Name: マイクロ流体デバイスを用いた機械的刺激と線虫の高解像度イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学ぶマイクロ流体デバイスを用いた機械的刺激とC. elegansの高解像度イメージング手法。神経応答を非侵襲的に測定し、メカノバイオロジー研究に貢献します。

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我々 はサンドラ N. Manosalvas-Kjono、プリム Ladpli に感謝、ファラー Memon、Divya Gopisetty、ヴェロニカ ・ サンチェスのサポート デバイス設計、変異動物の世代。この研究はサポートされている NIH 助成金 R01EB006745 (BLP)、(MBG) に R01NS092099、K99NS089942 (MK) に、(ALN) を F31NS100318、受信した欧州連合のホライゾン 2020年研究と技術革新の下で欧州研究会議 (ERC) からの資金調達のプログラム (付与契約号 715243 MK)。

<ol><li>Eastwood, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+mechanics+govern+the+rapidly+adapting+and+symmetrical+response+to+touch%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).</li>
<li>Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeling+Force%3A+Physical+and+Physiological+Principles+Enabling+Sensory+Mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).</li>
<li>Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+systems+biology+of+C.+elegans+touch+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation.</a> BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).</li>
<li>Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+the+sense+of+touch+by+%CE%B2-spectrin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of the sense of touch by β-spectrin.</a> Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).</li>
<li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+forces+govern+germ-layer+organization+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish.</a> Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).</li>
<li>Gaub, B. M., Müller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+of+Piezo1+receptors+depends+on+extracellular+matrix+proteins+and+directionality+of+force%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force.</a> Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).</li>
<li>Geffeney, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEG%2FENaC+but+not+TRP+channels+are+the+major+mechanoelectrical+transduction+channels+in+a+c.+Elegans+nociceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor.</a> Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).</li>
<li>O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MEC-4+DEG%2FENaC+channel+of+Caenorhabditis+elegans+touch+receptor+neurons+transduces+mechanical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals.</a> Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).</li>
<li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+C.+elegans+Mechanosensory+Neurons+Demonstrates+a+Specific+Role+for+the+MEC-4+Channel+in+the+Process+of+Gentle+Touch+Sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation.</a> Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).</li>
<li>Kopito, R. B., Levine, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+spatiotemporal+surveillance+of+Caenorhabditis+elegans+response+to+environmental+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues.</a> Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).</li>
<li>Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CO2+and+compressive+immobilization+of+C.+elegans+on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip.</a> Lab Chip. 9 (1), 151(2009).</li>
<li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan-on-a-chip%3A+microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans.</a> Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li>
<li>Li, S., Stone, H. a, Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+and+automatic+counting+system+for+the+study+of+C.+elegans+reproductive+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging.</a> Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).</li>
<li>Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+microfluidic+platform+for+calcium+imaging+of+chemosensory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).</li>
<li>Mishra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> J. Vis. Exp. , e50998(2014).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Krajniak, J., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+high-resolution+imaging+and+culture+of+C.+elegans+in+chip-gel+hybrid+microfluidic+device+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies.</a> Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).</li>
<li>Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+that+Contain+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Enhance+Neuronal+Cell+Mechanics+and+Touch+Sensation%5BTitle%5D)+AND+%22CellReports%22%5BJournal%5D)">Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation.</a> CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).</li>
<li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+defects+in+%CE%B2-spectrin+and+tau+sensitize+C.+elegans+axons+to+movement-induced+damage+via+torque-tension+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Genetic defects in β-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling.</a> Elife. 6 (2010), e20172(2017).</li>
<li>Arnadóttir, J., O'Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEG%2FENaC+protein+MEC-10+regulates+the+transduction+channel+complex+in+Caenorhabditis+elegans+touch+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons.</a> J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).</li>
<li>Lockhead, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5170555/">The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth.</a> Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).</li>
<li>Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O'hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEC-2+regulates+C.+elegans+DEG%2FENaC+channels+needed+for+mechanosensation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation.</a> Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).</li>
<li>Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumatic+stimulation+of+C.+elegans+mechanoreceptor+neurons+in+a+microfluidic+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap.</a> Lab Chip. , (2017).</li>
<li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+Variable+Height+Photolithography+for+Valved+Multilayer+Microfluidic+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices.</a> J. Vis. Exp. (119), e55276(2017).</li>
<li>Jenkins, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+PDMS+devices+using+SU-8+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography.</a> Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).</li>
<li>Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+microfluidic+devices+by+using+low-cost+fabrication+techniques%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review.</a> J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="https://www.fkit.unizg.hr/_download/repository/Soft_litography_Whitesides_Review__aciee98.pdf">SOFT LITHOGRAPHY.</a> Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+and+controlled+mechanical+stimulation+and+functional+imaging+in+vivo+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans.</a> Lab Chip. , (2017).</li>
<li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+molecular+solution+for+ultraviolet+light+detection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. <a target="_blank" href="http://www.biorxiv.org/content/early/2017/02/10/107318">High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo.</a> BiorXiv. , (2017).</li>
<li>Petzold, B. C., Park, S. -J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEMS-based+force-clamp+analysis+of+the+role+of+body+stiffness+in+C.+elegans+touch+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation.</a> Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).</li>
<li>Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+applied+during+classical+touch+assays+for+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 12 (5), e0178080(2017).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).</li>
<li>Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectrophoresis+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 11 (4), 599(2011).</li>
<li>Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/15/5/005">Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems.</a> J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).</li>
<li>Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worms+under+Pressure%3A+Bulk+Mechanical+Properties+of+C.+elegans+Are+Independent+of+the+Cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle.</a> Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).</li>
</ol>

