C. elegansの走化性アッセイ

次の実験の全体的な目標は、シンプルで安価なアッセイを使用して、C eleganceの走化性反応を定量化することです。これは、ステージ化されたワームを分離し、マークされたプレートの中心に配置することによって達成されます。各施設に堆積したすべての試験施設と対照施設から等距離には、対象化合物または対照化合物があり、どちらも線虫が近づくと止まる麻酔薬と組み合わされています。

60分後、プレート上の線虫の最終的な分布を集計し、線虫の位置の比率を使用してアッセイインデックスを提供します。最終的には、特定の化合物に対する海のエレガンスの魅力を定量化することで、実験操作の挙動への影響を評価することができます。この手法の主な利点は、前任者の多くの有益な側面を含みながら、使いやすさを向上させることです。

このアッセイは、シーエレガンスの挙動に関する洞察を提供し、神経遺伝学的操作や他の神経生物学的アッセイと組み合わせて特に有用です。走化性寒天またはNGMを充填した5センチメートルプレートから始めます。プレートの下側を4つの等しい象限にマークします。

試験対象の遺伝子株および試験条件ごとに、少なくとも3回の試行のために少なくとも3枚のプレートを準備します。次に、原点から半径0.5センチメートルの円をマークします。次に、反対側の象限のポイントをテスト用のTまたは制御用のCでマークし、サイトが原点から等距離にあり、互いに等距離にあることを確認します。

このアッセイでは、ポイントは原点から少なくとも2cm離れている必要があります。5cmの走化性プレート上で同期発達中の若年成虫を調製しました。発生段階が異なる線虫は、分析物に対して異なる反応を示す場合があります。

そのため、アッセイに用いるすべての線虫が同じ発生段階にあることが非常に重要です。ワームがOP 50 e coliの芝生をクリアしたら、2ミリリットルのS基礎バッファーをプレートにピペットで移します。プレートを操作して、すべてのワームをバッファーに入れ、ワームを洗浄します。

緩衝液中の線虫1ミリリットルをマイクロ遠心チューブにピペットで移し、10秒間遠心分離します。6, 600 RPMのピコフージを使用して、バジルとして吸引し、ワームのペレットを邪魔せずに残します。次に、同じ方法を使用してこれらのワームをさらに3回洗います。

まず、Sバジルバッファーをチューブに加え、チューブを反転させてワームを溶液に戻します。最終洗浄後、ワームをさらに10秒間遠心分離し、上清を最終容量100マイクロリットルまで吸引します。次に、洗浄したワームの2マイクロリットルをペレットからNGMプレートにピペッティングして、十分な密度のワームを確保します。

少なくとも 50 匹のワームが必要ですが、250 匹を超えるワームは存在しません。ワームが多すぎる場合は、ESPバジル溶液の量を増やしてください。また、ワームが少なすぎる場合は、ワームをスピンダウンして、少量でサスペンドします。

ウォームチューブをヒュームフードにセットします。準備が完了すると、ワームは最大1時間化学療法の税金アッセイに使用できます。まず、溶液を準備します。

等量の試験化合物を麻酔薬0.5モルアジドと組み合わせて、試験溶液を混合します。次に、試験化合物を希釈するために使用した溶媒のコントロール溶液を0.5モルのアジ化ナトリウムと混合します。次に、テストプレートを準備します。

まず、ペレットから2マイクロリットルのワーム溶液を試験プレートの起点にピペットで移します。次に、臭気物質を2マイクロリットルの試験溶液にピペットで2つのTサイトに追加し、制御溶液の2マイクロリットルを2つのTサイトにピペットで移します。ワームと臭気滴が寒天に吸収されたら、蓋を元に戻し、プレートを反転させ、アッセイ時間を60分待ちます。

ナトリウムの場合。ASIの拡散時間は、試行間で標準化する必要があります。ワームは臭気物質の直前に加えることが重要です。

また、各プレートは完全に準備され、次のプレートを準備する前にそのアッセイを開始する必要があります。60分間の試用後、ワームを摂氏4度の冷蔵庫に入れます。後で、プレートを数えることができるようになったら冷蔵庫からプレートを取り出します。

それらをすぐに数えず、ワームを室温に置いておくと、ワームが動員できる可能性があります。又。データから内側の円から完全に外れた線虫の位置を記録します。走化性指数を計算します。

値の範囲は負の 1 から正の 1 で、最大の反発力から最大引力までを表します。テスト象限と制御象限の両方で制御ソリューションを使用してプロセスを繰り返します。これはコントロールプレートとして機能します。3。

このようなプレートは、実験条件ごとに作成して実行する必要があります。ジアセチル。既知のCエレガンス化学療法誘引剤を使用して、野生型の線虫をジアセチルの受容体を欠く変異体と比較しました。予想通り、ジアセチルは野生型線虫から有意な化学療法引力反応を誘発しました。

対照的に、ODR 10変異体は、一度習得したコントロール化合物エタノールのようにジアセチルに引き付けられなくなりました。この手法は、適切に実行すれば90分以内に完了できます。このビデオを見れば、分析種溶液に対するSea Eleganceの走化性反応を効率的に評価する方法を十分に理解できるはずです。

テストされたすべてのワームが同期した開発段階を獲得し、十分な数のワームが使用されるように、特別な注意を払ってください。各試行。