単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞の精製

この手順の全体的な目標は、胸腺上皮細胞または技術を分離、同定、精製することです。これは、まず胸腺を酵素的に消化し、機械的に破壊して、技術を単一の細胞懸濁液に解離させることによって達成されます。次に、この技術はフローサイトメトリーで解析するか、パンニング戦略で濃縮することができます。

最終的に、胸腺上皮サブセットは、蛍光活性化細胞ソーティングによって精製できます。この方法は、胸腺上皮細胞が胸腺選択をどのように促進するかなど、T細胞発生の分野における多くの重要な質問に答えるのに役立ちます。老化した動物の胸腺機能障害の原因と、in vitroでT細胞の再構成をどのように達成できるのでしょうか?

この技術の主な利点は、可変エミック胚細胞の高い回収率、エミック上皮細胞の偏りのない濃縮、および細胞選別によって最終的に達成できる高純度です。胸腺間質細胞を単離するには、まず、肋骨のすぐ下にあり、心臓を覆う2つの薄い白い葉のように見える胸腺を特定します。次に、胸腺を囲む結合組織を切断し、湾曲した鋸歯状の鉗子を使用して胸腺葉をそっと引っ張って取り除きます。

ローブを5ミリリットルの培地を含む6ウェルプレートに入れ、周囲の脂肪と結合組織をトリミングします。次に、トリミングされた葉を、新たに調製した酵素溶液の5ミリリットルを含む新しいウェルに移し、細かいはさみを使用して組織に小さな切開を行います。プレートを摂氏37度のインキュベーターに入れます。

20分後、5ミリリットルのピペットで組織を数回静かに上下させ、スラリーを単一細胞懸濁液に解離します。上清画分を、10ミリリットルの冷たいアルブミンリッチバッファーを氷上に含んだ50ミリリットルのチューブに集めて、酵素を中和します。次に、残りの組織に2.5ミリリットルの酵素溶液を加えます。

プレートを15分間インキュベートします。その後、18遺伝子針を備えた3ミリリットルの注射器で組織を穏やかに攪拌し、凝集体を分解します。次に、を収集チューブに移します。

次に、残りの組織に2.5ミリリットルの酵素溶液を加えます。プレートを15分間インキュベートします。3回目のインキュベーション後、20本の5G針で機械的攪拌を繰り返します。

組織を最後の5〜10分間インキュベートした後、上清をコレクションチューブに移して遠心分離し、フローサイトメトリーで回収された技術を特定します 標準的な抗体染色手順に続いて、サンプルをマルチパラメータフローサイトメーターで実行し、適切なファックス分析ソフトウェアを使用してデータを分析して、パンニング法によって技術をさらに強化します。まず、濃縮に適した抗体で細胞をインキュベートします。次に、細胞懸濁液をあらかじめコード化されたパンニングプレートに加え、プレートを渦巻いて室温でインキュベートします。

30分後、プレートを激しく渦巻かせ、上清を円錐形のチューブに移します。プレートを新鮮な中程度で2回すすぎ、コレクションチューブに洗浄液を溜めます。次に、細胞をスピンダウンした後、ペレットを5ミリリットルの新鮮な培地に再懸濁し、細胞懸濁液を新しいパンニングプレートに移し、先ほど示したように渦巻き状にしてインキュベートした後に細胞を収集し、濃縮された技術をさらに胸腺細胞サブセットに精製します。

適切な抗体で標識した後、100μmのノズルで蛍光活性化細胞選別を行い、培地中のFBS1体積あたり30%の容量で細胞を回収します。フローサイトメトリーによって技術を同定するためのこの代表的なゲーティング戦略では、技術による epca の発現は観察できますが、CD 45 の発現は観察されません。したがって、技術は、それらのep、cammおよびCD 45発現技術に従ってゲートすることができ、皮質またはCECおよび髄質またはmtech胸腺上皮サブセットで構成されています。

これらのサブセットは、ctecが発現するGグルタミルアミノペプチダーゼを認識する生51抗体と、ctechとMtechの両方が表面にMHCクラス2を発現するレクチンUEA抗体によって区別できます。mtechはさらにMHC 2の発現のレベルによってmtechの低いおよびmtechの高い集団に分類することができるが、およそ8倍のtechはちょうど示されたliase酵素によって基づいたプロトコルを使用してちょうど示されたliaseの酵素によって回復することができるプロトコルと比較されるちょうど10に約9回10のちょうど10のプロトコルと比較され、ちょうど1つのマウス胸腺から選別時間を短縮し、生存率を高めるために回復することができる回収された間質細胞。パニングは、調製された胸腺細胞全体と比較して胸腺細胞部位を枯渇させるために、今示したように使用できます。

技術の割合は、濃縮後の細胞集団で0.5%未満から15%以上に増加します。パン後、技術サブセットの比率は変更されないため、パン中にどちらのサブセットも選択的に失われないことがわかります。preen濃縮サンプルと比較して、技術の回収率は約85%このビデオを見た後、パニックによってより多くのthansからthemic生殖細胞を濃縮する方法、およびフローサイトメトリーによってより多くのthemic上皮鎮静を特定して精製する方法についてよく理解しているはずです。