C. elegansの走化性アッセイ

以下の実験の全体的な目的は、簡単で安価なアッセイを使用してCエレガンスの化学走性反応を定量化することです。これは、ステージングされたワームを分離し、プレートの中央に配置することで達成されます。すべてのテストおよび制御部位から等距離にある各部位には、関心のある化合物または制御化合物が、ワームが近づくにつれてワームを停止させる麻酔薬と組み合わせて配置されます。

60分後、プレート上のワームの最終的な分布を集計し、ワームの位置の比率を使用してアッセイ指数を提供します。最終的に、海の優雅さのある特定の化合物への引力を定量化することで、基礎となる実験操作の行動的結果を評価することができます。この技術の主な利点は、その先行技術の多くの有益な側面を含みながら、より使いやすさを可能にすることです。

このアッセイは、海のエレガンスの行動に関する洞察を提供し、特に神経遺伝学的操作やその他の神経生物学的アッセイと組み合わせて有用です。5センチメートルのプレートに化学走性アガーまたはNGMを載せることから始めます。プレートの裏側を4つの等しい四分円に分割します。

テストされる遺伝株ごとおよびテストされる条件ごとに少なくとも3枚のプレートを少なくとも3回の試行のために準備します。次に、原点の周りに0.5センチメートルの半径の円をマークします。次に、反対側の四分円にテストの場合はT、制御の場合はCとマークし、部位が原点および互いに等距離であることを確認します。

このアッセイでは、部位は原点から少なくとも2センチメートル離れている必要があります。5センチメートルの化学走性プレート上で同期した発育の若い成体ワームを準備しておきます。発育段階が異なるワームは、分析物に対して異なる反応を示す可能性があります。

そのため、アッセイで使用されるすべてのワームが発育の同じ段階にあることが非常に重要です。ワームがOP 50 e coliの層を消去したら、プレートにS基礎バッファーを2ミリリットル注入します。プレートを操作して、すべてのワームをバッファーに移動させ、ワームを洗浄します。

バッファーにワームを1ミリリットル注入し、マイクロ遠心チューブに入れ、10秒間遠心分離機で遠心分離します。ピコフュージを6,600 RPMで回転させ、アスピレートしてベースを残し、ワームのペレットは動かさずにそのままにします。次に、同じ方法でワームをさらに3回洗浄します。

Sベースバッファーをチューブに加えてチューブを反転し、ワームを溶液に戻します。最後の洗浄の後、ワームをさらに10秒間遠心分離し、最終的に100マイクロリットルの容積になるまで上清をアスピレートします。次に、NGMプレート上にペレットから2マイクロリットルの洗浄したワームを移行して、十分なワームの密度を確保します。

少なくとも50匹のワームが必要ですが、250匹を大きく超えることはできません。ワームが多すぎる場合は、ESPベース溶液の容積を増やします。ワームが少なすぎる場合は、それらを遠心分離して再懸濁し、より少ない容積で懸濁します。

ワームチューブをフュームフードに入れます。準備ができたら、ワームは最大1時間化学走性アッセイに使用できます。まず、溶液を準備します。

テスト溶液を、テスト化合物と0.5モルのアジド麻酔薬を等量で組み合わせることで混合します。次に、テスト化合物を希釈するために使用した溶媒の制御溶液を0.5モルのナトリウムアジドと混合します。次に、テストプレートを準備します。

まず、テストプレートの原点にペレットから2マイクロリットルのワーム溶液を注入します。次に、臭気物質を加え、テスト溶液を2つのT部位に2マイクロリットル注入し、制御溶液を2つのC部位に2マイクロリットル注入します。ワームと臭気物質の滴がアガーに吸収されたら、蓋を戻し、プレートを反転させ、60分アッセイ時間にします。

ナトリウム。アジの拡散時間を試行間で標準化するために。ワームを臭気物質の直前に追加することが重要です。

また、各プレートを完全に準備し、次のプレートを準備する前にアッセイを開始する必要があります。60分間の試行の後、ワームを4度セルシウスの冷蔵庫に入れます。後に、プレートを冷蔵庫から取り出し、数えることができる状態になったら取り出します。

ワームをすぐに数えず、室温で放置すると、ワームが動き始める可能性があります。再度。データから、内側の円を完全に渡ったワームの位置を記録します。化学走性指数を計算します。

この値は-1から+1の範囲で、最大反発から最大吸引を表します。テストおよび制御の四分円の両方で制御溶液を使用してプロセスを繰り返します。これは制御プレートとして機能します。3。

このようなプレートは、各実験条件に対して作成および実行する必要があります。ジアセチル。既知のCエレガンス化学吸引物質が、ジアセチル受容体を持たない変異体と野生型ワームを比較するために使用されました。予想通り、ジアセチルは野生型ワームから有意な化学吸引反応を引き起こしました。

対照的に、ODR 10変異体は、エタノールという制御化合物と同じようにジアセチルに引き付けられませんでした。この技術を習得すると、適切に行われれば90分以内で完了できます。このビデオを見て、アナログ溶液に対する海のエレガンスの化学走性反応を効率的に評価する方法について十分な理解が得られるはずです。

すべてのテストされたワームが同期した発育段階を達成し、十分な数のワームが使用されていることを確認するために特別な注意を払ってください。各試行。