Name: のオンデマンド定量分析のためのマイクロ流体ベースの走電性線虫（Caenorhabditis elegans） ロコモーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学ぼう、マイクロ流体電気走性を用いてCaenorhabditis elegansの運動を定量評価する方法。シリコンウェハとPDMSで微細チャネルを作製し、神経・筋系の異常をスクリーニングする低コストで高感度なアプローチです。

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著者は、財政支援のために彼らの初期の研究者賞プログラムを通じて自然科学とカナダの工学研究評議会、カナダリサーチチェアプログラム、保健研究のカナダの協会、および研究とイノベーションのオンタリオ州省に感謝したいと思います。

1。マスター金型製作のためのフォトリソグラフィー<ol><li> 30秒後、30秒、メタノール、アセトン、シリコンウェハー3インチ浴びる。 5分間のdH 2 0水で洗い流してください。 </li><li> N2ブローガンでウェハの表面を乾燥させる。 2分間140℃のホットプレート上のウェハを加熱。 </li><li>プラズマは、シリコンウェハ（1分間、50 W）の表面を酸化させる。 </li><li> 3ミリリットルSU-8フォトレジスト100（; 1,750 rpmで40秒）をスピンコートウェハの表面。 </li><li> 65℃のホットプレート上でプリベークコーティングウェーハ℃で10分間、その後95℃で2分間にわたって温度を上昇。さらに1時間のために、この設定を維持します。 </li><li>希望するチャネル設計を含むフォトマスクの位置を合わせます。 UV光の550から600 MJ / cm 2と （350-400 nm）のに抵抗を公開。フォトマスクは、AutoCADで設計され、高解像度の印刷で透明で印刷することができる。 </li><li> Tをランピングポストベーク65℃のホットプレート上のウエハ℃で10分間で1分、95℃でC、以前のように彼は温度。 </li><li> 10〜15分間SU-8現像液にウェハを浸し。イソプロパノールでリンスすることにより、開発の完了を確認してください。白色の沈殿物が表示された場合は、開発を継続。マスターモールドは、 図2Aに示されている。 </li></ol> 2。マイクロチャネル作製用ソフトリソグラフィ<ol><li> 3.5ミリリットルPDMS硬化剤と35ミリリットルポリジメチルシロキサン（PDMS）エラストマーベースを混ぜる。 </li><li>アルミホイルで裏打ちペトリ皿に製造されたマスターモールド（パターンが上向き）とブランクシリコンウエハーを置きます。 </li><li>マスター型皿と第二皿に15ミリリットルに20ミリリットルPDMSプレポリマーを注ぐ。優しく使い捨て木製のアプリケーターでそれらを押すことによってウェハの下にエアポケットを排除します。 </li><li>両方の料理をカバーし、治すための日に取っておく。あるいは2について、より速く硬化のために、真空脱気装置を用いたPDMSから気泡を除去した後、80℃のホットプレート上に皿を残す°CHR。 </li><li>ウェーハから箔とPDMS皮を取り除きます。 </li><li>チャネルの両端に流体アクセスポートをパンチするためにハリスユニコア（2.5 mm）を使用します。同様のサイズのストリップにチャンネルとブランクPDMSをカットします。 </li><li>プラズマ酸化剤にチャネル、ブランクPDMSストリップとスライドガラス（75×25ミリメートル2）をロード、おそらくクリーンルームに位置。 40 Wパワーで40秒間酸素プラズマにさらす。 </li><li>ブランクストリップの反対側へのチャネルピースとスライドガラスを貼り付けます。結合を完了するには2時間のために取っておく。 </li><li> 120℃のホットプレート上にアセンブリを置き℃にPDMSプレポリマーを使用してパンチの貯水池に、それぞれの長い少なくとも6インチ（内径1/32 &quot;、外径3/32&quot;）プラスチックチューブを取り付けます。一方または両方のチューブに貼り、流体プラスチックコネクタシリンジ添付ファイルを許可するか、市販の金具を使用する。 </li><li> PDMSは、治すためにチューブを固定できます。 EACに22ゲージの絶縁銅線の3 &quot;の長さを挿入hの入口管とチャネルの間に貯水池と、PDMSプレポリマーで固定します。完成品は、 図2Bに示されている。 </li></ol> 3。走電性実験<ol><li>モニタ（ 図1）に接続され搭載されたカメラと顕微鏡のステージ（望ましくはXY-可動）にマイクロチャネルを置きます。 </li><li>のマイクロ電極に電源やアンプの出力線を接続。 DC信号が所望される場合にのみ、単純なDC電源は十分であるが、関数発生器に接続された増幅器も同様にパルスDC及びAC信号の印加を可能にする。 </li><li>使い捨て注射器にマイクロチャネルの出力管を取り付けます。水没M9生理的緩衝液中入口管の口をゆっくりと注射器（手動またはシリンジポンプを用いて）内の負圧を適用してチャネルに液体を熱望する。入口および出口管はM9が充填されている両方の場合には、注射器fを切断するロムチューブ。静水圧駆動流を防止するために同じ高さの両方の管を水平。 </li><li>チャネルに直流電圧を​​印加し、その抵抗性を確保（R = V / I）は0.6MΩ（長さ50mm、幅の広い0.3ミリメートルとマイクロチャネルの深〜0.1ミリメートルの場合）程度である。 </li><li>チャンネルの整合性に満足している場合、チャネルに希釈懸濁液からワームをロードするには、上記の手順に従ってください。 </li><li>シリンジを外し、水圧管の相対的な高さを調整することにより、流れを操作します。チャネルの中心にワームを配置し、同じ高さで、両方のチューブが平らにするために、このメソッドを使用します。 </li><li> L3段動物のための4-12 V / cmのL4sための4-10 V / cmであり、若者のために2-4 V / cmで：適切な電圧の電源を設定します。電気信号をアクティブにして、フィールドに順応するためにワームの事前暴露の1分を可能にします。ワームは、陰極に向かって移動を開始する必要があります。分が経過すると、録音を開始するには、カメラを使用しています。 </li><li> ACおよびパルスに対する7,8を必要に応じて、dはDC実験では、最大応答電界が信号の前記周波数およびデューティサイクルから採用することができるが変調することができる。 </li><li>実験が終了すると、チャネルからすべての液体（やワーム）を削除、のdH 2 0でそれを洗い流し、そして℃の乾燥する125℃のホットプレート上のデバイスにしておきます。 </li><li>手動NIH ImageJの（使用して録画したビデオからの運動器官のデータを抽出<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ）またはカスタムMATLABベースのワームトラッキングソフトウェアを。 </li></ol>

