マイクロ流体デバイスを用いた機械的刺激と線虫の高解像度イメージング
February 19th, 2018
メカノバイオロジー研究のための新しいツールはどのように機械的ストレスを理解に必要な生化学的経路を活性化し、生体反応を引き出します。ここでは、細胞応答の高分解能イメージングをできるようにマイクロ トラップで固定化動物の選択的な機械的刺激のための新しい方法を紹介します。
この手法の全体的な目標は、圧力アクチュエータを備えたマイクロ流体チップセットアップを使用して、線虫とそのニューロンが外部の機械的刺激にどのように応答するかを測定することです。この方法は、細胞、組織、動物が機械的刺激にどのように反応するかなど、メカノバイオロジーと感覚生物学の分野における重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、非侵襲的な方法でワームの可動性を十分に低下させ、高解像度のイメージングを可能にしながら、機械的刺激のためにワームのキューティクルにアクセスできることです。
この方法は、機械的な手がかりが発達に与える影響を研究するためにも使用できます。これは、ex vivo organ exponseやC.Elegansと同程度のサイズの他の動物など、他のシステムにも適用できます。GCaMPとRFPを同時に励起するための顕微鏡システムをセットアップします。
1つのオプションは、シアンと黄色の光のみを透過する目立たない光源です。視聴には、10倍対物レンズと高倍率の対物レンズを使用してください。また、デジタルカメラでパソコンに画像を送信してください。
次に、蛍光キューブを含め、必要に応じて励起フィルターを含めます。シアンと黄色の光を反射し、緑と赤の光を透過するダイクロイックミラーをキューブに追加します。570ナノメートルのカットオフを持つロングパスダイクロイックミラーを備えたビームスプリッターを設置。
また、525ナノメートルの幅で525ナノメートルの緑色光用のバンドパス発光フィルターと、632ナノメートルで60ナノメートルの幅で赤色光用のバンドパス発光フィルターを提供します。両方のビームをカメラの視野に投影します。緑の部分が画面の上半分に投影され、赤い部分が下部に投影されていることを確認してください。
常に1か月未満のマイクロ流体チップを使用してください。セットアップには、まず重力流リザーバーにろ過されたM9をロードします。リザーバーをチップの約60センチメートル上に置き、チップ出口に接続します。次に、もう一方の出口を2つの入力を持つ廃棄物コンテナに接続し、廃棄物コンテナの2番目の入力を蠕動ポンプに接続します。
すべての接続をポリエチレンチューブで行います。次に、両端に金属製のチューブコネクタが付いた長さ50mmの相互接続を組み立てます。6つの作動フィンガーのそれぞれに圧入して相互接続し、ウォームインレットに取り付けます。
次に、チップを光学系の下に配置します。PDMSは繰り返し操作するとすぐに摩耗するため、インターコネクトはチップに接続したままにしてください。ダイヤフラムの良好な色作動を確保するためには、PDMSアクチュエータとチップをエアリザーバに接続するチューブが適切に密閉されていることが重要です。
動物をロードする前に、マイクロ流体チップの圧力損失を確認してください。ダイヤフラムのたわみを測定するには、目的の圧力で数回の作動サイクルを実行します。次に、定量的な値と理論的な予測を比較します。
測定値が予想どおりでない場合は、チューブまたはチューブコネクタに漏れがないか確認してください。また、PDMSは、ベースポリマーと硬化剤の代替比率により弾性が異なる場合や、PDの質量が古くて過度に架橋されている場合もあります。2012年からのPorta-de-la-Rivaとその会社がJoveの出版物で説明しているように、年齢同期した若い大人または大人の初日のC.elegansを準備しました。
さて、2〜5人の若者または1日齢の雌雄同体を選びます。正しいサイズの動物を選ぶことが重要です。小動物が水路に引っかからず、大きすぎる動物は取り除くのが難しく、デバイスを詰まらせる可能性があります。
摘み取ったワームをろ過されたM9の滴で引き抜きます。次に、シリンジ本体自体に引き込まずに、1ミリリットルのシリンジを使用してチューブの長さに引き込みます。次に、チューブをチップのウォーム入口で相互接続に接続します。次に、リザーバーへのバルブを開き、ポンプを始動することにより、重力の流れを作動させます。
次に、トラップチャネルを4倍の倍率で観察し、動物を装置にそっと押し込みます。動物を待合室に積み込んだ後、プランジャーを使用して、そのうちの1つをトラップチャネルの前面にゆっくりと流し、ヘッドがチャネルの先細形状に入るようにします。ワームが鼻から体の端近くまでのチャネルの断面全体を埋めていない場合は、ワームを取り除きます。
多くの場合、小さすぎるワームはトラップされずにチップを直進します。トラップチャネルに引っかかった動物を取り除く必要がある場合は、線虫がチャンネルから消えるまでシリンジのプランジャーを押してから、新しい線虫を装填します。ワームが適切にロードされたら、蛍光モードに切り替えて倍率を上げます。
飽和を防ぐために、必ず蛍光強度に基づいて励起強度を調整してください。対象のニューロンの神経突起が、アクチュエータの1つの横隔膜を横切っているかどうかを確認します。そのアクチュエーターは、ニューロンの細胞体の前方にもなければなりません。
そうでない場合は、プランジャーを引っ張ったり押したりして、動物の位置を調整します。それでも問題が解決しない場合は、ワームを取り外して新しいワームをロードします。また、ニューロンの周囲に自家蛍光がある場合は、線虫を交換してください。
線虫が適切にロードされたら、目的のニューロンの細胞体に焦点を合わせ、チップがその前面にあるアクチュエータを特定し、関連する相互接続を使用してこのアクチュエータをプログラム可能な圧力ポンプに接続します。実験でアクチュエータとニューロンの間の距離を測定する必要がある場合は、チャネル壁が画像の上下の端に平行になるように、両方を視野に収めます。次に、プログラム可能な圧力ポンプを使用して圧力プロトコルを定義します。
ベースラインを定義するには、常に 0 キロパスカルで少なくとも 50 枚の画像を撮影することから始めます。次に、刺激波形と圧力をプログラムします。次に、イメージングおよび圧力プロトコルを実行します。
記録中、対象のニューロンは 10 平方ピクセルの領域で最も明るいスポットである必要があります。2 つの連続した画像で 10 ピクセルを超えて移動することはできず、視野内に留まる必要があります。記録中に、圧力とアクチュエータが変化すると、蛍光強度の変化が観察される場合があります。