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このプロトコルは、マイクロ流体チップの中に閉じ込め回虫の皮膚に正確な機械的刺激を提供する方法を示します。それは生物的質問に答えるための物理的な刺激の統合を容易にするものです、メカノバイオロジー研究生物ラボでの効率化を目指します。このメソッドは、線虫の機械刺激受容ニューロンの機能を評価するために前の試金を拡張します。以前の定量的、半定量的な手法は測定力1,34と動作35が神経活動の高分解能イメージングを統合することは困難。従って、このチップの使用は、現在のアプリケーションを拡張し、優しいタッチに必要なニューロンの刺激のためのパフォーマンスを最適化を信じる。ほぼ最大の神経応答に到達する十分に強い刺激であるリーチ 5 μ m にアクチュエータのたわみを最適化されています。わずかなバリエーションを持つこのデザインがボディ表面36を支配する PVD 受容などの過酷なタッチの受容体を刺激するためにされる可能性があります考...

タッチの感覚は、彼らの環境に関する重要な情報を持つ動物を提供します。適用された力によって、無害な楽しい、または痛みを伴う、タッチは感知されます。タッチの中に組織の変形は、最もよくイオン チャンネル受容体蛋白質を表現する皮膚に埋め込まれた特殊な受容細胞によって検出されます。タッチと痛みの間にイオン チャネル活性化への力覚のリンク手順が完全に理解されていません。さらに少ないは、皮膚組織が機械的変形、メカノレセプターがひずみの変化を検出するかどうかをフィルターか1,2,3のストレスについて知られています。一部、このギャップの理解では、生きている動物の皮の表面に細胞レベルで反応を観察しながら正確な機械的刺激を適用する適切なツールの欠如から発生します。適用し、隔離されたセル4,5で力を測定してもリビングの Piezo1 受容体を有効にして、原子間力顕微鏡を広く使用されているに対し細胞6、特に生きている動物を使用して同様の実験は、 線虫、被写体の本質的なモビリティのために悪名高く挑戦されています。この挑戦は、伝統的寒天パッド1,7,8,9の個々 の動物を固定する獣医または手術用シアノアクリ レート系接着剤を使用して回避します。このアプローチは、生産されているが、接着剤と機械的コンプライアンスの軟寒天培地表面固定化に必要なスキルに関連する制限があります。マイクロ流体戦略は、接着にリンクされている合併症のいくつかを回避する無料の代替です。
線虫は動物のサイズのために、マイクロ流体技術のためのよい適合をある完全にマップされた神経系の遺伝モデル生物です。マイクロ ベースのデバイスは高分解能イメージングと関連する神経調節刺激の配信を行いながらそれ以外の場合非常にモバイルの動物を抑制できるという利点を提供しています。マイクロ流体の助けを借りて技術、動物の生活は害10,11, 生涯12,13上行動活動の監視と高解像度を実現することがなく固定化することができます。神経活動14,15,16,17のイメージング。さらに、タッチと痛みの感覚は、生理1,8、機械式4,18,19、特徴付けることができるために必要な多くの受容ニューロン分子レベル20,21,22。
線虫 c. エレガンス6 TRNs、動物の前部 (ALML/R と AVM) を支配する 3 つのうち、3 つは動物の後部 (PLML/R と PVM) を支配するを使用してその体壁に穏やかな機械的刺激を感覚します。生化学的信号に適用された力の伝達に必要なイオン チャネル分子は TRNs8で幅広く研究されています。本稿では正確な機械力を固定化c. の elegansの皮膚に適用する研究者を可能にするマイクロ流体プラットフォーム23回虫、光イメージングによるその内部組織の変形を読みながら。明確に定義された機械的刺激を提示に加えてカルシウム トランジェントを受容ニューロン細胞レベル下の解像度で記録し、形態学的および解剖学的機能と相関できます。デバイスは、単一の動物を保持し、その皮膚 (図 1および図 2) 六つの空気圧アクチュエータのチャンネルの横にあるを示す中央トラップ チャネルで構成されます。六つのチャンネルは、各ワームの 6 TRNs に機械的刺激を提供するトラップ チャネルに沿って配置されます。これらのチャネルは、薄い PDMS のダイヤフラムがあり、外部の空気圧力源 (図 1) によって駆動することができますでトラップ室から区切られます。圧力に対する変形を校正この記事で測定を提供しています。各アクチュエータは、個別に対処し、好みの受容を促進するために使用できます。ピエゾ駆動圧力ポンプを使用して圧力を配信、任意の代替デバイスを使用できます。TRNs体内をアクティブにし、大人の線虫に機械的刺激を提供する、デバイスに大人動物の読み込み、カルシウム イメージングを実行する適切な操作装置を示す圧力プロトコルを使用できることを示す実験と結果の分析します。デバイスの作製は、2 つの主な手順で構成されています: 1) SU-8; から金型を作るフォトリソグラフィー・ 2) デバイスにする PDMS を成形します。簡潔、明瞭のために以前に公開された記事およびプロトコル24,25金型とデバイスを生成する方法について読者が呼ばれます。

