のオンデマンド定量分析のためのマイクロ流体ベースの走電性線虫（Caenorhabditis elegans） 'ロコモーション
May 2nd, 2013
にオンデマンド歩行を誘導する半自動微小電気流体方式線虫（Caenorhabditis elegans）記載されている。この方法は、マイクロ流体チャネル内部の穏やかな電場（ "走電性"）に応答するワームの神経生理学的現象に基づいている。マイクロ流体走電性は、ニューロンの健康に影響を与える要因のための画面に迅速、高感度、低コスト、かつスケーラブルな手法として機能します。
この手順の全体的な目標は、化学物質への曝露または遺伝子操作後のCアラガン病モデル生物のニューロンおよび神経筋シグナル伝達の異常を特定することです。これは、最初にマイクロチャネルパターンを設計し、シリコンウェーハにエッチングすることによって達成されます。2番目のステップでは、シリコンモールドを使用してPDMSから1つ以上のマイクロチャネルをキャストします。
次に、アクセサリコンポーネントがPDMS金型に取り付けられます。次に、マイクロチャネルを泳ぐように刺激された線虫の行動を、顕微鏡に取り付けられたカメラを使用して記録します。最終的に、エレクトロマイクロ流体工学は、運動を読み取り値とする化学的または遺伝的操作による線虫、ニューロン、および筋肉系の変化を決定するために使用されます。
したがって、この手法が既存の技術、特にプレートベースの行動アッセイと比較した場合の主な利点は、この手法を使用すると、線虫の移動方向を厳密に制御できるため、体の曲げ頻度、回転時間、遊泳速度などの移動動作を正確に定量化できることです。この技術の意味は、パーキンソン病やアルツハイマー病などの神経変性疾患の治療にまで及びます。なぜなら、神経保護特性を持つ化学的および遺伝的要因をスクリーニングするために使用できるからです。この手法のアイデアを思いついたのは、メソッドの動きの挙動を定量的に分析する方法が不足していることに気付いたときでした。
動きは自発的でランダムであり、特徴付けるのは難しいです。そこで、誰もが学べる簡単な方法を確立したいと考えました:マスターモールドを作るには、3インチのシリコンウェーハをアセトンに浸し、次にメタノールをそれぞれ30秒間浴びることから始めます。次に、ウェーハを脱イオン水で5分間すすぎます。
次に、窒素ブローガンを使用してウェーハ表面を乾燥させ、2分後にホットプレート上でウェーハを摂氏120度で加熱し、シリコンウェーハの表面を50ワットで1分間プラズマ酸化します。今SU 8 100フォトレジストの3ミリリットルを使用して、ウェーハ表面を1、750 RPMで40秒間スピンコートし、その後、65°Cでホットプレート上にコーティングされたウェーハをプリベークします。10分後、2分間かけて温度を摂氏95度に上げ、ウェーハをさらに1時間焼きます。
ホットプレートからウェーハを取り出した後、ウェーハ上に目的のデザインのフォトマスクを配置します。フォトレジストをUVライトに95秒間さらします。次に、ポストベーク後のプレベークに使用したのと同じ温度勾配を使用して、ホットプレート上でウェーハをポストベークします。
ウェーハをSU8に浸します。10 分から 15 分間のソリューションを開発します。ウェーハをイソプロパノールですすぎ、設計開発の完了を確認します。
その後、脱イオン水で30秒間すすぎます。最後に、窒素ガンでウェーハを乾燥させ、摂氏120度で短時間焼きます。次に、製作したマスターモールドとブランクシリコンウェーハを、アルミホイルで裏打ちされた2つの別々のペトリ皿に入れます。
20ミリリットルのPDMSプレポリマーをマスターモールドとディッシュに、15ミリリットルをブランクウェーハディッシュに注ぎます。次に、使い捨ての木製アプリケーターでウェーハをそっと押して、ウェーハの下のエアポケットを取り除き、両方の皿を覆って1日置いて硬化させます。ウェーハが硬化したら、ホイルをはがし、PDMSをはがします。
次に、2.5 mm の Harris ユニコーンを使用して、マスター金型から PDMS のチャネルの両端に流体アクセスポートを打ち抜きます。両方のPDMSディスクを同じサイズのストリップにカットします。次に、クリーンルームで、チャネル、ブランクPDMSストリップ、スライドガラスをプラズマ酸化剤にロードします。
材料を40ワットの電力で酸素プラズマに40秒間さらします。次に、チャネルピースとスライドガラスをブランクストリップの反対側に貼り付け、材料を脇に置いて接着を完了します。2時間後、PDMSプレポリマーを使用して、120°Cのホットプレート上のパンチリザーバーに少なくとも6インチの長さのプラスチックチューブを2本取り付けます。
PDMSが硬化するのを待ってから続行します。次に、チューブの1つに流体プラスチックコネクタを取り付けて、シリンジを取り付けます。次に、3インチの長さの22ゲージ絶縁銅線をインレットチューブとチャネルの間の各リザーバーに挿入し、より多くのPDMSプレポリマーでワイヤを固定します。
この手順を開始するには、組み立てたばかりのマイクロチャネルを顕微鏡のXY可動ステージに配置し、カメラをモニターに接続し、電源をマイクロチャネル電極に接続します。マイクロチャンネルの抵抗が約0.6メガオームであることを確認したら、マイクロチャンネルの出力管を使い捨てシリンジに取り付けます。次に、入口チューブの口をM nine生理学的緩衝液に懸濁した線虫の溶液に浸します。
シリンジ内に負圧を加えて、液体をチャネルに吸引します。インレットチューブとアウトレットチューブの両方が満たされたら、シリンジと静水圧を外します。チューブの相対的な高さを調整して流れを操作し、ウォームをチャネルの中央に配置します。
次に、両方のチューブを同じ高さで平らに置き、マイクロチャネル内の流れをゼロに保ちます。エレクトロタクシーの実験中にウォームサンプルを切り替える場合、両方の入口チューブを同じ高さに水平にした後、まだ流れがある場合は、チューブの相対的な高さを微調整します。流れが本当にゼロであるかどうかがわからない場合は、電場の極性を変更し、ワームが向きを変えるときの線速度を評価することで、ワームの動きを逆
転させることができます。次に、電源を適切なボリュームに設定しますtage.電気信号をアクティブにし、ワームがフィールドに順応するまで1分間の事前露光を待ちます。その間、1分が経過したときにワームはカソードに向かって移動し始めます。録音を開始します。