これは、ニューロンの刺激が成功したことを示しています。刺激の合間には、0キロパスカルの一定圧力で10秒間を含む。視野内の複数のニューロンからの信号を同時に記録することは、記録全体を通して少なくとも10ピクセル離れている限り可能です。
さらなる研究のためにワームを保持するには、チップの出口を重力流と廃棄物容器に向けて切断します。次に、ワーム全体がトラップチャネルを通って流路に押し込まれるまでプランジャーを静かに押し、動物がチップの外側の液滴に現れるまでプランジャーを押し続けます。次に、シリンジをチューブから外し、液滴中のワームを寒天プレートに吸引します。
チャネル内のワームを取り外して犠牲にするには、ワーム全体がトラップチャネルを通ってフローチャネルに押し込まれるまでプランジャーを押します。その後、ワームはチップから流出して廃棄物容器に流れ込みます。マイクロ流体チップをセットした後、ダイヤフラムのたわみをテストしました。
測定値は、450キロパスカルの圧力で1ミクロンを超えないわずかな変動で再現可能でした。チップの入口に線虫を挿入した後、捕獲チャネル内の1匹の動物の皮膚を6つのアクチュエータに提示しました。この設計では、通常、PLMニューロンを完全に固定することはできないため、横方向および垂直方向に自由に移動できます。
PLMニューロンの活性化を成功させることは可能ですが、それらからのカルシウム過渡現象を記録することは、尾の動きのために困難です。所定の位置に着くと、動物は、6つのTRNのそれぞれに機械的刺激を与えるように配置された6つのアクチュエータのうちの1つを使用して刺激されました。3つの異なる2秒の刺激のうちの1つが提示されました。
275キロパスカルでのホールド、275キロパスカルへのランプ、または75キロパスカルの10ヘルツサインと275キロパスカルステップの重ね合わせからなるバズ。圧力ランプと圧力ステップは、刺激が400キロパスカルを超える圧力に達した場合にのみTRNを活性化しましたが、バズ刺激はすべてのTRNを強力に活性化しました。
一度習得すると、この技術はワームごとに5分以内に実行できます。チップとカバースリップの間、またはチップとインターコネクタの間のシールが不十分な場合、デバイスが漏れて故障することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、侵害受容器の機械的応答を特徴付けるために、電圧イメージングやさまざまなニューロンへの機械的刺激の標的送達などの他の方法を実行できます。
また、この手順に従って動物を回復させることができるため、この技術は、機械的刺激に対する応答に欠陥のある突然変異体をスクリーニングするために使用できます。圧縮ガスや化学薬品の取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。これらの危険を回避するために、必要に応じて個人用保護具を着用したり、ドラフトで作業したりするなどの予防策を講じてください。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
この研究では、マイクロ流体トラップを使用して固定化された線虫を選択的に機械的に刺激する新しい方法を提案し、細胞応答の高解像度イメージングを可能にします。主な焦点は、メカノバイオロジーと感覚生物学の文脈で、機械的ストレスが神経応答と広範な生物学的プロセスにどのように影響するかを理解することです。
主要な研究構成要素
科学の分野
- メカノバイオロジー
- 感覚生物学
- 神経科学
背景
- 機械的ストレスは生化学的経路の活性化に重要です。
- 機械的刺激に対する神経応答の理解は、メカノバイオロジーの洞察に不可欠です。
- この方法は、生物学的被験体の非侵襲的かつ効果的な固定化を可能にします。
- 高解像度イメージングは、これらの応答の理解を向上させることができます。
研究の目的
- 機械的刺激に対する線虫と神経応答を測定する技術を開発すること。
- メカノバイオロジーにおいて、動物が機械的刺激にどのように反応するかを探索すること。
- 機械的キューが生物体の発生に与える影響についての洞察を提供すること。
使用した方法
- 刺激のための圧力アクチュエータを備えたマイクロ流体チップセットアップを利用しました。
- 生物学的モデルには線虫C. elegansが含まれ、その神経の固定化とイメージングに焦点を当てました。
- 蛍光マーカーの同時励起のための顕微鏡システムの精密なセットアップを含みました。
- 実験ステップには、線虫をトラップチャネルにロードし、高解像度イメージングプロトコルを実行することが含まれました。
主要な結果
- この技術は、適用された機械的刺激に対する神経応答を評価するための信頼性の高い方法を提供しました。
- 高解像度イメージングは、固定化された線虫内の機械的刺激と生物学的応答の関係を明らかにしました。
- 生物の完全性や移動性を損なうことなく、重要な神経行動の観察を可能にしました。
- 機械的に誘発された神経興奮性やその他の生理学的パラメータの変化の評価を促進しました。
結論
- この方法は、機械的ストレスに対する神経応答の高解像度イメージングを可能にすることで、メカノバイオロジーの研究を進展させます。
- 生物のメカノ感受性に関する重要な洞察を提供し、他の類似の生物学的モデルにも適応できます。
- 全体として、これらの発見は神経メカニズムと発生生物学における潜在的な意味についての理解を深めることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This microfluidic technique enables precise mechanical stimulation of C. elegans neurons while maintaining high-resolution imaging, addressing a key gap in mechanobiology toolkits for live-animal studies. By combining non-invasive immobilization with targeted force application, it supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in sensory biology and neuronal pathway analysis. The approach enhances predictive confidence in linking mechanical cues to cellular responses, informing go/no-go decisions in preclinical target assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mechanosensitive neurons to validate therapeutic hypotheses about force-sensitive pathways.