<ol><li>Kuwahara, T., Koyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Familial+Parkinson+mutant+%CE%B1-synuclein+causes+dopamine+neuron+dysfunction+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).</li>
<li>Kuwahara, T., Koyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+reveals+involvement+of+endocytic+pathway+in+neuronal+dysfunction+in+a-synuclein+transgenic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic.</a> 17 (19), 2997-3009 (2008).</li>
<li>Su, L. J., Auluck, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).</li>
<li>Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfluidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment.</a> Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).</li>
<li>Salam, S., Ansari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics+set+up+to+study+neuronal+degeneration+and+identification+of+neuroprotective+compounds+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans.</a> , Submitted (2013).</li>
<li>Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+sorting+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Electrical sorting of Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).</li>
<li>Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pulse+direct+current+signals+on+electrotactic+movement+of+nematodes+Caenorhabditis+elegans+and+Caenorhabditis+briggsae%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae.</a> Biomicrofluidics. 5 (4), 044116(2011).</li>
<li>Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+Caenorhabditis+elegans+in+alternating+electric+field+and+its+application+to+their+localization+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control.</a> Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702(2010).</li>
<li>van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+model+identifies+genetic+modifiers+of+alpha-synuclein+inclusion+formation+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging.</a> PLoS Genet. 4, e1000027(2008).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+mediate+electrosensory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).</li>
<li>Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectrophoresis+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).</li>
<li>Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+system+for+measuring+parameters+of+nematode+sinusoidal+movement%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genet%22%5BJournal%5D)">An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement.</a> BMC Genet. 6, 5(2005).</li>
<li>Manière, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -M. D. i, Hersen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Running+worms%3A+C.+elegans+self-sorting+by+electrotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis.</a> PLoS One. 6 (2), e16637(2011).</li>
</ol>