<table><tbody><tr><td>Chromeマスク</td><td>Compugraphics(http://www.compugraphics-photomasks.com/)</td><td></td><td>5 ''、AutoCADで設計(Autodesk、Inc.)</td></tr><tr><td>クロームマスク</td><td>ミタニ精密 (http://www.mitani-micro.co.jp/en/)</td><td></td><td>5'', AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>クロームマスク</td><td>黒田電機(http://www.kuroda-electric.eu/</td><td></td> <td>5インチ、AutoCADで設計(Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>4インチ シリコンウェーハ (B-test)</td><td>スタンフォードナノファブリケーション施設</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2002</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スピンコーター</td><td>ローレルテクノロジー</td>ズ <td>WS-400BZ-6NPP/LITE</td><td></td></tr><tr><td>露光タイマー</td><td>Optical Associates, Inc</td><td>OAI 150</td><td></td></tr><tr><td>照明コントローラー</td><td>Optical Associates, Inc</td><td>2105C2</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A426F-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-4</td><td></td></tr><tr><td>トリクロロメチルシラン (TCMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92361-500ML</td><td>注意: TCMS は有毒で水に反応する</td></tr><tr><td>Sylgard 184 エラストマー キット</td><td>ダウCorning</td><td></td><td>PDMS prepolymer</td></tr><tr><td>Biopsy punch, 1 mm</td><td>VWR</td><td>95039-090</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen Plasma Asher</td><td>Branson/IPC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm Long); ゲージサイズ 23TW</td><td>New England Small Tube Corporation</td><td>NE-1300-01</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene syringe filter, 0.22 &mu;m</td><td>Thermo Scientific</td><td>725-2520</td><td>ですべての溶液をろ過すると、小さな粒子がチップを詰まらせるポリエチレン</td></tr><tr><td>チューブ、外径 0.9652 mm、内径 0.5842 mm</td><td>Solomon Scientific</td><td>BPE-T50</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ、1 ml</td><td>BD Scientific</td><td>309628</td><td>(ワーム捕捉および放出</td></tr><tr><td>用)、20 ml</td><td>BD Scientific</td><td>309661</td> (<td>重力ベースのフロー用</td></tr>) <tr><td>Gilson Minipuls 3、蠕動運動ギ</td><td>ルソン</td><td></td>をポンプで送り、チップマイクロ流体フローコントローラー<td>から溶液とワームを吸い込み</td></tr>ます<tr><td>。800 kPa 圧力チャネル</td><td>Elveflow</td><td>OB1 MK3</td><td>圧力供給</td></tr><tr><td>耐水性透明ポリウレタンチューブ、内径 4 mm および 外径 6 mm</td><td>McMaster-Carr</td><td>5195 T52</td><td>ハウスエアから圧力ポンプへの接続</td></tr><tr><td>耐水性透明ポリウレタンチューブ、内径 2.6mm および 外径</td><td>4mm McMaster-Carr</td><td>5195 T51</td><td>圧力ポンプを小型チューブに接続</td></tr> 空気<tr><td>用</td> <td>Push-to-Connect チューブ継手McMaster-Carr</td><td>5111K468</td><td>メートル法 - 6 mm用インペリアルコンバータ</td></tr><tr><td>ストレートコネクタ&times; 1/4&Prime;チューブ外径</td><td>McMaster-Carr</td><td>5779 K258</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI 4000 B 顕微鏡システム</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>63&times;/1.32 NA HCX PL APO オイル対物レンズ</td><td>ライカ</td><td>506081</td><td></td></tr><tr><td>浜松 オルカフラッシュ 4.0LT デジタル CMOS カメラ</td><td>浜松</td><td>C11440-42U</td><td></td></tr><tr><td>ルーメンコール Spectra X ライトエンジン</td><td>ルーメンコール</td><td></td><td>シアンとグリーン/イエローの光源付き</td></tr><tr><td>顕微鏡で</td><td>励起ビームスプリ</td><td>ッターChroma</td><td>59022bs</td></tr>浜<tr><td>松W-view Gemini画像分割光学系</td><td>浜松</td><td>A12801-01</td><td>は、緑と赤の発光を分割し、カメラチップ上の異なる領域に投影</td></tr>します <tr>画像<td>スプリッター</td>で<td>発光ビームスプリ</td><td>ッターChroma</td><td>T570lpxr</td></tr><tr><td>発光フィルターGCamp6s</td><td>Chroma</td><td>ET525 / 50m</td><td>画像スプリッターの</td></tr><tr><td>発光フィルターmCherryChroma</td><td></td><td>ET632 / 60m</td>の<td>画像スプリッターで</td></tr></tbody></table>