実験が終了したら、チャネルからすべての液体とワームを取り除きます。チャンバーを脱イオン水ですすぎ、デバイスを摂氏125度のホットプレートに置いて乾燥させます。この代表的な動画では、野生型の若年成虫の線虫の電気軸と、線虫追跡ソフトウェアからの出力とその位置と速度が示されています。
ビデオは右側のカソードから始まります。ガラスピペットの外観は、ピペット信号の差し迫った反転、その後の除去を示しています。ここでの反転の瞬間は、位置対時間および瞬間速度対時間出力のビデオでは、ウォームのカスタムワーム追跡プログラムのデータが、位置時間曲線から速度曲線を計算したプログラムを示しています。
この箱ひげ図は、野生型とトレンチジェニック動物のセットからの電気速度データを示しています。Tトランスジェニック動物は、UNC 54ミオシン重鎖遺伝子プロモーターの制御下で体壁筋にヒトα-シヌクレイン遺伝子を発現させ、タンパク質凝集を引き起こし、野生型動物よりも遅い電気戦術応答として現れます。一度マスターすれば、エレクトロタクシーの実験が適切に行われれば、1時間ごとに20匹以上の線虫をアッセイすることができます。
この手順を試行する際は、移動運動や電気感覚に影響を与える突然変異と化学物質のみが、Electro Taxesアッセイで検出可能な表現型を生成することを覚えておくことが重要です。このビデオを見た後、シリコーンをパターン化する方法についてよく理解しているはずです。マイクロ流体チャネルを組み立て、Axxisアッセイを用いたN法のロコモーション解析の方法
を検討しました。View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
この記事では、オンデマンドロコモーションを誘発する半自動マイクロ電気流体法について説明します。この技術は電気走性を利用し、ニューロンの健康に影響を与える要因の迅速なスクリーニングを可能にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- マイクロ流体工学
- 行動分析
背景
- 線虫Caenorhabditis elegansは、神経および神経筋シグナリングを研究するためのモデル生物です。
- 電気走性は、電界に対する神経生理学的反応です。
- マイクロ流路チャンネルは、小さな生物に対する制御された実験を可能にします。
- ロコモーションの理解は、ニューロンの健康に関する洞察を明らかにします。
研究目的
- 神経および神経筋シグナリングの異常を特定すること。
- 化学物質への暴露または遺伝子操作の影響を評価すること。
- ニューロンおよび筋肉の変化の読み取りとしてロコモーションを利用すること。
使用された方法
- シリコンウェーハにマイクロチャンネルパターンを設計し、エッチングすること。
- シリコンモールドを使用してPDMSからマイクロチャンネルを鋳造すること。
- PDMSモールドに補助部品を取り付けること。
- 顕微鏡に取り付けられたカメラを使用してワームの行動を記録すること。
主な結果
- 電気走性を使用してC. elegansのロコモーションを成功裏に誘発すること。
- 神経および筋肉系の変化の特定。
- マイクロ流路電気走性のスケーラブルなスクリーニング方法としての実証。
- 遺伝的および化学的操作の影響に関する洞察。
結論
- マイクロ流路電気走性は神経科学研究のための貴重なツールです。
- この方法は、ニューロンの健康を研究するための低コストの感度の高いアプローチを提供します。
- さらなる応用により、神経筋障害の理解を深めることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative locomotion analysis in C. elegans enables high-throughput screening for neuroprotective compounds and genetic modifiers in neurodegenerative disease models. By converting neuronal signaling defects into measurable electrotactic responses, this method supports early target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines. The microfluidic format provides scalable, reproducible phenotypic readouts that improve predictive confidence in lead identification campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking dopaminergic neuron function to quantifiable locomotion phenotypes.
- Operational Value: Enables rapid assessment of genetic and chemical manipulations affecting neuronal signaling with on-demand electrotaxis stimulation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that rescue movement defects in PD models before costly mammalian studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative outputs such as swimming speed and body bend frequency for assay readiness.
- Operational Value: Facilitates automation potential with microfluidic control of worm positioning and field polarity reversal for reversal time measurements.