マイクロ流体走電性アッセイ技術は、アメリカとカナダ、米国で特許を申請しました。

最初荘や同僚11,12の誘電泳動操作作業にガベルと同僚や建物によって記述行動現象を利用して、当社のマイクロ流体ベースの走電性アッセイは、動きをとして使用してワームに神経活動を調べるため、簡単に堅牢かつ感度の高い方法を提供しています出力。運動パラメータの解析は異なる遺伝子型間の定量的な比較を可能にします。マイクロ流路の作製と電界印加の精度が一緒に制御可能な環境と運動制御用のワームと通信するための手段の両方を提供します。異なる電気信号の波形は、ウォームで異なる行動の反射を持ち、両方の運動を刺激し、阻害するために使用されてきた。 現在のマイクロ流体デバイスのシングルチャネル設計は、単一のワームが一度に得点されている必要があります。このため、ウォーム溶液を十分にM9希釈しなければならないチャネルにワームをロードする前にバッファ。チャンネル操作が静水圧に影響を及ぼす気泡や他の不規則性の存在によって複雑になることを指摘することが重要である。これは、M9のチャネルをフラッシュし、入口および出口管の昇降を操作することによって除去することができる。 <p class="...

<table><tbody><tr><td>アセトン</td><td>CALEDON Labs</td><td>1200-1-30</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>CALEDON Labs</td><td>6700-1-30</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>CALEDON Labs</td><td>8600-1-40</td><td></td></tr><tr><td>SU-8</td><td>Microchem Corp.</td><td>Y131273</td><td>SU-8 100</td></tr><tr><td>SU-8 開発元</td><td>(株) ミクロケム</td><td></td><td></td>Y020100</tr><tr><td>92x16mmのペトリ皿</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184のシリコーンのエラストマーのキット</td><td>ダウのコーニング</td><td></td><td>エラストマーの基盤および治癒剤を含んでいる</td></tr><tr><td>機能発電機</td><td>Tektronix Inc.</td><td></td><td>モデルAFG3022B</td></tr><tr><td>アンプ</td><td>トレック株式会社</td><td></td><td>モデル 2210-CE</td></tr><tr><td>シリンジ ポンプ</td><td>ハーバード 装置</td><td>70-4506</td><td>モデル 11 ELITE</td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>11675916Q</td><td>モデル HP131725Q</td></tr></tbody></table>

のオンデマンド定量分析のためのマイクロ流体ベースの走電性<em&gt;線虫（caenorhabditis elegans）</em&gt; &#39;ロコモーション

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

線虫線虫（Caenorhabditis elegans）があるため、疾患関連遺伝子および経路と同様に栽培の容易さのその保全の生物医学研究のための多目的なモデル生物である。いくつかのC.線虫病モデルは、例えばドーパミン作動性（DA）ニューロン1の変性を伴うパーキンソン病（PD）などの神経変性疾患を含む、報告されている。導入遺伝子と神経毒性化学物質の両方が神経保護遺伝子や化合物の2,3のための神経変性と画面の基礎の調査を可能にし、ワームでDA神経変性とそれに伴う動きの欠陥を誘発するために使用されている。 C.のような下等真核生物の画面線虫は、神経信号伝達に影響を与える化合物及び遺伝子を同定するための効率的かつ経済的な手段を提供する。従来の画面は、通常手動で実行して目視で採点され、その結果、彼らは時間両論ですumingとヒューマンエラーを起こしやすい。さらに、細胞レベルの分析で最もフォーカスが移動を無視して、これは、運動障害のために特に重要なパラメータである。 我々はC.を制御し、定量化した新規マイクロ流体スクリーニングシステム（ 図1）を開発しましたマイクロチャネル内部電界刺激を用いエレガンス &#39;ロコモーション。我々は、直流（DC）は、フィールドが確実にカソードに向かって移動（ &quot;走電性&quot;）4オンデマンド誘導することが示されている。フィールドの極性を逆にすると、ワームがすぐに同様にその方向を反​​転させる。また、ドーパミン作動性や他の感覚ニューロンの欠陥は、スイミングレスポンス5を変更することが示されている。したがって、ニューロンのシグナル伝達における異常が読み出しとして歩行を用いて決定することができる。運動応答は、正確にそのような遊泳速度、本体の曲げ周波数および反転時間などのパラメータの範囲を使用して定量することができる。 4に比べて速く移動。これらの知見は、私たちが受動的に年齢や表現型6でワームをソートする新しいマイクロ流体デバイスを設計するために導いた。 また、パルスDCにワームの応答をテストし、電流（AC）電界を交互にしています。 Cの両方でさまざまなデューティ·サイクルのパルスDCフィールドは、効果的に生成された走電性エレガンスとそのいとこでbriggsae 7。別の実験で、1ヘルツから3キロヘルツまでの周波数を持つ対称ACフィールドはチャンネル8内ワームを固定化した。 マイクロ流体環境における電界の実装では、走電性アッセイの迅速かつ自動実行を可能にする。このアプローチは、因子のハイスループット遺伝的および化学的な画面を容易にすることを約束神経機能および生存に影響を与える。