- Operational Value: Provides reproducible, quantitative calcium imaging readouts to clarify target engagement under controlled mechanical stress.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by isolating neuronal responses to defined pressure stimuli, reducing ambiguity in target mechanism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated neuronal activity assays for downstream compound screening in mechanosensation pathways.
- Operational Value: Delivers standardized, high-resolution fluorescence outputs enabling scalable, reproducible compound evaluation.
- Scientific Value: Facilitates assay readiness for identifying modulators of neuronal excitability in response to mechanical cues.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling neuronal mechanotransduction in a genetically tractable organism.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation via consistent, quantifiable neuronal activity measurements.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insights into sensory pathway modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of mechanosensitive targets prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking through precise stimulation of defined neuronal populations.
- Screening: Delivers assay readiness via standardized immobilization and high-resolution imaging of calcium transients.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence measurements and stimulus-response correlations to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through conserved neuronal mechanosensitivity mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for mechanostimulation across multiple neuronal targets and sensory modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in force-sensing pathways.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through microfluidic chip design and pressure-controlled actuation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early de-risking of mechanosensitive targets, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing quantitative data on neuronal response thresholds to mechanical stimuli.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling, pressure actuation systems, and fluorescence microscopy.
- Depends on instrumentation including programmable pressure pumps, high-speed cameras, and compatible microscopy setups.
- Necessitates cross-team standardization of chip preparation, worm loading protocols, and pressure stimulus waveforms.
- Involves adaptation considerations for different neuronal targets, sensor types, and stimulus paradigms beyond touch receptor neurons.
- Includes practical limitations such as chip aging effects, PDMS elasticity variability, and size-dependent worm trapping efficiency.
