のオンデマンド定量分析のためのマイクロ流体ベースの走電性

本手順の全体的な目的は、化学物質への曝露または遺伝子操作後のC Allerganモデル生物における、ニューロンおよび神経筋シグナリングの異常を特定することです。これは、まずシリコンウェハーにマイクロチャネルパターンを設計およびエッチングすることで達成されます。第2ステップでは、このシリコンモールドを用いて、PDMSから1つ以上のマイクロチャネルを成形します。

次に、PDMSモールドに補助コンポーネントを取り付けます。続いて、マイクロチャネル内での遊泳を促された線虫の挙動を、顕微鏡に取り付けたカメラで記録します。最終的に、電気マイクロ流体デバイスを用いて、化学的または遺伝的な操作による線虫の神経系および筋肉系の変化を、移動能をリードアウトとして評価します。

本手法の既存の手法、特にプレートベースの行動解析法に対する主な利点は、線虫の移動方向を厳密に制御できるため、体の屈曲頻度、回転時間、泳動速度などの移動行動を精密に定量化できることです。本手法は、神経保護作用を持つ化学的および遺伝的因子のスクリーニングに使用できるため、パーキンソン病やアルツハイマー病などの神経変性疾患の治療への応用が期待されます。もともと本手法を考案したのは、線虫の移動行動を定量的に解析する方法が不足していることに気づいたためです。

運動は随意的に、かつランダムに起こるため、その特性を定義することは困難です。そこで、誰もが習得できる簡便な手法を確立したいと考えました。マスターモールドを作成するには、まず3インチのシリコンウェハーをアセトン、次いでメタノールにそれぞれ30秒間浸します。その後、脱イオン水で5分間ウェハーを洗浄します。

次に、窒素ブローガンを用いてウェハ表面を乾燥させ、ホットプレートにて120 °Cで2分間加熱した後、50 Wで1分間、シリコンウェハ表面のプラズマ酸化を行います。続いて、3 mLのSU-8 100フォトレジストを用い、1,750 RPMで40秒間ウェハ表面にスピンコートし、コーティングしたウェハをホットプレートにて65 °Cでプリベイクします。10分後、2分かけて温度を95 °Cまで上げ、さらに1時間ベイクします。

ホットプレートからウェハを取り出した後、目的のデザインのフォトマスクをウェハの上に配置します。フォトレジストにUV光を95秒間照射します。その後、プリベークで使用したのと同じ温度勾配を用いて、ホットプレートでウェハをポストベークします。

ウェハーをSU-8に浸します。現像液で10〜15分間現像します。ウェハーをイソプロパノールで洗浄し、パターンの現像が完了したことを確認します。

その後、脱イオン水で30秒間すすぎます。最後に、窒素ガンでウェハを乾燥させ、120 °Cで短時間加熱します。次に、作製したマスターモールドと未使用のシリコンウェハを、それぞれアルミホイルを敷いた別々のシャーレに入れます。

PDMSプレポリマーをマスターモールド付きのディッシュに20 milliliters、ブランクウェハー付きのディッシュに15 milliliters分注します。次に、使い捨ての木製アプリケーターでウェハーを軽く押し、ウェハーの下にある気泡を除去します。その後、両方のディッシュに蓋をして、1日間静置して硬化させます。ウェハーが硬化した後、ホイルを取り除き、PDMSを剥がします。

次に、2.5 millimeterのHarris unicornを用いて、マスターモールドから作成したPDMSチャネルの両端に流体アクセスポートをパンチします。両方のPDMSディスクを同様のサイズのストリップ状に切断します。その後、クリーンルーム内で、チャネル、ブランクのPDMSストリップ、およびガラススライドをプラズマ酸化装置にセットします。

材料を40 Wの出力で40秒間、酸素プラズマにさらします。次に、チャネルピースとガラススライドをブランクストリップの両面に貼り付け、接着が完了するまで材料を置いておきます。2時間後、120 °Cに設定したホットプレート上で、PDMSプリポリマーを用いて、長さ6インチ以上のプラスチックチューブ2本をパンチ済みのリザーバーに取り付けます。

先にPDMSを硬化させてから、次の手順に進みます。次に、シリンジを取り付けられるように、チューブの片端に流体用プラスチックコネクタを固定します。続いて、入口チューブとチャネルの間にある各リザーバーに、3インチの22ゲージ絶縁銅線を挿入し、さらにPDMSプレポリマーを用いて電線を固定します。

まず、組み立てたばかりのマイクロチャネルを、モニターに接続されたカメラ付き顕微鏡のXY移動ステージに設置し、マイクロチャネルの電極に電源を接続します。マイクロチャネルの抵抗値が約0.6 mega ohmsであることを確認した後、マイクロチャネルの出口チューブを使い捨てシリンジに取り付けます。次に、入口チューブの先端を、M nine 生理緩衝液に懸濁させた線虫溶液に浸します。

シリンジ内部に負圧をかけ、液体をチャネル内に吸引します。入口チューブと出口チューブの両方が満たされたら、シリンジと静水圧装置を取り外します。チューブの相対的な高さを調整して流量を制御し、チャネルの中央に線虫を配置します。

次に、マイクロチャネル内の流れをゼロに維持するため、両方のチューブを同じ高さで水平に置きます。電気走性実験中に線虫のサンプルを交換する場合、両方の流入チューブを同じ高さに揃えてもまだ流れがある場合は、チューブ同士の相対的な高さを微調整してください。流れが本当にゼロであるか判断がつかない場合は、電場の極性を変えて線虫の移動方向を反転させ、旋回時の線虫の線速度を評価することで確認できます。

次に、電源を適切な電圧に設定します。電気信号を作動させ、1分間の事前曝露を行い、虫を電場に順応させます。1分が経過すると、虫が陰極に向かって移動し始めます。記録を開始してください。

実験終了後、チャネルからすべての液体と線虫を取り除きます。チャンバーを脱イオン水で洗浄し、デバイスを125 °Cのホットプレートに置いて乾燥させます。この代表的なビデオでは、野生型の若成体線虫の電気軸および、線虫トラッキングソフトウェアによる位置と速度の出力結果が示されています。

ビデオは、右側にカソードがある状態で始まります。ガラスピペットが現れることは反転が差し迫っていることを示し、その後のピペットの除去が合図となります。ここでの反転の瞬間、ビデオ内の線虫に対するカスタム線虫トラッキングプログラムから出力された、時間に対する位置および時間に対する瞬時速度のデータが表示されます。プログラムは、位置-時間曲線から速度曲線を算出しました。

この箱ひげ図は、野生型およびトランスジェニック動物の一群から得られた電気走性速度のデータを示しています。Tトランスジェニック動物は、UNC 54ミオシン重鎖遺伝子プロモーターの制御下で、体壁筋肉にヒトα-シヌクレイン遺伝子を発現させており、これによりタンパク質凝集が引き起こされ、野生型動物よりも遅い電気走性反応として現れます。習熟すれば、電気走性実験を適切に実施することで、1時間あたり20匹以上の線虫をアッセイすることが可能です。

この手順を実施する際は、運動能または電気感覚に影響を与える変異や化学物質のみが、電気走性アッセイで検出可能な表現型を示すことを覚えておくことが重要です。このビデオを視聴することで、シリコーンのパターニング方法、マイクロ流路チャネルの組み立て方法、および電気走性アッセイを用いたC. elegansの運動能の解析方法について、十分に理解できるはずです。