- Scalability: Permits screening of over 20 worms per hour, enabling efficient primary screens for neuroprotective factors.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses locomotion as a disease-relevant functional readout that correlates with dopaminergic neurodegeneration in C. elegans PD models.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes neurotoxic effects from general toxicity by isolating neuronal signaling defects via electrotactic response alterations.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development by quantifying age-dependent electrotactic variability in young adults versus larvae.
Pipeline & Workflow Integration
The microfluidic electrotaxis assay integrates into discovery workflows as a phenotypic screening platform between target hit confirmation and lead optimization, providing mechanistic insights on neuronal viability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neuroprotective genes and compounds by quantifying locomotor recovery in disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative locomotion metrics that enable Z'-factor assessment and assay robustness evaluation.
- Analytics: Provides time-resolved position and velocity outputs for kinetic analysis of electrotactic response dynamics.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling age-dependent response variations relevant to late-onset neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cross-project screening of neuronal modulators across diverse genetic backgrounds and strain backgrounds like C. briggsae.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuronal screening by isolating locomotion as a specific readout for neuromuscular function.
- Operational Value: Standardizes worm handling and stimulus delivery, minimizing variability from manual assays and enabling cross-site reproducibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by accelerating go/no-go decisions through early phenotypic profiling of neuroprotective candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of hits based on dose-responsive electrotactic recovery in transgenic models expressing human disease proteins.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, including photolithography and PDMS bonding techniques.
- Depends on access to microscope-mounted camera systems and programmable power supplies for precise electric field control.
- Necessitates standardization of worm preparation protocols, including age synchronization and M9 buffer conditioning.
- Involves adaptation considerations when extending the assay to other nematode species or varying channel geometries.
- Limited to detecting phenotypes that affect locomotion or electro-sensation, as confirmed by source material noting that only such mutations or chemicals yield detectable responses.