ワームトラッキングソフトウェアから野生型若い成人線虫の走電性とその位置と速度出力の代表的な映像は補足ビデオ1及び図3に示します。運動解析ソフトウェア自体は、フィールド極性の方向と極性反転の時間を認識していない、むしろ、この情報は、ソースビデオから取得する必要があります。これは、ビデオ、オーディオやビジュアルキューを使用したり、実験条件や操作を書き留めて行うことができる。 野生型（N2）及びトランスジェニック動物（NL5901）のセットから走電性速度データを図4に表示されている。 NL5901動物はUNC-54（ミオシン重鎖遺伝子）プロモーターの制御下にヒトα-シヌクレイン遺伝子を運ぶ。体壁の筋肉を集約9にα-シヌクレイン発現させ、我々の結果は、それが電気の異常を引き起こすことを示しているtrotactic応答。 NL5901ワームの速度が野生型よりも大幅に遅くなります。グラフをプロットするために、我々は個々...

にオンデマンド歩行を誘導する半自動微小電気流体方式<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;記載されている。この方法は、マイクロ流体チャネル内部の穏やかな電場（ &quot;走電性&quot;）に応答するワームの神経生理学的現象に基づいている。マイクロ流体走電性は、ニューロンの健康に影響を与える要因のための画面に迅速、高感度、低コスト、かつスケーラブルな手法として機能します。

のオンデマンド定量分析のためのマイクロ流体ベースの走電性<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt; &#39;ロコモーション