マイクロ流体デバイスを用いた機械的刺激と線虫の高解像度イメージング

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

1 つの中央目標メカノバイオロジーの蛋白質および細胞のメカニカル ストレスの相互影響を理解することです。その重要性にもかかわらず機械的ストレスの細胞機能に及ぼす影響はまだよくわかっていません。いくつかのツールは、組織や細胞の同時変形、生きている動物の細胞の活動のイメージングと線虫など、それ以外の場合高度なモバイル モデル生物運動の効率的な制限を有効にするためにこの知識のギャップが存在する部分には、線虫。線虫 c. エレガンスのサイズが小さいマイクロ ベースの研究装置に優れた一致のため、マイクロ流体デバイスを用いた固定化のためのソリューションを提示されています。これらのデバイスは高分解能イメージングを使用、動物はポリジメチルシロキサン (PDMS)、ガラス、機械的な力や電気生理学的記録の配信のための物理的なアクセスを制限することに完全に包まれています。最近では、高解像度蛍光顕微鏡と互換性のあるトラップ デザインと空気圧アクチュエータを統合したデバイスを作成しました。作動チャネルは、薄い PDMS ダイヤフラムでワーム トラップ チャネルから区切られます。この振動板は、外部ソースからの圧力を適用することによってワームの側面にそらされます。デバイスは、個々 の機械受容ニューロンをターゲットできます。これらのニューロンの活性化でイメージはカルシウムの遺伝子にコードされた指標と高解像度。この記事は、接触受容体ニューロン (TRNs) でカルシウムに敏感なアクティビティ インジケーター (GCaMP6s) を表現する線虫の系統を用いた一般的な方法を示します。メソッドはしかし、プローブと TRNs にもカルシウム センサーに限定ではない、他の機械的に敏感な細胞またはセンサーに拡張できます。

SU 8 リソグラフィとチップ接合 リソグラフィ プロトコルと PDMS 成形標準的な手順に従います。詳細は23,24,25,26他の場所で見つけることができます。PDMS は硬化後問題なくウェーハをはがします必要があります。PDMS 剥離中に SU 8 機能をはぎ取る、SU 8 接着層または、シリル化された十分なないです。場合はガラス coverslips と PDMS チップのプラズマ活性化は不十分である、弱い結合はトラップ チャネルまたはパフォーマンスの低下および刺激の不在に終って空気圧アクチュエータから漏れにつながります。液漏れが明らかの場合、チップは使用できません。
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メカノバイオロジー研究のための新しいツールはどのように機械的ストレスを理解に必要な生化学的経路を活性化し、生体反応を引き出します。ここでは、細胞応答の高分解能イメージングをできるようにマイクロ トラップで固定化動物の選択的な機械的刺激のための新しい方法を紹介します。

