子操作されたマウスを用いた。

健康な免疫系には、T細胞が自己抗原に対して耐性を維持しつつ、外来抗原に応答することが不可欠である。T細胞のランダムな再構成は...

本実験の目的は、フローサイトメトリーを用いてマウスにおける胸腺の発達を調べることです。これは、マウスの胸腺および脾臓から単一細胞懸濁液を調製することで達成されます。次に、特定の胸腺細胞集団を同定するため、胸腺細胞および脾細胞を抗体カクテルで染色します。最終的に、さまざまなリンパ球集団の頻度と数は、フローサイトメトリー解析によって評価することができます。この手法は、機能的かつ自己寛容なT細胞レパートリーを形成するためにどの遺伝子や経路が重要であるかなど、T細胞分化における主要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法は胸腺におけるT細胞分化に関する知見を提供しますが、他の免疫細胞の分化の検討にも適用可能です。一般的に、この方法に不慣れな方は、フローサイトメトリー用の抗体カクテルの設計に苦慮することがあります。解剖を開始する前に、60×15 mmのペトリ皿に滅菌済みのスチールメッシュスクリーンを配置してください。次に、皿に5 mLのHBSSを加え、胸腺を採取するために皿を氷上に保管します。まず、ピンセットを用いて胸骨の下端を持ち上げ、横隔膜を露出させます。次に、肝臓を避けながら横隔膜を切開して肋骨を切り離し、肺と心臓を傷つけないように注意しながら、両側の肋骨を上方に向かって切断します。次に、鉗子を用いて肋骨を慎重に押し広げます。胸腺は心臓の上に位置する白い2葉の器官です。鉗子の平らな端を使用して、葉の下端を把持します。次に、胸腺を慎重に引き出し、あらかじめ準備したメッシュスクリーンの一つの上に置きます。脾臓を採取するには、腹膜を切開して腹腔を露出させます。脾臓は、マウスの腹腔内の左側、肝臓の下にある、赤いサーフボードのような形状の器官です。次に、1組のピンセットで脾臓を取り出し、別のピンセットで結合組織を切り離します。その後、摘出した脾臓を別のメッシュスクリーン上に置きます。3 mLシリンジのプランジャーを使用して、結合組織と脂肪だけが残るまで、各臓器をメッシュスクリーン上ですり潰します。細胞とHBSSをピペットで吸い上げ、15 mLコニカルチューブに移します。次に、各メッシュを新鮮なHBSで3回洗浄します。続いて、335 ×g、4 °Cで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。上清を吸引した後、脾臓の赤血球を溶血させるため、細胞を500 µLのCK溶解バッファーに懸濁し、室温で10分間放置します。胸腺細胞をFAXバッファーを用いて20 × 10⁶ cells/mLに懸濁し、氷上に置いておきます。次に、細胞を再度遠心分離した後、5 mLのHBSSを加えて細胞を等張性に的に戻します。赤血球を除去したペレットを、FAXバッファーを用いて20 × 10⁶ cells/mLに再懸濁します。このステップは、分注することから始めてください。96ウェルプレートの各ウェルに、フ

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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この記事では、スペクトルサイトメトリー、蛍光色素を区別するために、発光スペクトルの形状を使用するフローサイトメトリーでの新しいアプローチを説明します。このアルゴリズムは、補償を置き換え、独立したパラメータとして自家蛍光を扱うことができます。この新しいアプローチは、固形臓器から単離された細胞の適切な分析が可能になります。...

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7 免疫細胞サブセット 2 螢光色素の差別フローサイトメトリー

ここでは、フローサイトメトリーによる腹膜、脾臓、および骨髄組織におけるマウス免疫B細胞区画の不均一性の単純な分析について説明する。プロトコルは、他のマウス組織に適応し、拡張することができます。...

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マウス胸腺上皮細胞の単一細胞懸濁液の調製とフローサイトメトリー分析のための細胞内分子の染色のためのプロトコルについて説明します。...

マウス胸腺上皮細胞のシングルセル懸濁液の調製とフローサイトメトリー解析のための細胞内分子の染色

学ぶフローサイトメトリーによるマウス胸腺内T細胞発生の解析手法。抗体カクテル染色と細胞集団解析により、免疫寛容とT細胞レパートア形成に関わる遺伝子・シグナル経路を評価できます。

フローサイトメトリーによる胸腺正と負の選択の検討

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