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

本手順の全体的な目的は、化学物質への曝露または遺伝子操作後のC Allerganモデル生物における、ニューロンおよび神経筋シグナリングの異常を特定することです。これは、まずシリコンウェハーにマイクロチャネルパターンを設計およびエッチングすることで達成されます。第2ステップでは、このシリコンモールドを用いて、PDMSから1つ以上のマイクロチャネルを成形します。次に、PDMSモールドに補助コンポーネントを取り付けます。続いて、マイクロチャネル内での遊泳を促された線虫の挙動を、顕微鏡に取り付けたカメラで記録します。最終的に、電気マイクロ流体デバイスを用いて、化学的または遺伝的な操作による線虫の神経系および筋肉系の変化を、移動能をリードアウトとして評価します。本手法の既存の手法、特にプレートベースの行動解析法に対する主な利点は、線虫の移動方向を厳密に制御できるため、体の屈曲頻度、回転時間、泳動速度などの移動行動を精密に定量化できることです。本手法は、神経保護作用を持つ化学的および遺伝的因子のスクリーニングに使用できるため、パーキンソン病やアルツハイマー病などの神経変性疾患の治療への応用が期待されます。もともと本手法を考案したのは、線虫の移動行動を定量的に解析する方法が不足していることに気づいたためです。運動は随意的に、かつランダムに起こるため、その特性を定義することは困難です。そこで、誰もが習得できる簡便な手法を確立したいと考えました。マスターモールドを作成するには、まず3インチのシリコンウェハーをアセトン、次いでメタノールにそれぞれ30秒間浸します。その後、脱イオン水で5分間ウェハーを洗浄します。次に、窒素ブローガンを用いてウェハ表面を乾燥させ、ホットプレートにて120 °Cで2分間加熱した後、50 Wで1分間、シリコンウェハ表面のプラズマ酸化を行います。続いて、3 mLのSU-8 100フォトレジストを用い、1,750 RPMで40秒間ウェハ表面にスピンコートし、コーティングしたウェハをホットプレートにて65 °Cでプリベイクします。10分後、2分かけて温度を95 °Cまで上げ、さらに1時間ベイクします。ホットプレートからウェハを取り出した後、目的のデザインのフォトマスクをウェハの上に配置します。フォトレジストにUV光を95秒間照射します。その後、プリベークで使用したのと同じ温度勾配を用いて、ホットプレートでウェハをポストベークします。ウェハーをSU-8に浸します。現像液で10〜15分間現像します。ウェハーをイソプロパノールで洗浄し、パターンの現像が完了したことを確認します。その後、脱イオン水で30秒間すすぎます。最後に、窒素ガンでウェハを乾燥させ、120 °Cで短時間加熱します。次に、作製したマスターモールドと未使用のシリコンウェハを、それぞれアルミホイルを敷いた別々のシャーレに入れます。PDMSプレポリマーをマスターモールド付きのディッシュに20 milliliters、ブランクウェハー付きのディッシュに15 milliliters分注します。次に、使い捨ての木製アプリケーターでウェハーを軽く押し、ウェハーの下にある気泡を除去します。その後、両方のディッシュに蓋をして、1日間静置して硬化させます。ウェハーが硬化した後、ホイルを取り除き、PDMSを剥がします。次に、2.5 millimeterのHarris unicornを用いて、マスターモールドから作成したPDMSチャネルの両端に流体アクセスポートをパンチします。両方のPDMSディスクを同様のサイズのストリップ状に切断します。その後、クリーンルーム内で、チャネル、ブランクのPDMSストリップ、およびガラススライドをプラズマ酸化装置にセットします。材料を40 Wの出力で40秒間、酸素プラズマにさらします。次に、チャネルピースとガラススライドをブランクストリップの両面に貼り付け、接着が完了するまで材料を置いておきます。2時間後、120 °Cに設定したホットプレート上で、PDMSプリポリマーを用いて、長さ6インチ以上のプラスチックチューブ2本をパンチ済みのリザーバーに取り付けます。先にPDMSを硬化させてから、次の手順に進みます。次に、シリンジを取り付けられるように、チューブの片端に流体用プラスチックコネクタを固定します。続いて、入口チューブとチャネルの間にある各リザーバーに、3インチの22ゲージ絶縁銅線を挿入し、さらにPDMSプレポリマーを用いて電線を固定します。まず、組み立てたばかりのマイクロチャネルを、モニターに接続されたカメラ付き顕微鏡のXY移動ステージに設置し、マイクロチャネルの電極に電源を接続します。マイクロチャネルの抵抗値が約0.6 mega ohmsであることを確認した後、マイクロチャネルの出口チューブを使い捨てシリンジに取り付けます。次に、入口チューブの先端を、M nine 生理緩衝液に懸濁させた線虫溶液に浸します。シリンジ内部に負圧をかけ、液体をチャネル内に吸引します。入口チューブと出口チューブの両方が満たされたら、シリンジと静水圧装置を取り外します。チューブの相対的な高さを調整して流量を制御し、チャネルの中央に線虫を配置します。次に、マイクロチャネル内の流れをゼロに維持するため、両方のチューブを同じ高さで水平に置きます。電気走性実験中に線虫のサンプルを交換する場合、両方の流入チューブを同じ高さに揃えてもまだ流れがある場合は、チューブ同士の相対的な高さを微調整してください。流れが本当にゼロであるか判断がつかない場合は、電場の極性を変えて線虫の移動方向を反転させ、旋回時の線虫の線速度を評価することで確認できます。次に、電源を適切な電圧に設定します。電気信号を作動させ、1分間の事前曝露を行い、虫を電場に順応させます。1分が経過すると、虫が陰極に向かって移動し始めます。記録を開始してください。実験終了後、チャネルからすべての液体と線虫を取り除きます。チャンバーを脱イオン水で洗浄し、デバイスを125 °Cのホットプレートに置いて乾燥させます。この代表的なビデオでは、野生型の若成体線虫の電気軸および、線虫トラッキングソフトウェアによる位置と速度の出力結果が示されています。ビデオは、右側にカソードがある状態で始まります。ガラスピペットが現れることは反転が差し迫っていることを示し、その後のピペットの除去が合図となります。ここでの反転の瞬間、ビデオ内の線虫に対するカスタム線虫トラッキングプログラムから出力された、時間に対する位置および時間に対する瞬時速度のデータが表示されます。プログラムは、位置-時間曲線から速度曲線を算出しました。この箱ひげ図は、野生型およびトランスジェニック動物の一群から得られた電気走性速度のデータを示しています。Tトランスジェニック動物は、UNC 54ミオシン重鎖遺伝子プロモーターの制御下で、体壁筋肉にヒトα-シヌクレイン遺伝子を発現させており、これによりタンパク質凝集が引き起こされ、野生型動物よりも遅い電気走性反応として現れます。習熟すれば、電気走性実験を適切に実施することで、1時間あたり20匹以上の線虫をアッセイすることが可能です。この手順を実施する際は、運動能または電気感覚に影響を与える変異や化学物質のみが、電気走性アッセイで検出可能な表現型を示すことを覚えておくことが重要です。このビデオを視聴することで、シリコーンのパターニング方法、マイクロ流路チャネルの組み立て方法、および電気走性アッセイを用いたC. elegansの運動能の解析方法について、十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