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

この手法の全体的な目標は、圧力アクチュエータを備えたマイクロ流体チップセットアップを使用して、線虫とそのニューロンが外部の機械的刺激にどのように応答するかを測定することです。この方法は、細胞、組織、動物が機械的刺激にどのように反応するかなど、メカノバイオロジーと感覚生物学の分野における重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、非侵襲的な方法でワームの可動性を十分に低下させ、高解像度のイメージングを可能にしながら、機械的刺激のためにワームのキューティクルにアクセスできることです。この方法は、機械的な手がかりが発達に与える影響を研究するためにも使用できます。これは、ex vivo organ exponseやC.Elegansと同程度のサイズの他の動物など、他のシステムにも適用できます。GCaMPとRFPを同時に励起するための顕微鏡システムをセットアップします。1つのオプションは、シアンと黄色の光のみを透過する目立たない光源です。視聴には、10倍対物レンズと高倍率の対物レンズを使用してください。また、デジタルカメラでパソコンに画像を送信してください。次に、蛍光キューブを含め、必要に応じて励起フィルターを含めます。シアンと黄色の光を反射し、緑と赤の光を透過するダイクロイックミラーをキューブに追加します。570ナノメートルのカットオフを持つロングパスダイクロイックミラーを備えたビームスプリッターを設置。また、525ナノメートルの幅で525ナノメートルの緑色光用のバンドパス発光フィルターと、632ナノメートルで60ナノメートルの幅で赤色光用のバンドパス発光フィルターを提供します。両方のビームをカメラの視野に投影します。緑の部分が画面の上半分に投影され、赤い部分が下部に投影されていることを確認してください。常に1か月未満のマイクロ流体チップを使用してください。セットアップには、まず重力流リザーバーにろ過されたM9をロードします。リザーバーをチップの約60センチメートル上に置き、チップ出口に接続します。次に、もう一方の出口を2つの入力を持つ廃棄物コンテナに接続し、廃棄物コンテナの2番目の入力を蠕動ポンプに接続します。すべての接続をポリエチレンチューブで行います。次に、両端に金属製のチューブコネクタが付いた長さ50mmの相互接続を組み立てます。6つの作動フィンガーのそれぞれに圧入して相互接続し、ウォームインレットに取り付けます。次に、チップを光学系の下に配置します。PDMSは繰り返し操作するとすぐに摩耗するため、インターコネクトはチップに接続したままにしてください。ダイヤフラムの良好な色作動を確保するためには、PDMSアクチュエータとチップをエアリザーバに接続するチューブが適切に密閉されていることが重要です。動物をロードする前に、マイクロ流体チップの圧力損失を確認してください。ダイヤフラムのたわみを測定するには、目的の圧力で数回の作動サイクルを実行します。次に、定量的な値と理論的な予測を比較します。測定値が予想どおりでない場合は、チューブまたはチューブコネクタに漏れがないか確認してください。また、PDMSは、ベースポリマーと硬化剤の代替比率により弾性が異なる場合や、PDの質量が古くて過度に架橋されている場合もあります。2012年からのPorta-de-la-Rivaとその会社がJoveの出版物で説明しているように、年齢同期した若い大人または大人の初日のC.elegansを準備しました。さて、2〜5人の若者または1日齢の雌雄同体を選びます。正しいサイズの動物を選ぶことが重要です。小動物が水路に引っかからず、大きすぎる動物は取り除くのが難しく、デバイスを詰まらせる可能性があります。摘み取ったワームをろ過されたM9の滴で引き抜きます。次に、シリンジ本体自体に引き込まずに、1ミリリットルのシリンジを使用してチューブの長さに引き込みます。次に、チューブをチップのウォーム入口で相互接続に接続します。次に、リザーバーへのバルブを開き、ポンプを始動することにより、重力の流れを作動させます。次に、トラップチャネルを4倍の倍率で観察し、動物を装置にそっと押し込みます。動物を待合室に積み込んだ後、プランジャーを使用して、そのうちの1つをトラップチャネルの前面にゆっくりと流し、ヘッドがチャネルの先細形状に入るようにします。ワームが鼻から体の端近くまでのチャネルの断面全体を埋めていない場合は、ワームを取り除きます。多くの場合、小さすぎるワームはトラップされずにチップを直進します。トラップチャネルに引っかかった動物を取り除く必要がある場合は、線虫がチャンネルから消えるまでシリンジのプランジャーを押してから、新しい線虫を装填します。ワームが適切にロードされたら、蛍光モードに切り替えて倍率を上げます。