シンプルなマイクロ流体デバイスは、麻酔薬を無料で行うために開発されました...

のためのシンプルなマイクロ流体デバイス<em生体内で&gt;</emの&gt;イメージング<em&gt; Cエレガンス</em&gt;<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;とゼブラフィッシュ

自由遊泳性の線虫のような微細な生物...

自由レーザー回折を用いた微生物水泳の定量的ロコモーションスタディ

研究者は、線虫が感知して応答する電場を適用することにより、C.

Electrotaxis Assay:C. elegansの移動を観察する方法

このビデオでは、アリーナでのワームの動きを記録するためのビデオおよびトラッキングソフトウェアの使用について説明しています。このプロトコル例では、エタノール曝露がワームの移動に及ぼす影響を測定します。...

C.エレガンスMovement Tracking:線虫の移動を評価する方法

ここで紹介するテクニックは自由に単一波長露光を用いて微細な種を泳ぐのパスを測定します。 でエレガンスは、高価な顕微鏡の安価な代替としてシャドウイメージを示すために使用される。この技術は、方向、速度、加速度、力を測定するために様々な向き、環境および化学種を収容するように適合させることができる。...

の単一波長シャドウイメージング<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</emフォース予測など&gt;ロコモーション

線虫男性の効率的なカルシウム...

適応マイクロ嗅覚を用いた男性c. の Elegans頭ニューロンのフェロモン応答における神経活動のイメージング

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この記事では、カスタム マイクロ流体デバイスを用いた個々 のワームのライブ...

カエノラブディティス ・ エレガンスにおける縦断的イメージングのためのマイクロ流体プラットフォーム

生きている線虫のターゲット照射を許可する一連の固定化メソッドが確立されている保水性を持つチップの最近開発された超薄型ポリジメチルシロキサン...

極薄ポリジメチルシロキサン マイクロ流体チップを用いた保水ライブ線虫個人の固定化

本研究は、C.エレガン複合体I病ガス-1(fc21)ワーム、すなわちZebraLab(中スループットアッセイ)とWormScan(ハイスループットアッセイ)における2つの半自動運動活動分析アプローチのプロトコルを提示し、ネマトデ挙動と統合神経筋機能を定量化するための広範な研究方法の間で比較分析を提供する。...

ミトコンドリア病の ケノハブディティス・エレガンス モデルにおける動物活動量の定量化に関する実験法の比較分析

この研究では、最大のリャプノフ指数 (LLE) を測定することにより、C . elegans の運動に対する年齢の影響を調べます。年齢を重ねるにつれて、 C.エレガンスは...

Caenorhabditis elegansにおける運動の年齢依存的動力学:Lyapunov指数解析

学ぼう、マイクロ流体電気走性を用いてCaenorhabditis elegansの運動を定量評価する方法。シリコンウェハとPDMSで微細チャネルを作製し、神経・筋系の異常をスクリーニングする低コストで高感度なアプローチです。

のオンデマンド定量分析のためのマイクロ流体ベースの走電性

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