飽和を防ぐために、必ず蛍光強度に基づいて励起強度を調整してください。対象のニューロンの神経突起が、アクチュエータの1つの横隔膜を横切っているかどうかを確認します。そのアクチュエーターは、ニューロンの細胞体の前方にもなければなりません。そうでない場合は、プランジャーを引っ張ったり押したりして、動物の位置を調整します。それでも問題が解決しない場合は、ワームを取り外して新しいワームをロードします。また、ニューロンの周囲に自家蛍光がある場合は、線虫を交換してください。線虫が適切にロードされたら、目的のニューロンの細胞体に焦点を合わせ、チップがその前面にあるアクチュエータを特定し、関連する相互接続を使用してこのアクチュエータをプログラム可能な圧力ポンプに接続します。実験でアクチュエータとニューロンの間の距離を測定する必要がある場合は、チャネル壁が画像の上下の端に平行になるように、両方を視野に収めます。次に、プログラム可能な圧力ポンプを使用して圧力プロトコルを定義します。ベースラインを定義するには、常に 0 キロパスカルで少なくとも 50 枚の画像を撮影することから始めます。次に、刺激波形と圧力をプログラムします。次に、イメージングおよび圧力プロトコルを実行します。記録中、対象のニューロンは 10 平方ピクセルの領域で最も明るいスポットである必要があります。2 つの連続した画像で 10 ピクセルを超えて移動することはできず、視野内に留まる必要があります。記録中に、圧力とアクチュエータが変化すると、蛍光強度の変化が観察される場合があります。これは、ニューロンの刺激が成功したことを示しています。刺激の合間には、0キロパスカルの一定圧力で10秒間を含む。視野内の複数のニューロンからの信号を同時に記録することは、記録全体を通して少なくとも10ピクセル離れている限り可能です。さらなる研究のためにワームを保持するには、チップの出口を重力流と廃棄物容器に向けて切断します。次に、ワーム全体がトラップチャネルを通って流路に押し込まれるまでプランジャーを静かに押し、動物がチップの外側の液滴に現れるまでプランジャーを押し続けます。次に、シリンジをチューブから外し、液滴中のワームを寒天プレートに吸引します。チャネル内のワームを取り外して犠牲にするには、ワーム全体がトラップチャネルを通ってフローチャネルに押し込まれるまでプランジャーを押します。その後、ワームはチップから流出して廃棄物容器に流れ込みます。マイクロ流体チップをセットした後、ダイヤフラムのたわみをテストしました。測定値は、450キロパスカルの圧力で1ミクロンを超えないわずかな変動で再現可能でした。チップの入口に線虫を挿入した後、捕獲チャネル内の1匹の動物の皮膚を6つのアクチュエータに提示しました。この設計では、通常、PLMニューロンを完全に固定することはできないため、横方向および垂直方向に自由に移動できます。PLMニューロンの活性化を成功させることは可能ですが、それらからのカルシウム過渡現象を記録することは、尾の動きのために困難です。所定の位置に着くと、動物は、6つのTRNのそれぞれに機械的刺激を与えるように配置された6つのアクチュエータのうちの1つを使用して刺激されました。3つの異なる2秒の刺激のうちの1つが提示されました。275キロパスカルでのホールド、275キロパスカルへのランプ、または75キロパスカルの10ヘルツサインと275キロパスカルステップの重ね合わせからなるバズ。圧力ランプと圧力ステップは、刺激が400キロパスカルを超える圧力に達した場合にのみTRNを活性化しましたが、バズ刺激はすべてのTRNを強力に活性化しました。一度習得すると、この技術はワームごとに5分以内に実行できます。チップとカバースリップの間、またはチップとインターコネクタの間のシールが不十分な場合、デバイスが漏れて故障することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、侵害受容器の機械的応答を特徴付けるために、電圧イメージングやさまざまなニューロンへの機械的刺激の標的送達などの他の方法を実行できます。また、この手順に従って動物を回復させることができるため、この技術は、機械的刺激に対する応答に欠陥のある突然変異体をスクリーニングするために使用できます。圧縮ガスや化学薬品の取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。これらの危険を回避するために、必要に応じて個人用保護具を着用したり、ドラフトで作業したりするなどの予防策を講じてください。

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神経科学

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